生物安全四级（A）实验室中的安全预防措施与操作规程：2. 通用规范

本实验的总体目标是通过空斑试验示例，展示在生物安全四级防护服实验室中工作的安全操作规范。该实验流程演示了在生物安全四级环境中进行标准空斑试验所需的关键改进步骤。与我共同演示该操作的是来自综合研究设施的技师 Tracey Burdette。

完成每日内部系统检查清单后，使用5%双季铵盐消毒液喷洒II级生物安全柜内部，包括视窗部分，进行清洁。然后用纸巾擦拭安全柜，注意将装有消毒液的喷雾瓶留在安全柜内，以便在实验操作过程中及完成后对戴手套的手部进行喷洒消毒。随后，使用70%乙醇溶液喷洒安全柜内部及视窗，以去除残留的黏性消毒液。

为生物安全柜准备一个废液容器。确保废液容器中双季铵盐消毒剂溶液的最终浓度不低于5%，需考虑所添加的任何其他液体的影响。将装有5%双季铵盐消毒剂溶液的废液容器放入II级生物安全柜内。

所有操作应尽可能在 II 级生物安全柜内部中央区域进行。内部中央区域是为保护操作者而设计的最有效位置。取 50 µL 病毒样本和对照病毒，分别加入含有 2% 胎牛血清的 450 µL DMEM 培养基的稀释孔中。

继续进行连续稀释，直至达到所需稀释倍数。用移液枪吸头对病毒样品至少吹打混匀五次，每次稀释后更换新的吸头。混匀时动作应缓慢，以尽量减少样品中气泡的产生。

完成稀释后，将稀释孔暂置一旁。丢弃吸头时，需从废液桶中取出消毒液冲洗每个吸头，以对吸头内外进行去污染处理，然后将吸头排入废液桶中。吸去六孔细胞培养板各孔中大部分培养基。

将100微升正确的样品加入已预先标记的板中相应的孔内，每个样品设两个复孔。操作完成后，用消毒液喷洒手套表面。使用浸有消毒液的纸巾擦拭所有板的外表面，然后用手将板放入培养箱中。

每15分钟以“8”字形摇动培养板一次，持续1小时，以确保样品在细胞表面均匀分散。向每孔加入2毫升覆盖混合液，并再次以“8”字形轻轻摇动，使覆盖层在孔表面均匀分布。将所有废弃物完全浸没于废液桶中的5%消毒液中，作用时间至少10分钟。

使用5%消毒剂溶液喷洒废液桶的内部和外部、II级生物安全柜内部、设备外表面以及戴手套的手。让消毒液在废液桶及其他表面停留作用10分钟。然后将物品从生物安全柜中取出，并移至水槽处。

将使用过的移液管放入移液管托盘中，准备高压灭菌。将废液桶中的内容物倒入水槽中的滤网内。然后将内衬红色生物危害袋的生物危害废物容器拿到水槽旁，把滤网中的废弃物倒入红色生物危害袋中。

将生物危害袋放置在推车上的高压灭菌托盘中。用胶带松散地封住高压灭菌袋，以允许蒸汽进入袋内。并在其中一条高压灭菌胶带上标注自己的姓名缩写和日期。

从高压灭菌锅中取出带孔金属杆并打开顶部。将含有嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）孢子的生物指示剂小瓶放入金属杆中，以检测高压灭菌锅灭菌循环是否成功完成。将装有废弃物的高压灭菌锅托盘放入高压灭菌锅内。

启动高压灭菌器，并检查灭菌循环是否已开始。高压灭菌器的操作屏幕将显示本次运行的剩余时间。在完成所需的孵育时间后，小心地从培养箱中取出蚀斑测定平板，并用手将其放入洁净的II级生物安全柜中。

用移液管吸出培养基和覆盖材料，并加入消毒液容器中。更换为含有10%中性缓冲福尔马林和0.8%结晶紫的混合液，作用30分钟以灭活病毒。灭活后，小心移除中性缓冲福尔马林/结晶紫混合液，置于单独的废液容器中，在丢弃前进行中和处理。

在水槽中冲洗平板，去除多余的染色剂，然后将平板放入托盘中彻底晾干。使用光源箱对噬菌斑进行计数。记录所有计数结果，并根据标准公式计算病毒滴度。

从BSL-4实验室中移出灭活样本时，将试管或培养板放入热封袋中。向袋内喷洒5%消毒剂或固定液，以对袋内表面及样本管外表面进行消毒，然后对袋子进行热封。

按照相同步骤将此袋放入另一个袋中。对第二层袋进行热封，并将双层密封的袋子放入含有5%消毒液的浸渍槽中至少10分钟，以对袋子外部进行消毒。在实验室内填写浸渍槽日志，记录管子的数量和规格、管内液体体积、所用试剂、所采用的灭活方法，以及样本将要转移至的房间。

在生物安全四级实验室中遵循正确的操作规程，对于确保检测的安全性和有效性至关重要。实验室工作人员通过参照已完成的每日内部检查清单，确保仪器设备处于完全正常的工作状态。将病毒样本进行连续稀释，以获得每孔含有30至300个噬斑的平板，并用于测定病毒滴度。

影响噬斑形成的因素包括病毒对宿主细胞系的嗜性、接种技术、病毒生长条件、适当的稀释范围以及覆盖物的选择。实验过程中在生物安全柜内产生的废弃物需进行两次消毒处理，在移出生物安全柜之前须彻底消毒一次。

随后，废弃物在离开动物生物安全四级环境之前需进行高压灭菌处理。遵循这些操作程序，在弗雷德里克综合研究设施开展的动物生物安全四级研究中，从未记录到任何实验室获得性感染。如果操作得当，该技术可在三到四小时内完成，具体时间取决于样本数量。

进行该实验操作时，请务必正确执行稀释步骤，准确计数噬菌斑，并严格遵守所有安全防护措施，以确保实验安全且成功。观看本视频后，您应充分了解正压防护服所带来的身体活动限制，以及完成标准噬菌斑测定所需额外耗费的时间。