生物安全四级实验室（BSL-4）中的安全防护与操作规程：3. 空气微生物学

本方案的总体目标是帮助实验室研究人员全面了解动物生物安全四级柜式实验室的气溶胶操作规程，以保障实验人员的安全。通过可视化展示该方案，有助于向正在规划类似设施的卫生管理人员以及参与高致病性病原体研究的外部合作者阐明操作的复杂性及安全要素。该技术的主要优势在于，利用负压三级生物安全柜进行气溶胶实验时，实验室工作人员无需穿戴正压防护服即可安全地开展空气生物学研究。

作为首席空气生物学专家，我将与来自我们实验室的气溶胶工程师Kyle Bohannon共同演示该操作流程。测试快速转运端口（RTP）设备的功能，该设备用于空气生物学操作，包括转运车门以及通过墙壁连接转运车与III级生物安全柜（BSC）的RTP。将RTP锁定到位。

对每只非人灵长类动物（NHP）的任何身体操作、给药或常规操作进行监测并记录在图表中。如果需要额外麻醉，确保所有取下的针帽、使用过的针头、锐器和注射器均丢弃在锐器容器中。使用后的针头不得重新套上针帽。

将麻醉后的非人灵长类动物（NHP）置于透明容器中运输，容器需通过运输箱盖上的锁扣固定。将运输容器放置在移动推车上，以便穿戴全套防护装备的研究人员能够借助呼吸软管自由移动，并通过耐气压门。气溶胶攻毒完成后，将NHP放入运输推车，将其送回居住笼具中。

在比较医学工作人员进行动物准备的同时，测试已去污的生物安全柜的功能性。确认III级生物安全柜内的负压维持在规定范围内。检查III级生物安全柜是否存在任何潜在的泄漏或裂纹。

检查已去污的III级生物安全柜上附带的合成橡胶手套和O型圈是否存在薄弱部位、撕裂、破损或干裂。在此阶段，III级生物安全柜尚未被污染。更换损坏的III级生物安全柜合成橡胶手套和/或O型圈。

检查浸渍槽，确认其中的消毒液已加至指定刻度线，即浸没挡板上方三英寸处或浸渍槽内壁的标线处。使用电导率仪确认浸渍槽中消毒液的浓度至少为 3,500 微西门子（µS）或 3.5 毫西门子（mS）。确保 III 级生物安全柜的高压灭菌器功能正常，以便在实验结束时接收污染的废弃物和设备，或仅限一次地将实验所需但先前遗漏的设备从高压灭菌器传递口传入 III 级生物安全柜内。

仅对已知能够耐受高温高压灭菌条件的设备进行高压灭菌。对其他空气生物学设备的功能性进行测试，例如电子连接部件和电源插座。

将戴有手套的双手伸入 III 级生物安全柜上连接的合成橡胶手套内。组装非人灵长类动物头部暴露室、条件化管道和气溶胶管理平台。将气溶胶发生器连接至条件化管道，并将空气动力学粒径谱仪连接至非人灵长类动物头部暴露室。

将戴着手套的双手从已连接的合成橡胶手套上退出。每次将戴着手套的手从已连接的合成橡胶手套中取出后，应将个人手套作为生物危害废物丢弃。接下来，在笔记本电脑上启动气溶胶实验方案软件。

在软件菜单中输入相应的非人灵长类动物专用头部暴露室、气溶胶发生器和生物采样器的流量，以及管理信息。通过快速传递端口接收已准备好的病原体，并用该病原体填充气溶胶发生器。此时三级生物安全柜已被污染。

通过气溶胶软件启动气溶胶发生器。来自气溶胶发生器的病原体会充满暴露室。关闭气溶胶发生器后，排空挑战材料并将其丢弃至 III 级生物安全柜内的生物危害垃圾桶中。

接下来，用收集介质填充生物采样器，并将装有收集介质的生物采样器连接到非人灵长类动物的头部暴露室。将适当的真空管路连接至生物采样器。通过对外部刺激无反应、肌张力以及呼吸和心率稳定等表现，检查非人灵长类动物的麻醉深度是否足够。

将麻醉后的非人灵长类动物通过传递通道送入III级生物安全柜中，将其置于暴露斜坡上呈仰卧位。通过目视及便携式动物监护仪确认非人灵长类动物的生命体征稳定。

在实验前，根据制造商的方案对呼吸感应体积描记法（RIP）进行校准。将呼吸感应体积描记带环绕置于非人灵长类动物（NHP）的腹部和胸部。检查这些带子是否合适，以及电子连接是否牢固扣紧。

接下来，将 Numatech 校准面罩覆盖在非人灵长类动物（NHP）的吻部，然后检查是否在 NHP 的吻部周围形成密封。使用计算机软件配合 Numatech 校准面罩对呼吸感应体积描记（RIP）带进行校准。

操作完成后，取下校准掩膜。通过兼容程序记录每只动物的呼吸参数，并导出呼吸数据。将非人灵长类动物的头部轻轻穿过连接在非人灵长类头部专用暴露室头部入口处的橡胶牙科橡皮障。

确保在气溶胶暴露期间，橡胶牙科橡皮障在非人灵长类动物颈部周围形成密封。将每次暴露运行的目标气溶胶累积体积及必要的设备标识符输入软件，并启动气溶胶程序。当非人灵长类动物吸入达到目标累积体积后，系统将自动关闭。

解开RIP绑带，并将其放置在非人灵长类动物（NHP）旁边的床上。使用浸有1%至2%氯己定溶液的纱布擦拭NHP身体，擦拭眼睛周围时需格外小心。轻拍NHP头部以去除多余的溶液。

将非人灵长类动物通过限制性通道装置（RTP）递送回生物安全四级（ABSL-4）气溶胶实验室内的研究人员。将气溶胶发生器及剩余的攻毒材料排空至装有废弃物、一次性设备和已装至四分之三满的锐器盒的生物危害垃圾袋中。将气溶胶生物采样器中的收集介质转移至相应标记的收集管中。

将收集管置于装有湿冰的桶中，用于相应的生物测定，以确定估计的吸入剂量。并将样本收集管和桶通过RTP传递。III级生物安全柜是在动物生物安全四级柜式实验室中，一个在负压条件下的密闭不锈钢柜。

工作人员通过安装在生物安全柜下方的不锈钢容器（即浸入式消毒槽），将物品引入动物生物安全三级（ABSL-4）防护服实验室内的生物安全柜中，该容器内盛有浓度为5%的双季铵盐类消毒液。由于该生物安全柜嵌入在分隔防护服实验室与柜式实验室的墙体中，因此也可通过转运推车和传递舱（RTP）从防护服实验室一侧将物品、动物及病毒病原体送入生物安全柜内。一旦转运推车的门向ABSL-4防护服实验室打开后，III级生物安全柜即被视为已受污染。

工作人员可佩戴各种合成橡胶手套，从生物安全柜（BSC）外部操作其内部物品。这些物品（不包括感染性样本）在通过双门高压灭菌器灭菌或通过浸渍槽消毒后，方可从生物安全柜中取出。通过确认III级生物安全柜和生物气溶胶设备正常运行，可维持安全且功能正常的操作环境，这对保障工作人员的安全至关重要。

严格遵守这些操作规程和实践措施后，在弗雷德里克综合研究设施中心进行的生物气溶胶研究过程中，从未记录到任何实验室获得性感染。一旦掌握该技术，即可高效及时地完成操作，从而在一天内实现对多只非人灵长类动物的暴露实验。在实施该操作过程中，请务必注意维持足够的麻醉深度。

若未达到稳态镇静，体积描记法的数据采集将变得困难得多。通过该方法，可进一步开展涉及较小物种（如兔子和小鼠）的其他空气生物学实验。该技术为空气生物学研究人员提供了控制影响剂量学的各种变量（如温度、相对湿度和生物采样器效率）的途径，从而实现精确的吸入剂量递送。

观看本视频后，您应充分了解气溶胶生物学实验中所采用的生物安全防护措施。例如，多次更换个人手套等防护措施可降低实验室获得性感染的风险。