通过靶向裂解营养细胞从环境样本中物理分离芽孢

本实验的总体目标是从复杂的微生物群落样品（如沉积物）中分离出细菌内生孢子。该方法有助于解答微生物学领域中关于自然样品内生孢子存在性与丰度的关键问题。其原理基于内生孢子与营养细胞在化学试剂和热处理耐受性上的差异。该技术的主要优势在于对内生孢子无破坏性，因此可将其用于后续实验，如培养、定量和代谢检测。

尽管本方法的设计初衷是用于研究形成内生孢子的细菌的生态学，但它也可应用于外空生物学或食品工业等领域，在这些领域中，孢子可能具有有益或有害的作用。根据文本方案准备溶液和设备后，在经紫外线灭菌的生物安全柜内，使用经乙醇火焰灭菌的金属铲勺将三克沉积物样品加入已预先称重的无菌50毫升离心管中。使用无菌的刻度滴定管，向样品中加入15毫升无菌过滤的1%六偏磷酸钠（sodium hexametaphosphate, SHMP）溶液。

使用液体分散器或匀浆器以及无菌分散转子，以17,500 RPM的速度对样品匀浆1分钟。让样品静置2分钟，然后重复匀浆过程。再让样品静置10分钟，使最重的颗粒沉降。

将含有细胞生物量的上清液转移至一个干净的50毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。向已沉淀的菌体中加入另一份15毫升的SHMP溶液，再次进行匀浆处理，然后收集上清液并与第一次的上清液合并。将样品在20 × g条件下离心1分钟，随后将上清液转移至新的50毫升离心管中，弃去沉淀。

按照文本方案准备好滤膜装置和真空泵后，使用乙醇火焰对镊子进行灭菌，然后将无菌硝酸纤维素膜放入滤膜装置中。将刚制备的上清液样品的一半加入到膜过滤装置中，并使用真空泵将细胞收集到膜上。当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵。

使用灭菌镊子小心取出滤膜，并将其放入无菌培养皿中。用新的无菌滤膜对剩余一半溶液重复过滤操作。为了将刚收集的生物量中的内生孢子与营养细胞分离，如果滤膜曾被冷冻，请先将其解冻，然后使用经乙醇火焰灭菌的剪刀将滤膜剪成较小的片段。

将膜片转移至无菌的2毫升离心管中，加入900微升1X TE缓冲液。通过涡旋充分混匀，以使生物量从膜上释放。在65摄氏度、80转/分钟条件下孵育10分钟。

然后，将离心管从培养箱中取出，静置冷却15分钟。加入100微升新鲜配制的溶菌酶，使其终浓度为2毫克/毫升，并将样品在37摄氏度、80转/分钟条件下孵育60分钟，以裂解营养细胞。裂解完成后，向样品中加入250微升3摩尔/升氢氧化钠溶液和250微升6% SDS溶液。

在室温、80 RPM条件下孵育60分钟。接着，准备一个可容纳25毫米直径滤膜的无菌过滤装置，并通过高压灭菌进行灭菌。待过滤装置冷却后，将一张直径25毫米、孔径0.2微米的硝酸纤维素膜放置其上。

将样品加入膜上，使用真空泵过滤液体，使芽孢截留在膜上，而营养细胞成分则通过膜。为洗去残留的去污剂，向膜上加入2毫升无菌生理溶液，并开启真空泵。当液体完全滤过后，关闭真空泵，并将膜保留在过滤装置上。

在膜上直接进行DNase处理时，向膜上加入450微升无菌水、50微升1X DNase反应缓冲液和0.5微升DNase酶，在约25°C下静置15分钟。先前由裂解细胞释放的胞外DNA被酶解后洗去。这可确保最终的芽孢制备物不含外源DNA，这对于分子分析等下游分析至关重要。

需要注意滤器装置不应有泄漏，且样品不能干燥。孵育结束后，加入一毫升生理溶液，启动泵以冲洗掉样品上残留的酶。使用无菌镊子将含有内生孢子的滤膜转移至无菌培养皿中。

根据文本方案分析样品。本视频中展示的针对营养细胞裂解的方案可获得纯化的内生孢子样品，并显著提高形成内生孢子的厚壁菌门所占比例。在未处理样品的16S核糖体RNA基因扩增子测序中，厚壁菌门仅占序列的8%至19%。

相比之下，经过处理后，厚壁菌门在富含内生孢子的样品中分别占90.6%和83.9%。形成内生孢子的厚壁菌门的两个主要目——芽孢杆菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）得到富集，而如乳杆菌目（Lactobacillales）等不形成内生孢子的厚壁菌门则完全缺失。该处理方法的有效性也通过纯培养实验得到了验证。

对芽孢样本和营养细胞培养物进行处理，所有细胞均进行培养，并在600纳米波长下测定光密度以评估生长情况。如图所示，芽孢培养物中观察到生长，而经处理的大肠杆菌（E. coli）培养物中未观察到生长，表明营养细胞已受到不可逆损伤。一旦掌握该技术，且溶液和设备已预先准备妥当，整个操作应在约五小时内完成。

必须注意在无菌条件下操作，并确保所有溶液和设备的无菌性，以避免任何污染。按照此步骤操作后，可进一步采用培养、分离和代谢检测等其他方法，以回答有关内生孢子菌株鉴定及其代谢潜力的更多问题。此外，还可进行后续的DNA提取和宏基因组测序，以分析物种多样性及基因存在情况。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何从环境样本中分离内生孢子。请务必注意，使用十二烷基硫酸钠（SDS）等洗涤剂时可能具有极高的危险性，切记佩戴个人防护装备。