Name: 安全注意事项和操作步骤在（A）BSL-4实验室:3，大气生物学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习在BSL-4实验室中使用三级生物安全柜进行非人灵长类动物气溶胶攻毒实验的安全操作程序。本视频详细演示了负压系统、快速转运端口及呼吸监测等关键安全组件的功能验证与标准操作流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部（DHHS）或与作者相关的机构和公司的观点或政策。本工作部分通过巴特尔纪念研究所与美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）签订的主合同（合同号：HHSN272200700016I）获得资助。J.K.B.、K.J.、M.R.H.、D.P.、L.B. 和 J.W. 以巴特尔纪念研究所雇员的身份完成了此项工作。作为巴特尔纪念研究所的分包商并参与本工作的人员包括：J.H.K.，Tunnell Government Services, Inc. 的雇员；以及 M.G.L.，Lovelace 呼吸系统研究所的雇员。

本方案遵循以下动物护理指南。动物饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International）认证的设施中。所有实验程序均经国家过敏和传染病研究所临床研究部动物护理与使用委员会批准，并符合《动物福利法》法规、公共卫生服务政策以及《实验动物护理与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）的建议。
1. 空气生物学：动物生物安全等级4（ABSL-4）防护服实验室
<ol>
	<li>实验室准备
	<ol>
		<li>完成ABSL-4防护服实验室的进入程序（详见文献8中的详细说明）。</li>
		<li>根据制造商的协议，测试所有在ABSL-4防护服实验室中进行空气生物学操作所涉及的设备（例如，体积描记设备、笔记本电脑、生物危害垃圾桶、生物危害锐器容器、受试对象监测设备）的功能是否正常。</li>
		<li>在测试快速传递端口（RTP）功能之前，确保转运推车处于生物学洁净状态；RTP通过墙体将转运推车与III级生物安全柜（BSC）相连。</li>
		<li>仅在经过认证的生物安全柜内操作和稀释病原体。在配备适当消毒剂的II级生物安全柜中配制适当剂型的病原体。将病原体置于贴有生物危害标识的密闭次级容器中，置于湿冰上，放入转运推车中运输。通过RTP将病原体传入ABSL-4柜式实验室中的III级生物安全柜内，图1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体积描记法：动物生物安全等级4（ABSL-4）防护服实验室
<ol>
	<li>体积描记法设置与校准
	<ol>
		<li>确定将采用哪种体积描记法采集方式（头部分离式体积描记法或呼吸感应体积描记法 [RIP]），并连接相应设备组件。</li>
		<li>根据制造商提供的操作规程，在实验前对体积描记仪进行校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体积描记法数据采集
	<ol>
		<li>在处理非人灵长类动物（NHP）时，应在防护服手套外额外佩戴一层乳胶或丁腈手套，以防止交叉污染并确保操作安全。处理完NHP后，应脱去这层额外手套，并丢弃至房间内的生物危害垃圾桶中。</li>
		<li>若使用头部分离式体积描记法，需在圆筒前端安装一个新的橡胶/牙科隔膜，在隔膜中央剪一小孔，使NHP头部可穿过圆筒顶部。当动物就位后，隔膜可在其颈部周围形成密封。</li>
		<li>若使用RIP方法，需检查RIP感应带是否正确贴合于NHP的胸腹部，并确认电子连接已牢固扣合。</li>
		<li>将体积描记过程中获取的所有数据发送至ABSL-4生物安全柜实验室内的研究人员。通过兼容软件导出每只动物的潮气量和每分钟通气量数据，供气溶胶操作过程使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 非人灵长类动物转运与操作：动物生物安全四级防护服实验室
<ol>
	<li>NHP 操作
	<ol>
		<li>监测并记录每只非人灵长类动物（NHP）的任何身体操作、给药或常规操作，并登记在记录表中。</li>
		<li>完成气溶胶攻击后，将 NHP 放入运输容器中，并将其送回动物饲养室内的居住笼具中。</li>
		<li>操作活体动物时，必须遵守至少两名工作人员在场的强制性规定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NHP 运输
	<ol>
		<li>在给药前，确定麻醉类型、麻醉持续时间（涵盖运输、体积描记数据采集和气溶胶攻击）以及相应的麻醉剂量。根据比较医学工作人员选定的流程，对 NHP 实施完全麻醉。如需追加麻醉，确保所有针头、锐器、注射器和帽盖均丢弃至动物操作室内的锐器容器中。使用后的针头禁止重新套帽。</li>
		<li>将麻醉后的 NHP 置于透明容器中进行运输，容器盖须通过卡扣固定。</li>
		<li>将运输容器装载至移动推车上，以便穿戴全套防护装备的研究人员能够借助呼吸供气管路，自由通过气压阻隔（APR）门，图 1。</li>
		<li>由于运输容器内不额外为 NHP 提供呼吸气体，应尽量缩短运输时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 空气微生物学：ABSL-4 柜式实验室
<ol>
	<li>III 级生物安全柜设置
	<ol>
		<li>在比较医学人员进行动物准备的同时，准备 III 级生物安全柜。目视确认 III 级生物安全柜内的负压维持在规定范围内（最低 125 Pa 或 -0.5 英寸水柱（wg）；推荐值为 250 Pa 或 -1.0 英寸水柱（wg））。检查 III 级生物安全柜是否存在潜在泄漏或裂纹（见图 1）。</li>
		<li>对 III 级生物安全柜上安装的合成橡胶手套和 O 形圈进行物理和目视检查，查看是否存在薄弱点、撕裂、破损或干裂。在使用前立即更换损坏的 III 级生物安全柜合成橡胶手套和/或 O 形圈。此时，III 级生物安全柜尚未被污染。</li>
		<li>如果在 III 级生物安全柜已被污染的情况下发生泄漏，应确定泄漏位置，并通知设施管理人员和生物安全人员。如果 III 级生物安全柜集成手套发生撕裂或破损，应按照经过适当培训的技术和内部 III 级生物安全柜标准操作程序立即更换损坏的手套。</li>
		<li>在暴露过程中更换带有小撕裂或破损的集成手套时，首先用适当浓度的双季铵盐（正烷基二甲基苄基氯化铵，正烷基二甲基乙基苄基氯化铵）消毒剂大量喷洒撕裂或破损处。在此期间避免做出可能增加气流的过度动作。</li>
		<li>小心地拆下外部 O 形圈（共两个），使损坏的集成手套仍连接在 III 级生物安全柜上。轻微移动损坏的集成手套袖口远离接口，同时确保集成手套密封保持完整。如果密封受损，将触发警报，表明操作不正确。在从 III 级生物安全柜上拆下第二个 O 形圈后，集成手套袖口应仍附着在接口上。</li>
		<li>将新的 III 级生物安全柜合成橡胶手套以相同方向套在旧手套上。将新手套完全覆盖在接口上，方式与其他 III 级生物安全柜手套接口相同。</li>
		<li>在靠近 III 级生物安全柜的一侧，将 O 形圈重新安装到新手套上。使用相邻的集成手套接口，小心地将损坏的 III 级生物安全柜合成橡胶手套拉入 III 级生物安全柜内部。新的 III 级生物安全柜合成橡胶手套将作为屏障以维持密闭性。一旦另一只损坏的 III 级生物安全柜合成橡胶手套被移除（向内拉出），立即更换另一个外部 O 形圈，并继续工作。</li>
		<li>在特定的 III 级生物安全柜日志本中记录所有关于手套撕裂/破损的详细信息。如果已移除损坏的集成手套或发生密闭性破坏，受损的集成手套/接口仍能维持 0.47 m3/sec 的向内气流。该向内气流与 II 级生物安全柜所用气流相同，从而确保 II 级与 III 级生物安全柜之间的一致性。</li>
		<li>检查浸没槽，并确认浸没槽内消毒剂已加至槽内标记的液位（图 1）。使用电导率仪验证浸没槽中消毒剂的浓度至少为 3,500 µS。该电导率相当于消毒剂 5% 的浓度。</li>
		<li>确保 III 级生物安全柜的高压灭菌器功能正常，以便对所有受污染的废弃物和设备进行高压灭菌（图 1）。仅对已知能够承受灭菌过程严苛条件的设备进行高压灭菌。</li>
		<li>测试其他气溶胶生物学设备（例如，AAMP 组件、笔记本电脑）以及实验中涉及的空气和真空管线的功能（图 2）。</li>
		<li>在 III 级生物安全柜上放置标识牌，标明该设备当前的污染状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非人灵长类动物头部暴露室的组装与系统设置
	<ol>
		<li>通过插入不锈钢输送和排气管线，组装一个 16 升的非人灵长类动物头部暴露室（图 2）。通过将适当的空气、真空和压力管线连接至 AAMP，将暴露室配置为推拉式动态系统。将 AAMP 连接到 III 级生物安全柜内的电源以及通过位于 III 级生物安全柜顶部的密封接口连接的笔记本电脑（图 1）。</li>
		<li>检查组装好的非人灵长类动物头部暴露室是否存在任何泄漏或裂纹，并确保暴露室已正确组装。</li>
		<li>将气溶胶发生器和空气动力学粒径测量仪器连接到非人灵长类动物头部暴露室。</li>
		<li>打开通往 AAMP 的空气和真空源。</li>
		<li>在笔记本电脑上启动气溶胶实验协议软件。在软件菜单中输入相应的非人灵长类动物头部暴露室、气溶胶发生器和生物采样器的流速以及管理信息。</li>
		<li>根据体积描记术步骤 2.2.4 中获取的数据计算气溶胶攻击时间。如果使用头部外露式体积描记术，应在气溶胶暴露前计算剂量；如果使用电阻抗体积描记术（RIP），则在气溶胶暴露期间同步计算剂量。</li>
		<li>向气溶胶发生器中加入病原体。</li>
		<li>通过气溶胶软件将气溶胶发生器&#34;开启&#34;，并用攻击物质对非人灵长类动物头部暴露室内部喷雾 10 分钟。</li>
		<li>关闭气溶胶发生器，清空攻击物质，并将攻击物质丢弃至 III 级生物安全柜内的生物危害垃圾袋中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非人灵长类动物头部暴露
	<ol>
		<li>将生物采样器连接到非人灵长类动物头部暴露室，向生物采样器中加入收集介质，并连接适当的真空管线。</li>
		<li>检查非人灵长类动物的麻醉深度。如果麻醉深度被认为足够（例如，对外界刺激无反应、肌张力正常、呼吸和心率稳定），则通过快速传递接口（RTP）将麻醉后的非人灵长类动物送入 III 级生物安全柜。如果麻醉深度不足，则在通过 RTP 之前通过静脉注射、直接注射或麻醉泵追加麻醉（由防护服实验室内的比较医学人员操作）。同时通过 RTP 传递额外的麻醉用品。</li>
		<li>将非人灵长类动物以仰卧位放置在暴露斜坡上。</li>
		<li>轻柔地将非人灵长类动物的头部穿过固定在头部暴露室入口处的橡胶/牙科橡皮障。橡胶/牙科橡皮障可确保在气溶胶暴露期间在非人灵长类动物颈部周围形成密封。</li>
		<li>通过目视和便携式受试者监护仪确认非人灵长类动物的生命体征稳定。</li>
		<li>在气溶胶软件中输入从步骤 4.2.6 计算出的气溶胶攻击时间以及每次气溶胶运行所需的相关设备标识符，并开始气溶胶攻击。</li>
		<li>在每次气溶胶运行期间，使用气溶胶粒径分析仪验证粒径数据，以确保达到预期的粒径分布。在整个暴露过程中持续或间歇性地执行此验证。</li>
		<li>气溶胶攻击完成后，将非人灵长类动物从头部暴露室中取出，并使用适当的消毒剂擦拭其面部/头部，以减少对实验室工作人员的潜在污染。</li>
		<li>通过向暴露室通入空气和真空持续 5 分钟，清除残留和滞后的颗粒。该程序将&#34;清洁&#34;气溶胶暴露室，去除残留颗粒，为后续非人灵长类动物的气溶胶暴露做准备。</li>
		<li>通过 RTP 将非人灵长类动物送回位于 ABSL-4 气溶胶生物学防护服实验室内的研究人员。</li>
		<li>将 III 级生物安全柜内使用的所有锐器丢弃至位于生物安全柜内的指定锐器容器中。当锐器容器填充至 ¾ 满时，将其放入生物危害垃圾袋中。</li>
		<li>将气溶胶发生器中的剩余攻击物质以及任何残留物倒入含有废弃物、一次性设备和/或 ¾ 满锐器容器的生物危害垃圾袋中（如适用）。</li>
		<li>将气溶胶生物采样器中的收集介质倒入适当标记的收集管中，并置于湿冰上。</li>
		<li>重复步骤 4.3.1 至 4.3.13，直至所有预定测试对象均完成攻击。</li>
		<li>通过 RTP 将所有气溶胶生物采样器样本送至研究人员，用于气溶胶剂量的定量分析和反向滴定。</li>
		<li>将气溶胶攻击中产生的废弃物和设备放入连接至 III 级生物安全柜的传递式高压灭菌器中，并选择适当的灭菌循环（图 3）。</li>
		<li>拆卸非人灵长类动物头部暴露室，并使用经生物指示剂验证的多聚甲醛气体循环对头部暴露室和 III 级生物安全柜进行去污处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alibek, K., Handelman, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlibek%2C+K+%22The+chilling+true+story+of+the+largest+covert+biological+weapons+program+in+the+world-told+from+inside+by+the+man+who+ran+it%22">The chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from inside by the man who ran it</a>. , Random House. New York, NY. (1999).</li>
<li>Roy, C. J., Pitt, L. M. Infectious disease aerobiology: aerosol challenge methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+CJ+%22Biodefense%3A+research+methodology+and+animal+models%22">Biodefense: research methodology and animal models</a>. Swearingen, J. R. , Taylor & Francis. Boca Raton, FL. 61-76 (2006).</li>
<li>National Institute of Allergy and Infectious Diseases. NIAID Category A, B, and C Priority Pathogens. , National Institutes of Health. Bethesda, MD, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx">http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx</a> (2014).</li>
<li>National Center for Environmental Health. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp">http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp</a> (2014).</li>
<li>Lackemeyer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABSL-4+aerobiology+biosafety+and+technology+at+the+NIH%2FNIAID+integrated+research+facility+at+Fort+Detrick%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">ABSL-4 aerobiology biosafety and technology at the NIH/NIAID integrated research facility at Fort Detrick.</a> Viruses. 6 (1), 137-150 (2014).</li>
<li>Bohannon, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+large-particle+aerosols+using+a+center+flow+tangential+aerosol+generator+with+a+non-human-primate%2C+head-only+aerosol+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of large-particle aerosols using a center flow tangential aerosol generator with a non-human-primate, head-only aerosol chamber.</a> Inhal Toxicol. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. Chosewood, L. C., Wilson, D. E., eds, , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C.. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/</a> (2009).</li>
<li>Janosko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Precautions+and+Operating+Procedures+in+an+%28A%29BSL4+Laboratory%3A+1.+Biosafety+level+4+suit+laboratory+suite+entry+and+exit+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 1. Biosafety level 4 suit laboratory suite entry and exit procedures.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Mazur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Precautions+and+Operating+Procedures+in+an+%28A%29BSL4+Laboratory%3A+2.+General+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 2. General Practices.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Mortola, J. P., Frappell, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+barometric+method+for+measurements+of+ventilation%2C+and+its+use+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals.</a> Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 937-944 (1998).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+respiratory+inductive+plethysmography+module+supporting+multiple+sensors+for+wearable+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a respiratory inductive plethysmography module supporting multiple sensors for wearable systems.</a> Sensors (Basel). 12 (10), 13167-13184 (2012).</li>
<li>Ingram-Ross, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorespiratory+safety+evaluation+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Meth%22%5BJournal%5D)">Cardiorespiratory safety evaluation in non-human primates.</a> J Pharmacol Toxicol Meth. 66 (2), 114-124 (2012).</li>
<li>Besch, T. K., Ruble, D. L., Gibbs, P. H., Pitt, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+minute+volume+determination+by+body-only+plethysmography+in+juvenile+rhesus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Steady-state minute volume determination by body-only plethysmography in juvenile rhesus monkeys.</a> Lab Anim Sci. 46 (5), 539-544 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们概述了弗雷德里克综合研究设施（IRF-Frederick）在处理高危（生物安全等级4）病原体时所采用的空气微生物学操作规程。对生物气溶胶操作流程进行可视化呈现的目的之一，是在使用III级生物安全柜进行此类病原体实验时，强调保障工作人员安全，以避免实验室获得性感染的发生。III级生物安全柜通过维持向内的定向气流，并将排出气体经过双重高效微粒空气（HEPA）过滤器过滤，从而确保病原体被严格封闭在实验室内（图1）。
由于III级生物安全柜（BSC）是防止生物气溶胶研究过程中潜在病原体暴露的主要屏障，研究人员必须在每次气溶胶实验前后检查III级BSC及其附带的集成式合成橡胶手套是否存在泄漏。尽管已尽一切努力消除对实验室研究人员的风险，但仍可能发生III级BSC集成合成橡胶手套破损的情况。必须为工作人员提供理论和实践操作相结合的培训，内容涵盖III级BSC应急响应程序。这些程序包括从ABSL-4柜式实验室撤离、对III级BSC的密闭性破损进行封堵，以及在必要时穿戴个人防护装备。我们过去曾使用过不同厚度的其他类型手套，其选择取决于实验操作所需的精细动作技能...

病毒的传播通常通过直接接触或物理接触发生，但许多重要的病毒性疾病（例如，麻疹、水痘、流感）是由通过气溶胶或呼吸道飞沫传播的病原体引起的。这类病原体有可能引发大流行，其后果从伴随工作能力丧失的广泛轻症（例如，普通感冒）到罕见但致死率高的严重疾病（例如，天花）不等。通过自然气溶胶传播或人为气溶胶释放（生物武器）传播的高致病性病原体尤其受到空气生物学领域的关注1。人类可能通过较大的呼吸道飞沫或微小颗粒核迅速感染其中一些病原体，并通过唾液分泌物、咳嗽和打喷嚏轻易将这些病原体传播给他人2。在美国生物防御领域，由于相关感染具有高致死性，高致病性病原体（例如，丝状病毒或其他美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）分类A-C优先病原体以及美国疾病控制与预防中心（CDC）生物恐怖剂）成为气溶胶研究项目的重点3,4。过去十年中，由于气溶胶设备和技术以及高等级防护设施的进步，空气生物学领域取得了显著的科学进展5,6。美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）位于马里兰州弗雷德里克的德特里克堡综合研究设施（IRF-Frederick）的研究重点是需要动物生物安全四级（ABSL-4）防护的高致病性新发传染病原体。IRF-Frederick 的总体任务是评估并推动候选疫苗和治疗药物（医学对策）的研发。
在弗雷德里克综合研究设施（IRF-Frederick）开展的高后果病原体研究受到严格的生物安全以及动物护理与使用要求的约束。这些要求在以下文件中有所规定： 微生物学和生物医学实验室生物安全 (BMBL) 手册7 以及联邦动物福利法规. 这些必要要求可能会限制可开展的研究类型，并影响整体研究设计。正如我们此前在本期刊中所述，所有在ABSL-4环境中进行的研究均需要特别谨慎、高度专业化的培训，以及坚固且具备冗余设计的设施基础设施8,9.
进入IRF-Frederick的ABSL-4正压防护服实验室需要穿戴正压密闭式防护服8。进入ABSL-4柜式实验室则无需穿戴正压密闭式防护服。在ABSL-4柜式实验室中，于经认证的III级生物安全柜（BSC）内操作危险等级4级的感染性材料时，应穿着刷手服，佩戴橡胶或丁腈手套，并穿包趾鞋7。
在IRF-Frederick，气溶胶设备在两个完全密封的不锈钢气密负压III级生物安全柜中进行设计、组装和维护，如图1所示。IRF-Frederick气溶胶生物学核心设施采用自动化气溶胶管理平台（AAMP）来控制和监测这些生物安全柜内的气溶胶实验，如图2所示。此前一篇出版物已详细说明IRF-Frederick的III级生物安全柜的具体功能及其通过传递端口与防护服实验室的连接方式5。在实验前准备III级生物安全柜的操作流程是IRF特有的。其他机构所使用的III级生物安全柜功能上与IRF所用设备类似，但在运输、进入或对接机制方面可能存在差异。
为了进一步了解高致病性病原体如何通过气溶胶传播保持感染性，必须在III级生物安全柜（BSC）中按照特定的工作流程进行安全的空气生物学实验。研究人员已接受过严格而全面的培训，以确保该工作流程以安全且一致的方式执行。在开展非人灵长类动物（NHP）气溶胶攻毒实验之前，需先进行若干次气溶胶表征或模拟气溶胶运行，以检测病原体在气溶胶状态下的稳定性和活性。气溶胶表征过程模拟实际的气溶胶攻毒操作，研究人员将评估与气溶胶研究相关的各项变量。
工作流程的另一个环节是记录每只非人灵长类动物（NHP）的物理操作、麻醉剂或其他试剂的给药情况以及常规操作流程。这些个体记录表将被全面分析，以确保操作的一致性和标准化。在气溶胶暴露前，动物需进行麻醉。示例麻醉剂包括替来他明/唑拉西泮（tiletamine/zolazepam）、氯胺酮/乙酰丙嗪（ketamine/acepromazine）以及氯胺酮（ketamine）。麻醉剂的选择基于最小化呼吸抑制并促进受控、稳态呼吸的原则。额外的麻醉用品保存在动物操作间内，并随NHP通过转运车一同运送至气溶胶生物安全四级（ABSL-4）柜实验室。
在ABSL-4防护服实验室中，非人灵长类动物通过以下两种方法之一进行体积描记术即，头部伸出式体积描记法，呼吸感应体积描记法（RIP），用于测定吸气潮气量和呼吸频率的变化10-12这些衍生参数用于在气溶胶暴露前或暴露期间，精确计算病原体的估计吸入剂量。头部外露式体积描记法使用一个长圆柱形舱室来容纳非人灵长类动物（NHP）13动物处于圆筒内时所产生的压力变化由流量传感器捕获，随后传递至放大器，经交流/直流转换器处理后，输入软件以计算上述肺功能参数。呼吸感应体积描记法（RIP）采用嵌入在弹性带内的感应式铜线圈传感器，环绕于受试对象的胸部和腹部。11,12感应电容在传感器中产生磁场。呼吸会改变该磁场，由此产生的电压变化通过短波超高频无线电波，从弹性带旁的发射器传输至计算机中的接收器。专用软件根据胸腔总位移确定呼吸频率和潮气量。
通过体积描记法获得的每分钟通气量（MV）用于计算估计吸入剂量（D）。在发生和采集气溶胶的过程中，气溶胶浓度（AC）通过将生物采样器浓度（BC）乘以培养基体积（V），再除以生物采样器流速（FL）与暴露时间（T）的乘积来计算。简化公式表示为 AC = BC × V ÷ FL × T。进而，在非人灵长类动物（NHPs）的实际气溶胶攻击实验中，D 通过将 AC 与 MV 及暴露持续时间（时间 = T）相乘来计算。简化公式表示为 D = AC × MV × T。
本文旨在从两个角度直观展示使用非人灵长类动物（NHP）进行气溶胶攻击实验的完整操作流程：ABSL-4防护服实验室侧和ABSL-4生物安全柜实验室侧。尽管文中所述程序在某些方面具有通用性，但这些操作具体针对弗雷德里克传染病研究所（IRF-Frederick）气溶胶生物学核心设施，并反映该机构实际采用的操作规范。本文重点介绍安全实施气溶胶攻击实验所需遵守的生物安全程序，而非气溶胶攻击实验本身的技术细节。由于麻醉非人灵长类动物存在风险，我们在演示中使用模拟受试对象来展示生物安全操作实践。然而，气溶胶攻击实验的操作流程仍以通用方式描述，因为无论使用何种高致病性病原体，其基本操作步骤均相同。我们的目标是增进科研人员对在最高级别生物 containment 条件下开展高致病性病原体气溶胶研究严苛性的认识与理解。

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>国家化学实验室</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>III级生物安全柜</td><td>Germfree</td><td>DGB-10</td><td></td></tr><tr><td>集成式生物安全柜手套</td><td>Piercan</td><td>10UY2032-9</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶管理平台（AeroMP）</td><td>Biaera Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>头部外露式体积描记法系统</td><td>Buxco/数据科学国际公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>呼吸感应体积描记法系统</td><td>数据科学国际公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>中心气流切向气溶胶发生器（CenTAG）</td><td>CH Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Collison喷雾器</td><td>BGI Inc.&amp;nbsp;</td><td>CN25</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>Sperian正压防护服</td><td>霍尼韦尔安全产品公司</td><td>BSL 4-2</td><td></td></tr><tr><td>外层防护服手套（乳胶，Ansell Canners and Handlers）</td><td>Fisher</td><td>19-019-601</td><td></td></tr><tr><td>外层防护服手套（腈/橡胶，MAPA）</td><td>Fisher</td><td>2MYU1</td><td></td></tr><tr><td>手术刷手服</td><td>Cintas</td><td>60975/60976</td><td></td></tr><tr><td>袜子</td><td>Cintas</td><td>944</td><td></td></tr><tr><td>封箱胶带</td><td>Pack-N-Tape</td><td>51131069695</td><td></td></tr><tr><td>毛巾</td><td>Cintas</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>O型密封圈</td><td>O型圈仓库</td><td>AS568-343</td><td></td></tr><tr><td>鞋套</td><td>Amazon</td><td>B0034KZE22</td><td></td></tr><tr><td>拉链润滑剂</td><td>Amazon</td><td>B000GKBEJA</td><td></td></tr></tbody></table>

生物安全四级实验室（bsl-4）中的安全防护与操作规程：3. 空气微生物学

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

由于人们日益关注故意气溶胶释放或意外的自然气溶胶传播所带来的威胁，高致病性病原体的气溶胶或吸入式研究数量近期持续增加。开展此类实验的特定实验室需要极为严格的工程控制措施，以提供安全可靠的实验环境，并依赖持续的系统维护来保障正常运行。III级生物安全柜（也称为手套箱）是一种气密性封闭装置，配备不可开启的窗口，通过双高效微粒空气（HEPA）过滤排风系统维持负压状态，是容纳气溶胶发生设备的理想一级防护设施。在高等级生物安全防护条件下，例如从动物生物安全四级（ABSL-4）防护服实验室到ABSL-4生物安全柜实验室之间，工作人员之间周密规划的工作流程是实验成功的关键要素。为确保研究顺利实施，建立通信网络、转移设备与实验对象、以及设备的安装与布置，均要求工作人员在研究启动前仔细规划各项操作程序。本文以美国马里兰州弗雷德里克堡国家卫生研究院过敏与传染病研究所综合研究设施为例，概述并以图示方式展示在ABSL-4环境中开展空气生物学研究的具体方法。

III 级生物安全柜（BSC）是一种完全密封的不锈钢安全柜，其内部在负压条件下维持动物生物安全四级（ABSL-4）环境，设置于 ABSL-4 柜式实验室中（图 1）。工作人员可在 ABSL-4 柜式实验室内，通过安装于安全柜下方的不锈钢容器（在 ABSL-4 或 BSL-4 环境中通常称为“浸入式消毒槽”），将物品引入 BSC 内，该容器中盛有浓度为 5% 的双链季铵盐消毒液（正烷基二甲基苄基氯化铵、正烷基二甲基乙基苄基氯化铵）。由于该 BSC 嵌入分隔柜式实验室与 ABSL-4 防护服实验室的墙体中，因此也可通过转运车和快速传递端口（RTP）从 ABSL-4 防护服实验室一侧将物品、实验动物及病毒病原体送入 BSC。研究人员可通过佩戴特定类型的合成橡胶手套（如氯丁橡胶/氯磺化聚乙烯材质）从外部操作 BSC 内的物品。除感染性样本外，BSC 内的物品在经双门高压灭菌器灭菌或通过浸入式消毒槽消毒后方可取出。通过检查和确认 III 级 BSC 及生物气溶胶设备（图 2）正常运行，我们可确保环境的安全性与设备的...

由于高致病性病原体可能通过空气颗粒感染宿主，空气生物学 increasingly 被应用于发病机制研究和医学对策开发中。本文展示了在动物生物安全四级最高防护环境中，对非人灵长类动物进行气溶胶攻击时空气生物学操作步骤的详细可视化演示。

生物安全四级实验室（BSL-4）中的安全防护与操作规程：3. 空气微生物学

高后果病原体的气溶胶或吸入式研究近年来数量有所增加，原因是人们认为存在故意释放气溶胶的威胁……

本方案的总体目标是帮助实验室研究人员全面了解动物生物安全四级柜式实验室的气溶胶操作规程，以保障实验人员的安全。通过可视化展示该方案，有助于向正在规划类似设施的卫生管理人员以及参与高致病性病原体研究的外部合作者阐明操作的复杂性及安全要素。该技术的主要优势在于，利用负压三级生物安全柜进行气溶胶实验时，实验室工作人员无需穿戴正压防护服即可安全地开展空气生物学研究。作为首席空气生物学专家，我将与来自我们实验室的气溶胶工程师Kyle Bohannon共同演示该操作流程。测试快速转运端口（RTP）设备的功能，该设备用于空气生物学操作，包括转运车门以及通过墙壁连接转运车与III级生物安全柜（BSC）的RTP。将RTP锁定到位。对每只非人灵长类动物（NHP）的任何身体操作、给药或常规操作进行监测并记录在图表中。如果需要额外麻醉，确保所有取下的针帽、使用过的针头、锐器和注射器均丢弃在锐器容器中。使用后的针头不得重新套上针帽。将麻醉后的非人灵长类动物（NHP）置于透明容器中运输，容器需通过运输箱盖上的锁扣固定。将运输容器放置在移动推车上，以便穿戴全套防护装备的研究人员能够借助呼吸软管自由移动，并通过耐气压门。气溶胶攻毒完成后，将NHP放入运输推车，将其送回居住笼具中。在比较医学工作人员进行动物准备的同时，测试已去污的生物安全柜的功能性。确认III级生物安全柜内的负压维持在规定范围内。检查III级生物安全柜是否存在任何潜在的泄漏或裂纹。检查已去污的III级生物安全柜上附带的合成橡胶手套和O型圈是否存在薄弱部位、撕裂、破损或干裂。在此阶段，III级生物安全柜尚未被污染。更换损坏的III级生物安全柜合成橡胶手套和/或O型圈。检查浸渍槽，确认其中的消毒液已加至指定刻度线，即浸没挡板上方三英寸处或浸渍槽内壁的标线处。使用电导率仪确认浸渍槽中消毒液的浓度至少为 3,500 微西门子（µS）或 3.5 毫西门子（mS）。确保 III 级生物安全柜的高压灭菌器功能正常，以便在实验结束时接收污染的废弃物和设备，或仅限一次地将实验所需但先前遗漏的设备从高压灭菌器传递口传入 III 级生物安全柜内。仅对已知能够耐受高温高压灭菌条件的设备进行高压灭菌。对其他空气生物学设备的功能性进行测试，例如电子连接部件和电源插座。将戴有手套的双手伸入 III 级生物安全柜上连接的合成橡胶手套内。组装非人灵长类动物头部暴露室、条件化管道和气溶胶管理平台。将气溶胶发生器连接至条件化管道，并将空气动力学粒径谱仪连接至非人灵长类动物头部暴露室。将戴着手套的双手从已连接的合成橡胶手套上退出。每次将戴着手套的手从已连接的合成橡胶手套中取出后，应将个人手套作为生物危害废物丢弃。接下来，在笔记本电脑上启动气溶胶实验方案软件。在软件菜单中输入相应的非人灵长类动物专用头部暴露室、气溶胶发生器和生物采样器的流量，以及管理信息。通过快速传递端口接收已准备好的病原体，并用该病原体填充气溶胶发生器。此时三级生物安全柜已被污染。通过气溶胶软件启动气溶胶发生器。来自气溶胶发生器的病原体会充满暴露室。关闭气溶胶发生器后，排空挑战材料并将其丢弃至 III 级生物安全柜内的生物危害垃圾桶中。接下来，用收集介质填充生物采样器，并将装有收集介质的生物采样器连接到非人灵长类动物的头部暴露室。将适当的真空管路连接至生物采样器。通过对外部刺激无反应、肌张力以及呼吸和心率稳定等表现，检查非人灵长类动物的麻醉深度是否足够。将麻醉后的非人灵长类动物通过传递通道送入III级生物安全柜中，将其置于暴露斜坡上呈仰卧位。通过目视及便携式动物监护仪确认非人灵长类动物的生命体征稳定。在实验前，根据制造商的方案对呼吸感应体积描记法（RIP）进行校准。将呼吸感应体积描记带环绕置于非人灵长类动物（NHP）的腹部和胸部。检查这些带子是否合适，以及电子连接是否牢固扣紧。接下来，将 Numatech 校准面罩覆盖在非人灵长类动物（NHP）的吻部，然后检查是否在 NHP 的吻部周围形成密封。使用计算机软件配合 Numatech 校准面罩对呼吸感应体积描记（RIP）带进行校准。操作完成后，取下校准掩膜。通过兼容程序记录每只动物的呼吸参数，并导出呼吸数据。将非人灵长类动物的头部轻轻穿过连接在非人灵长类头部专用暴露室头部入口处的橡胶牙科橡皮障。确保在气溶胶暴露期间，橡胶牙科橡皮障在非人灵长类动物颈部周围形成密封。将每次暴露运行的目标气溶胶累积体积及必要的设备标识符输入软件，并启动气溶胶程序。当非人灵长类动物吸入达到目标累积体积后，系统将自动关闭。解开RIP绑带，并将其放置在非人灵长类动物（NHP）旁边的床上。使用浸有1%至2%氯己定溶液的纱布擦拭NHP身体，擦拭眼睛周围时需格外小心。轻拍NHP头部以去除多余的溶液。将非人灵长类动物通过限制性通道装置（RTP）递送回生物安全四级（ABSL-4）气溶胶实验室内的研究人员。将气溶胶发生器及剩余的攻毒材料排空至装有废弃物、一次性设备和已装至四分之三满的锐器盒的生物危害垃圾袋中。将气溶胶生物采样器中的收集介质转移至相应标记的收集管中。将收集管置于装有湿冰的桶中，用于相应的生物测定，以确定估计的吸入剂量。并将样本收集管和桶通过RTP传递。III级生物安全柜是在动物生物安全四级柜式实验室中，一个在负压条件下的密闭不锈钢柜。工作人员通过安装在生物安全柜下方的不锈钢容器（即浸入式消毒槽），将物品引入动物生物安全三级（ABSL-4）防护服实验室内的生物安全柜中，该容器内盛有浓度为5%的双季铵盐类消毒液。由于该生物安全柜嵌入在分隔防护服实验室与柜式实验室的墙体中，因此也可通过转运推车和传递舱（RTP）从防护服实验室一侧将物品、动物及病毒病原体送入生物安全柜内。一旦转运推车的门向ABSL-4防护服实验室打开后，III级生物安全柜即被视为已受污染。 工作人员可佩戴各种合成橡胶手套，从生物安全柜（BSC）外部操作其内部物品。这些物品（不包括感染性样本）在通过双门高压灭菌器灭菌或通过浸渍槽消毒后，方可从生物安全柜中取出。通过确认III级生物安全柜和生物气溶胶设备正常运行，可维持安全且功能正常的操作环境，这对保障工作人员的安全至关重要。严格遵守这些操作规程和实践措施后，在弗雷德里克综合研究设施中心进行的生物气溶胶研究过程中，从未记录到任何实验室获得性感染。一旦掌握该技术，即可高效及时地完成操作，从而在一天内实现对多只非人灵长类动物的暴露实验。在实施该操作过程中，请务必注意维持足够的麻醉深度。若未达到稳态镇静，体积描记法的数据采集将变得困难得多。通过该方法，可进一步开展涉及较小物种（如兔子和小鼠）的其他空气生物学实验。该技术为空气生物学研究人员提供了控制影响剂量学的各种变量（如温度、相对湿度和生物采样器效率）的途径，从而实现精确的吸入剂量递送。观看本视频后，您应充分了解气溶胶生物学实验中所采用的生物安全防护措施。例如，多次更换个人手套等防护措施可降低实验室获得性感染的风险。

safety-precautions-operating-procedures-an-bsl-4-laboratory-3

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

安全注意事项和操作步骤在（A）BSL-4实验室：3，大气生物学

尽管研究人员通常了解生物安全等级1或2（BSL-1/2）实验所需的操作流程和安全预防措施，但他们可能不熟悉BSL-4防护服实验室中的实验操作流程。本文提供了BSL-4防护服实验室系统检查、进入实验室、在实验室内的活动以及离开实验室程序的详细可视化演示。...

四级生物安全实验室的安全防范措施与操作规程：1. 生物安全四级防护服实验室区域的进出程序

在生物安全等级4级（BSL-4）实验室中进行病毒实验比在生物安全等级2级（BSL-2）实验室中更为复杂，因为需要采取额外的安全防护措施。本文概述了在BSL-4实验室内部所采用的操作规范和流程，包括正确使用II级生物安全柜、废物管理与处置，以及样本移出的方法。...

生物安全四级（A）实验室中的安全预防措施与操作规程：2. 通用规范

本文概述了在动物生物安全四级实验室中安全开展医学影像学检查所需的制备及动物操作流程。通过对一只模拟感染的豚鼠进行计算机断层扫描，展示了可用于评估高致病性病原体所致疾病的方法步骤。...

四级生物安全实验室中的安全预防措施与操作规程：4. 医学影像检查程序

已设计并建造了一种可快速部署、独立运行的实验室，适用于偏远且资源有限的全球地区。本文探讨了经过物流优化、可扩展、多功能实验室模块的特点及关键要素。同时制定并展示了基本实验室工作流程的检查清单，以及一项呼吸道病毒诊断检测的操作方案。...

远程实验室管理：呼吸道病毒诊断

本文以采血进行免疫表型分析为例，介绍用于“野生型小鼠”的设施的结构和操作流程，包括微生物 containment...

具有天然微生物群的小鼠实验设施的操作与生物安全防护程序：免疫表型分析流程

本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位...

基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

在南非，针对艾滋病/艾滋病病毒的抗逆转录病毒治疗正在大规模开展监测。通过流式细胞术，结合血液学（CD45）、免疫学（CD4）以及与病毒载量相关的CD38检测方法进行综合分析。这些现代化技术在约翰内斯堡的南非国家卫生实验室服务署（NHLS-SA）实验室中实施，具有成本效益高、本地内部质量控制严格的优势，为资源有限地区的诊断体系提供了可借鉴的典范。...

全面且经济高效的艾滋病实验室监测：非洲的典范模式

近15年来，犬腺病毒2型（CAV2）衍生载体已证实具有高效转导细胞的能力 体外 和 体内...

非复制型犬腺病毒2型载体的制备与纯化

食腐动物可能通过其粪便将具有感染性的可传播性海绵状脑病朊病毒转运至无疫区。我们详细描述了用于确定鼠源适应性羊痒病朊病毒在通过美洲乌鸦（Corvus...

通过鸟类消化系统传播后鉴定传染性朊病毒的实验步骤

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。...

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

学习在BSL-4实验室中使用三级生物安全柜进行非人灵长类动物气溶胶攻毒实验的安全操作程序。本视频详细演示了负压系统、快速转运端口及呼吸监测等关键安全组件的功能验证与标准操作流程。

生物安全四级实验室（BSL-4）中的安全防护与操作规程：3. 空气微生物学

探索更多视频