Name: 多外显子跳跃在犬X连锁肌营养不良用鸡尾酒反义寡核苷酸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 了解使用鸡尾酒反义寡核苷酸在犬模型中诱导多外显子跳跃治疗杜氏肌营养不良的方法。该技术实现全身性肌营养不良蛋白拯救，为基因治疗提供可靠临床前证据。

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本工作由阿尔伯塔大学医学与牙科学院、Garrett Cumming 研究基金之友基金、HM Toupin 神经科学研究中心基金、加拿大肌肉萎缩症协会、加拿大创新基金会（CFI）、阿尔伯塔省高等教育与技术部（AET）、加拿大卫生研究院（CIHR）、Jesse's Journey — 基因与细胞治疗基金会以及妇女与儿童健康研究所（WCHRI）提供支持。

本文的开放获取费用由 Gene Tools, LLC 提供。

外显子跳跃是一种治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的有前景的治疗技术。两者 体外 和 在体内 实验已证明多外显子跳跃是可行的。本文讨论了CXMD犬模型的应用。首先，利用Rescue-ESE和ESEfinder程序设计靶向外显子6和外显子8的AONs dystrophin 外显子6 - 8。CXMD成肌细胞转染采用2'OMePS反义寡核苷酸化学修饰，而多外显子跳跃实验则选用吗啉代反义寡核苷酸骨架化学修饰。 在体内 实验。vPMOs 比未修饰的 PMOs 更高效，但由于其毒性较高，不适合用于系统性注射。对 CXMD 成肌细胞进行了 RNA 提取、RT-PCR 和 cDNA 测序。对注射了 PMO 混合物的狗进行临床评分，以评估其功能改善情况&#160;临床症状。在人道安乐死后，采集犬的肌肉样本并制备用于冷冻切片。&#160;抗体会诱导的抗肌萎缩蛋白的半衰期被认为约为1 - 2个月。本研究使用了年轻成年犬，但这些实验也可在新生犬和老年犬中进行。&#62;5岁）。制备的肌肉切片用于通过蛋白质印迹和免疫组织化学评估组织病理学及 dystrophin 蛋白的恢复情况48.
注射前必须确保PMO溶液的体积准确，否则将对实验结果产生显著影响。进行肌肉注射时，需施加足够的压力以进入肌纤维。监测犬的健康状况并检查手术部位对于排查问题至关重要。为监测动物健康状况，应每周进行血液检测和称重。动物安乐死后制备肌肉样本，而在Western blotting实验中，为确保检测抗肌萎缩蛋白的灵敏度，关键步骤是使用Tris-醋酸凝胶和半干法转膜方法。
如代表性结果所示，用 Ex6A、Ex6B、Ex8A 以及包含 Ex6A、Ex6B、Ex8A 和 Ex8B 的混合物处理的成肌细胞均产生了可读框内（in-frame）的DMD产物。由于 Ex8B 未产生任何外显子跳跃产物，因此未将其用于后续的体内实验。cDNA 测序结果显示发生了外显子 6–9 的跳跃，且经 DYS-2 染色的免疫细胞化学分析显示，处理样本中肌营养不良蛋白（dystrophin）的表达得以恢复。经 AON 治疗的犬只中，肌营养不良蛋白阳性肌纤维数量显著增加，表明外显子 6–8 发生了跳跃，并产生了截短但仍具功能的蛋白。当使用 AON 混合物时，肌营养不良蛋白阳性肌纤维的比例进一步增加，且与 AON 剂量呈正相关。免疫印迹结果显示，接受全身性吗啉寡聚体（morpholino）治疗的犬只中，肌营养不良蛋白表达水平升高。骨骼肌中肌营养不良蛋白阳性纤维的表达水平存在差异；然而，经吗啉寡聚体处理的心肌组织中，肌营养不良蛋白表达改善不明显。由于肌营养不良蛋白分子量较大（427 kDa），微量蛋白的检测较为困难。为获得最佳检测效果，采用了 Tris-乙酸凝胶及半干转印法。苏木精-伊红（HE）染色显示，经吗啉寡聚体治疗的犬只肌肉组织病理学得到改善。中央核肌纤维（CNFs）是肌肉不健康的表现，反映了肌肉反复发生变性与再生的过程。与未经治疗的 CXMD 犬只相比，经吗啉寡聚体治疗的 CXMD 犬只中 CNFs 所占比例有所下降。临床评分显示，经吗啉寡聚体治疗的动物症状有所改善，例如行走和奔跑能力增强。肌肉硬度被认为可反映肌肉萎缩程度，因此被纳入评分体系&#160;59。本研究评估了大腿（后肢）肌肉的硬度，但排除了股直肌（cranial sartorius muscles），因为该肌肉在 CXMD 犬只中倾向于发生肥大而非萎缩。经治疗的犬只临床评分更低，且在 15 米奔跑测试中完成时间更短。15 米奔跑测试时间的缩短提示肌肉功能改善40。总体评分越高，表明健康状况越差，肌肉萎缩越严重。
尽管这些结果令人鼓舞，但多外显子跳跃技术仍面临诸多挑战，在该技术具备临床应用性之前仍需克服这些问题。心脏组织对反义寡核苷酸（AONs）的摄取仍然较低，这可能是由于心肌组织与骨骼肌组织之间细胞内转运机制的差异所致。在当前的给药方案下，动物实验中尚未观察到毒性效应；然而，在反义寡核苷酸鸡尾酒疗法进入临床试验之前，仍需开展更多工作以评估其长期毒性。反义寡核苷酸鸡尾酒药物的审批较为困难，因为监管机构将每种AON序列视为一种独立的药物。这意味着鸡尾酒疗法中的每种序列都必须单独进行安全性测试，从而需要更多的时间和资金投入。多外显子跳跃技术在临床应用中的另一个障碍是&#160;会产生大量功能未知的中间蛋白产物。这些蛋白可能引发不可预测的副作用，具体取决于个体的突变类型22。此外，目前可用的肌营养不良犬模型中的突变模式有限。自然发生的突变较少，且并非所有突变都适用于多外显子跳跃的研究。肌营养不良猪模型有望成为未来DMD外显子跳跃研究的良好替代模型33, 34。
DMD 犬模型相较于其他 DMD 模型具有一些优势。作为一种体型较大的动物模型，可以进行临床评分和磁共振成像（MRI），从而实现更详细的分析。由于犬属于大型动物，也更适合开展毒理学研究，且与小鼠模型相比，其疾病表型更接近人类疾病。犬模型的 DMD 基因序列也与人类更为相似23, 34, 45。
尽管在技术上具有挑战性，多外显子跳跃方法仍然可以&#160;最终受益 &#62;90%的DMD患者 24这使其成为比单外显子跳跃更优越的治疗策略，因为单外显子跳跃仅适用于少数患者群体。此外，多外显子跳跃将使我们能够选择可优化截短型抗肌萎缩蛋白功能的缺失模式。例如，缺失&#160;的&#160;杜氏肌营养不良症 外显子45至55的缺失与极轻度症状或无症状个体相关 14,19,60-63. 已在携带外显子52缺失的DMD小鼠模型中证实了外显子45-55的多外显子跳跃mdx52) 通过系统性注射 vPMO 22,26鸡尾酒疗法vPMOs的使用也在其他类型的肌营养不良症中得到验证，例如福山先天性肌营养不良症（FCMD）。FCMD由外显子捕获引起，即逆转座子插入导致异常的mRNA剪接。研究表明，vPMOs可在FCMD小鼠模型及人类细胞系中恢复正常的剪接模式。 64下一代具有更高疗效和更低毒性的反义寡核苷酸化学修饰将有助于推动多外显子跳跃策略向临床应用的有效转化。此外，多外显子跳跃技术还可能应用于其他遗传性疾病，例如 dysferlinopathies（肌萎缩蛋白缺乏症）。 24, 65.

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X连锁隐性遗传性肌肉疾病，以进行性肌无力为特征，最早由Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne（de Boulogne）博士描述1。DMD是一种常见的遗传病，全球约每3,500名男童中就有1例患病，每年约有2万名患儿出生2,3。患儿在幼儿期即出现运动发育迟缓和步态异常4，约在青少年早期需依赖轮椅。患者通常在20至30岁之间因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡5-8。目前尚无治愈DMD的方法。糖皮质激素治疗可在一定程度上延缓肌肉退化，但伴随显著的副作用，包括肥胖和糖尿病2,7,8。DMD由dystrophin（DMD）基因突变引起，导致功能性抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺失。DMD基因极大，包含超过200万个碱基对和79个外显子9,10。缺失、无义和重复突变导致阅读框移位，是引起DMD表型最常见的原因。外显子3–9和外显子45–55区域被称为“突变热点”，大多数患者的缺失突变发生于这些区域，从而导致DMD患者体内抗肌萎缩蛋白功能丧失3,9,11-16。抗肌萎缩蛋白在抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物（DGC）中发挥作用，该复合物在肌肉细胞膜稳定中具有重要作用。其中N端和C端是功能最关键的结构域，而中央杆状结构域作用相对较小3,9,17。临床观察发现，贝克尔型肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）表型较轻，该病主要由DMD基因内的同框突变引起，由此启发了外显子跳跃疗法在DMD治疗中的应用。BMD患者可表达截短但仍具功能的抗肌萎缩蛋白，且保留了N端和C端结构3,6,18。理论上，外显子跳跃可恢复阅读框，产生类似BMD患者中的截短但有功能的抗肌萎缩蛋白3,19。
已测试多种类型的反义寡核苷酸（AONs）用于临床试验，包括2'-O-甲基磷酸硫代酯（2'OMePS）和磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PMOs）。使用这些AONs跳过外显子51和53已被研究，尽管结果具有前景，但单外显子跳跃的适用性有限，因其具有突变特异性 3, 19, 20,21, 22-26关于单外显子跳跃所产生的截短型抗肌萎缩蛋白的稳定性，仍存在一些疑问 22,23此外，部分患者需要跳过多个外显子才能恢复阅读框 3尽管在技术上更具挑战性，多外显子跳跃是一种有望解决上述问题的方法 3,19多外显子跳跃此前已在肌营养不良犬和人类细胞系中得到证实 体外此外， mdx52 小鼠和犬X连锁肌营养不良（CXMD）犬模型已被用于 在体内 研究 22,24-27犬型X连锁肌营养不良日本株（CXMDJ)&#160;比格犬被用于本研究，因为其阅读框 中国台湾J 可通过外显子6和8的多外显子跳跃，或额外外显子的跳跃来恢复例如，外显子3至9）图1基于比格犬的CXMD模型与金毛猎犬肌营养不良（GRMD）模型具有相同的突变模式，但由于比格犬体型较小且饲养成本较低，因此为杜氏肌营养不良症（DMD）研究提供了一个实用的动物模型。 28,29CXMD 犬模型比啮齿类等小型动物模型更接近人类 DMD 表型，且在毒理学评估中更具可靠性 3,22,30,31 (图2CXMD 犬表现出进行性肌肉退化、步态异常以及心脏和呼吸系统问题，与 DMD 患者相似。与单外显子跳跃相比，多外显子跳跃适用于更大比例的患者。在三种最常见的突变类型（缺失、无义突变和重复）中，80% 至 98% 的患者可通过多外显子跳跃进行治疗。 14,32,33而45%的所有DMD患者可能受益于特异性跳过外显子45至55&#160;&#160;3,19,22,34.
随着修饰型吗啉代寡核苷酸的发展，反义寡核苷酸（AON）鸡尾酒疗法在促进外显子跳跃方面的效率已得到提升。富含精氨酸的细胞穿透肽偶联的磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PPMOs）以及活体吗啉代寡核苷酸（vPMOs）是两类显著增强细胞穿透能力的AON化学修饰形式。&#160;和稳定性 3,35-38人们对长期使用反义寡核苷酸（AON）可能产生的毒性仍存担忧；然而，该领域已取得显著进展。对吗啉代寡核苷酸进行的化学修饰可大幅降低脱靶效应，且临床前研究未发现明显毒性作用。 3,22,39,40多外显子跳跃疗法目前仍面临一个挑战，即每种单个反义寡核苷酸必须作为单一药物单独进行毒性测试。&#160;而不是作为混合物同时使用 3,19,22,41,42在针对心脏的杜氏肌营养不良症（DMD）研究中，无论是单外显子跳跃还是多外显子跳跃， dystrophic 心脏组织的改善均较为有限。由于细胞穿透能力差，吗啉代寡核苷酸（morpholinos）在心脏中的功效被认为较低。肽偶联的PPMOs（peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomers）已提高了&#160;AONs穿透心肌细胞，增加心脏中功能性抗肌萎缩蛋白的挽救量 3,19,38.
本文详细讨论了我们的AON鸡尾酒疗法，包括使用ESEfinder软件设计AON序列的方法43。同时描述了在犬类模型中进行多外显子跳跃实验的操作方案。外显子6和外显子8跳跃实验采用了CXMDJ 比格犬。在CXMD犬模型中，多外显子跳跃显示出良好的应用前景，但在其具备临床适用性之前，仍有一些挑战需要克服。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2'OMePS 狗成肌细胞转染&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>3 ml 6孔板</td><td>岩城</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s medium（DMEM）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P4333&amp;nbsp;</td><td>200 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Opti-MEM 培养基中总体积为 100 ml，脂质体转染试剂与核酸比例为 2:1。&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 5 mg RNA 使用 10 ml 脂质体转染试剂 Lipofectin。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;OMePS</td><td>Eurogentec&amp;nbsp;</td><td></td><td>Ex6A（GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG）、Ex6B（ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU）和Ex8A（CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>马血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&amp;nbsp;</td><td>200 &amp;#956;g/ml</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;狗肌母细胞的吗啉寡聚体转染&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;
用于培养的狗成肌细胞 MePS 转染所需全部材料</td></tr><tr><td>反义吗啉代寡核苷酸&amp;nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC&lt;br/&gt; TCAGG)&lt;br/&gt; Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG&lt;br/&gt; AGCGTT&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT&lt;br/&gt; GCTCAC&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 用opti-MEM培养基定容至100 L。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 120&amp;ndash;200 mg/kg 的吗啉寡核苷酸，溶于生理盐水中，浓度为 32 mg/ml</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫氰酸胍-苯酚-氯仿</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&amp;nbsp;毫升/孔</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;RNA提取与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>硫氰酸胍-苯酚-氯仿</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&amp;nbsp;毫升/孔</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &amp;#956;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>紫外光谱仪&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外显子5中的上游引物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 1.5 &amp;#956;10 &amp;#956;M</td></tr><tr><td>外显子10中的反向引物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 1.5 &amp;#956;10 &amp;#956;M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>一步法 RT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;互补DNA（cDNA）测序&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&amp;nbsp;</td><td>应用生物系统公司&amp;nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;肌内注射或开放性肌肉活检&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>手术工具</td><td></td><td></td><td>剪刀、手术刀、针、外科缝线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>兽用软膏&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘伏&amp;nbsp;</td><td>网络纺织品</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>手术巾&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刷洗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>面部口罩&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科手套&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>头部覆盖物&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫喷妥钠&amp;nbsp;</td><td>三菱田边制药&amp;nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott Laboratories&amp;nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>反义吗啉代寡核苷酸&amp;nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC&lt;br/&gt; TCAGG)&lt;br/&gt; Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG&lt;br/&gt; AGCGTT)&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT&lt;br/&gt; GCTCAC&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 用opti-MEM培养基定容至100 L。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 120&amp;ndash;200 mg/kg 的吗啉寡核苷酸，溶于生理盐水，浓度为 32 mg/ml</td></tr><tr><td>27&amp;nbsp;G Needles</td><td>TERUMO&amp;nbsp;</td><td>SG3-2325&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 注射器</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>压舌板&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>头孢氨苄</td><td></td><td>15 至 30 mg/kg&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td></td><td>15 至 30 mg/kg&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺&amp;nbsp;</td><td></td><td>0.01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡&amp;nbsp;</td><td>0.02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;全身注射&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>注射器输注泵&amp;nbsp;</td><td>Muromachi&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&amp;nbsp;G 型留置针</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&amp;nbsp;G Needles&amp;nbsp;</td><td>TERUMO&amp;nbsp;</td><td>SG3-2325&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 注射器</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;犬的临床评分&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>视频摄像机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>秒表&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;磁共振成像（MRI）&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 cm 直径/18 cm 长度人体四肢线圈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;肌肉取样与制备（尸检）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>硫喷妥钠&amp;nbsp;</td><td>三菱田边制药&amp;nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott Laboratories&amp;nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>黄蓍胶</td><td></td><td></td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>液氮&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>软木圆片</td><td>岩井化学&amp;nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸&amp;ndash;包被载玻片</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片显微系统&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>cm1900&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;免疫组织化学&lt;/strong&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&amp;nbsp;</td><td>诺沃卡斯特拉&amp;nbsp;</td><td>NCL-DYS1&amp;nbsp;</td><td>1:150 稀释液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>诺沃卡斯特拉&amp;nbsp;</td><td>NCL-DYS2&amp;nbsp;</td><td>1:150 稀释液</td></tr><tr><td>Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG1&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2,500 稀释度</td></tr><tr><td>Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG2&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2,500 稀释液</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>含封片剂</td></tr><tr><td>山羊血清&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保湿室&amp;nbsp;</td><td>科学装置实验室&amp;nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>培养皿载片&amp;nbsp;</td><td>Lab-tek&amp;nbsp;</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>疏水屏障笔&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm，20倍放大。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;蛋白质印迹法&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>蒸馏水&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手动匀浆器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times; Laemmli SDS上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris&amp;ndash;HCl（pH 6.6），2%（w/v）SDS，2%（0.28&amp;nbsp;M) β-巯基乙醇，20% 甘油，0.01% 溴酚蓝&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 凝胶&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）&amp;nbsp;</td><td>161-1210</td><td>5% 分离胶</td></tr><tr><td>SDS 凝胶</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>3-8%</td></tr><tr><td>PVDF膜&amp;nbsp;</td><td>通用电气</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>运行缓冲液（10&amp;times;)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris-Base，1,920 mM 甘氨酸</td></tr><tr><td>运行缓冲液（1&amp;times;)</td><td></td><td></td><td>10% 10&amp;times; 缓冲液，20% 甲醇&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05% PBS/吐温20（PBST）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>2,000 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 3&amp;times; 200 ml 用于洗涤</td></tr><tr><td>PBST/5% 脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>蛋白检测试剂盒</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸盐</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Western 印迹上样/样品缓冲液</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>阴极缓冲层</td><td></td><td></td><td>0.025 M Tris 碱 + 40&amp;nbsp;mM 6-氨基己酸 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>阳极缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.03 M Tris 碱 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>浓缩阳极缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.3 M Tris 碱 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>结蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&amp;nbsp;</td><td>诺沃卡斯特拉&amp;nbsp;</td><td>NCL-DYS1&amp;nbsp;</td><td>1:150 稀释液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用混合反义寡核苷酸在犬x连锁肌营养不良模型中实现多外显子跳跃

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

杜氏肌营养不良症（DMD）是全球最常见的致死性遗传病之一，由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因（DMD 基因）的突变引起。 dystrophin (DMD基因。外显子跳跃技术利用一类称为反义寡核苷酸（AONs）的短链类DNA/RNA分子，恢复阅读框并产生较短但具有功能的蛋白质。然而，外显子跳跃疗法面临两大主要难题：适用性有限（单种AON药物最多仅能治疗约13%的患者），以及截短蛋白功能不确定。这些问题可通过鸡尾酒式AON策略加以解决。尽管通过单个外显子跳跃（所有外显子合并计算）可治疗约70%的DMD患者，但如果能够实现使用鸡尾酒式反义药物进行多外显子跳跃，则有望治疗超过90%的DMD患者。犬X连锁肌营养不良（CXMD）犬模型的表型&#160;是&#160;与人类杜氏肌营养不良症患者更为相似，被&#160;用于测试6号和8号外显子多外显子跳跃的全身性疗效与安全性。CXMD犬模型在内含子6中携带一个剪接位点突变，导致抗肌萎缩蛋白mRNA中缺失7号外显子。 dystrophin mRNA。在CXMD中恢复读码框需要外显子6和外显子8的多外显子跳跃；因此，CXMD是用于评估多外显子跳跃疗效与安全性的良好中等体型动物模型。在本研究中，设计了一种靶向外显子6和外显子8的反义吗啉代寡核苷酸混合物，并在全身骨骼肌中恢复了抗肌萎缩蛋白的表达。本文介绍了在CXMD犬模型中转染/注射寡核苷酸混合物以及评估多外显子跳跃疗效与安全性的方法。

体外实验
为比较每种反义寡核苷酸（AON）的有效性，将成肌细胞转染至不同的 2'OMePS 处理条件下。分别使用 600 nM 的 Ex6A、Ex6B、Ex8A 或 Ex8B 进行单个 AON 处理，并使用包含全部 4 种 AON 序列、每种各 600 nM 的混合物进行鸡尾酒式处理。转染后第 4 天收集 RNA 样本。经 RT-PCR 后，各处理组样本与未经处理（NT）的样本一同进行凝胶电泳。凝胶上位置较高的条带代表移码的 DMD 产物；这些条带在未经处理（NT）、Ex8A 和 Ex8B 处理的成肌细胞中可见。Ex6A、Ex6B、Ex8A 及鸡尾酒处理组的成肌细胞则显示出同框产物。其中，鸡尾酒处理组及 Ex6A/B 处理组显示出 100% 的同框产物，而 Ex8A 仅显示出 30% 的同框产物（图 7）。为确认外显子跳跃及阅读框的恢复，进行了 cDNA 测序；结果表明外显子 6 至 9 确实发生了跳跃（图 7）。免疫组织化学结果显示，与未经处理样本相比，AON 处理的犬类样本中抗肌萎缩蛋白阳性纤维数量增加（图 8）。
体内实验
为比较不同反义寡核苷酸（AON）治疗条件的效率，对年龄在0.5至5岁的CXMD犬单次注射1.2 mg Ex6A，或不同剂量的Ex6A、Ex6B与Ex8A混合物。注射两周后采集肌肉样本，使用DYS-1染色以比较dystrophin阳性纤维的数量。所有接受混合物治疗的样本均显示dystrophin表达较未治疗（NT）样本增加，且dystrophin阳性纤维数量随AON剂量增加而上升图9）。系统注射后，对野生型（WT）、NT 和混合治疗的 CXMD 肌肉样本进行 DYS-1 染色（图10）。与未治疗的CXMD犬相比，鸡尾酒疗法处理的CXMD犬在骨骼肌（CT）和心肌样本中均显示出更高的抗肌萎缩蛋白表达。然而，经AON处理的骨骼肌（CT）中抗肌萎缩蛋白的表达水平明显高于经处理的心肌组织。通过免疫印迹法对野生型（WT）、未治疗组（NT）以及不同吗啉代寡核苷酸鸡尾酒处理组的肌肉样本进行比较，得出了相同的结论。在经处理的骨骼肌样本中，抗肌萎缩蛋白的表达水平也存在较大差异。图10）。苏木精-伊红（HE）染色显示，经处理的 CXMD 与未治疗的CXMD犬相比，治疗组犬只的组织病理学表现得到改善，中心核纤维（CNF）数量显著减少（图11）。这表明NT犬只中存在更显著的变性/再生现象，是肌营养不良性肌肉病理的征象。此外，经治疗的犬只跑步用时更短，且在临床评分量表上的得分更高。在所有评估类别中，经治疗的CXMD犬只的评分均优于未经治疗的CXMD犬只。图12).
<img alt="mRNA剪接示意图；正常与杜氏肌营养不良犬mRNA及AO处理的外显子跳跃过程。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. CXMD犬的突变模式及使用反义寡核苷酸混合物跳过外显子6-8的策略。CXMD犬在外显子6中存在一个点突变，导致杜氏肌营养不良犬mRNA中缺失外显子7。这使得mRNA读码框发生移码，无法产生抗肌萎缩蛋白（dystrophin）。设计短链反义寡核苷酸（AON）序列以结合外显子6和8，从而在mRNA剪接过程中有效跳过外显子6-8。经AON混合物处理的犬中灰色条带代表短链AON序列。外显子9编码一个铰链区结构域，在针对外显子6和8的AON作用下有时会自发被剪除。最终产生的mRNA编码的抗肌萎缩蛋白虽较短，但具有功能。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="野生型与CXMD比格犬肌肉营养不良症状比较，1岁，示意图。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 一岁犬X连锁肌肉营养不良（CXMD）动物的主要临床症状。图中显示了一只一岁的野生型比格犬和一只CXMD患病犬。自两个月龄起，通常可观察到近端肢体肌和颞肌受累；自四个月龄起，关节挛缩和骨盆移位表现明显。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="兽医外科手术、麻醉准备、手术器械、动物护理设置。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 犬的全身麻醉。A) 在异氟烷全身麻醉下进行肌肉注射和肌肉活检。B) 固定动物以进行系统性注射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较不同基因型小鼠随时间推移的脑部发育的MRI扫描图像；WT、NT、2703MA、2001MA。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 野生型、未经治疗的CXMD及经治疗的CXMD的磁共振成像（MRI）。 WT和NT型CXMD犬在3个月和5个月时的后肢MRI扫描图像。展示了两只经治疗的CXMD犬在注射反义寡核苷酸（AON）前（首次注射前1周）和注射后的后肢MRI样本图像。2703MA接受了每周7次、每次200 mg/kg混合吗啉代寡核苷酸的治疗。2001MA接受了每周5次静脉注射、每次120 mg/kg混合吗啉代寡核苷酸的治疗。对照组与治疗组犬只年龄匹配。经治疗的犬只显示出T2信号降低。图片经Yokota et al.（© 2009，John Wiley &amp; Sons）许可改编40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="对犬肢体进行手术以提取组织；包括切口和样本制备。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 犬肌肉活检操作流程。A) 固定犬的下肢以进行肌肉活检。B) 使用镊子夹持下肢。C) 暴露CT肌。采用开放活检技术获取注射部位的肌肉样本，并使用缝线标记活检样本。D) 解剖后置于黄蓍胶上的肌肉样本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质转印装置示意图，显示在电场作用下用于Western印迹的层状材料。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 半干法转印方法。 本图展示了用于Western印迹的半干法转印方法。在负极端放置三层浸透浓阳极缓冲液的滤纸；再在其上叠加三层浸有阳极缓冲液的滤纸。Mb PVDF膜先用甲醇浸泡，再用阳极缓冲液浸泡，然后铺在六层滤纸上。已浸透阴极缓冲液的凝胶轻柔地覆盖在PVDF膜上。最后，在凝胶上方放置三层浸有阴极缓冲液的滤纸，并将正极端置于最上方。系统以400 mA电流运行1小时。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR 电泳结果和测序色谱图；基因编辑分析；外显子比对。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 
图 7. CXMD 成肌细胞中的外显子跳跃。 将 Ex6A、Ex6B、Ex8A 或 Ex8B 单独转染至 CXMD 成肌细胞，或联合使用四种序列的混合物。单个序列使用总量为 600 nM，混合物中每种序列各使用 600 nM。A) 在 CXMD 犬成肌细胞中进行 2'OMePS 处理。Ex6A、Ex6B 及混合物处理的样本在预期位置显示出明显的同框外显子跳跃转录本条带。Ex8A 显示中等强度条带，Ex8B 显示微弱条带，而 NT 样本在同框位置无条带。B) 转染后第 4 天，单独使用 Ex6A 处理的 cDNA 测序结果。图片经 Yokota et al.（© 2009, John Wiley &amp; Sons）许可改编40。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜比较WT、Cocktail、Ex6A、NT中细胞生长情况；比例尺50 μm。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8. 经2'O-甲基化硫代磷酸酯（2'OMePS）转染的CXMD成肌细胞中抗肌萎缩蛋白表达增加。 将Ex6A单独或与2'OMePS鸡尾酒混合物转染至CXMD成肌细胞中。图中显示DYS-2（红色）和DAPI（蓝色）染色结果。将处理后的成肌细胞与野生型（WT）及未处理（NT）成肌细胞进行比较。图像经Yokota et al.（版权2009，John Wiley &amp; Sons）许可改编40。标尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织样本的免疫荧光显微镜图像；WT、NT、Ex6A、混合物。细胞形态比较。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 9"> 
图 9. 通过肌内注射 Morpholino 在 CXMD 犬中恢复抗肌萎缩蛋白的表达。 将单独的 Ex6A 或 Ex6A、Ex6B 与 Ex8A 的混合物注射至 CXMD 犬的 CT 肌肉中。图中显示了野生型（WT）、未治疗（NT）及治疗后 CXMD 犬的抗肌萎缩蛋白（DSY-1）染色结果。犬只分别接受 1.2 mg Ex6A 单独注射或 1.2 mg 混合物注射。图像经 Yokota et al.（© 2009, John Wiley &amp; Sons）许可改编40。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型、CXMD及PMO处理后的肌肉组织分析；包含显微镜图像和凝胶结果。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图10"> 
图10. CXMD犬经全身性混合吗啉寡核苷酸治疗后抗肌萎缩蛋白表达增加。采用抗肌萎缩蛋白（DYS-1）染色法比较野生型（WT，阳性对照）、未处理（NT，阴性对照）以及接受120 mg/kg吗啉寡核苷酸混合物（每种AON为40 mg/kg）治疗的CXMD犬的抗肌萎缩蛋白表达情况。该吗啉寡核苷酸混合物包含Ex6A、Ex6B和Ex8A。犬只每周静脉注射该混合物5次。A) 比较WT、NT和治疗组犬颅胫肌（CT）中抗肌萎缩蛋白的表达。B) 比较NT组与吗啉寡核苷酸混合物治疗组犬心脏组织中抗肌萎缩蛋白的表达。C) 显示WT、NT及接受吗啉寡核苷酸混合物治疗犬的抗肌萎缩蛋白免疫印迹图，以结蛋白（desmin）作为上样对照。治疗组犬所检测的肌肉包括：肱三头肌（TB）、肱二头肌（BB）、膈肌（DIA）、食管（ESO）、CT、内收肌（ADD）、趾长伸肌（EDL）、咬肌（MAS）和心脏。图片经许可改编自Yokota et al.（版权2009，John Wiley &amp; Sons）40。标尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="未处理与经处理组织的组织学对比图；处理后细胞结构的变化。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图11"> 
图11. 接受为期7周、每周240 mg/kg吗啉寡核苷酸混合物治疗的CXMD犬组织病理学改善。 年龄介于半年至五岁的CXMD犬，每周静脉注射一次240 mg/kg的吗啉寡核苷酸混合物（Ex6A、Ex6B和Ex8A），持续7周。末次注射后14天，取食管肌肉组织进行苏木精-伊红（HE）染色。图中显示未治疗（NT）与经吗啉寡核苷酸混合物治疗（Treated）的CXMD犬食管肌肉组织的HE染色结果（40倍物镜）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="静态平衡；PMO注射对评分的影响；折线图；科研分析。" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 12"> 
图12. Morpholino治疗后临床评分与15米跑时间的改善。Morpholino治疗的犬只与未经治疗（NT）的同窝犬进行了比较。图中误差线表示标准误（SEM）。A）计算治疗前后临床评分检查的总分，并将治疗动物与NT同窝犬进行比较。B）治疗犬与NT犬15米跑时间的比较。C）与B类似；但使用了年龄更小的犬只。图片经Yokota et al.（版权2009，John Wiley &amp; Sons）许可改编40。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>反义寡核苷酸</td>
			<td>核苷酸序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex6A</td>
			<td>GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex6B</td>
			<td>ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex8A</td>
			<td>CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 反义寡核苷酸设计。

外显子跳跃目前是一种&#160;杜氏肌营养不良症（DMD）最具前景的治疗策略。为扩大DMD患者的适用范围，并优化所产生的截短型抗肌萎缩蛋白的稳定性与功能，研究人员开发了采用鸡尾酒式反义寡核苷酸的多外显子跳跃策略，并在犬模型中实现了全身性的抗肌萎缩蛋白挽救。

利用混合反义寡核苷酸在犬X连锁肌营养不良模型中实现多外显子跳跃

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是全球最常见的致死性遗传病之一，由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因（DMD 基因）突变引起。外显子跳跃技术利用一类称为反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, AONs）的短链 DNA/RNA 类似物，恢复基因的阅读框，从而产生较短但具有功能的蛋白。然而，外显子跳跃疗法面临两大难题：适用范围有限（单种 AON 药物最多仅能治疗约 13% 的患者），以及截短蛋白功能不确定。这些问题可通过鸡尾酒式 AON 策略加以解决。尽管单个外显子跳跃（所有外显子合并计算）可覆盖约 70% 的 DMD 患者，但如果能够实现使用鸡尾酒式反义药物进行多外显子跳跃，则有望治疗超过 90% 的 DMD 患者。本研究采用表型更接近人类 DMD 患者的犬 X 连锁肌营养不良（canine X-linked muscular dystrophy, CXMD）犬模型，评估针对外显子 6 和外显子 8 的多外显子跳跃的全身性疗效与安全性。CXMD 犬模型在内含子 6 存在剪接位点突变，导致 dystrophin mRNA 中缺失外显子 7。为恢复 CXMD 的阅读框，需同时跳过外显子 6 和外显子 8，因此 CXMD 是测试多外显子跳跃疗效与安全性的良好中型动物模型。本研究设计了一种靶向外显子 6 和外显子 8 的反义吗啉代寡核苷酸（morpholino）鸡尾酒制剂，成功在全身骨骼肌中恢复了 dystrophin 蛋白的表达。本文介绍了在 CXMD 犬模型中转染/注射鸡尾酒寡核苷酸的方法，以及评估多外显子跳跃疗效与安全性的相关技术。

本实验的总体目标是评估使用反义寡核苷酸（AON）混合物在杜氏肌营养不良症（DMD）犬模型中实现多外显子跳跃的疗效和毒性。该方法有助于回答反义外显子跳跃治疗转化研究中的关键问题，例如反义寡核苷酸是否能够在大型动物模型中诱导多外显子跳跃并阻断肌营养不良蛋白的表达。在研究中使用犬模型的主要优势在于，较大动物的治疗效果可更可靠地外推至DMD患者。尽管外显子跳跃是一种针对杜氏肌营养不良症（DMD）极具前景的治疗方法，但它也可应用于其他遗传性疾病，例如先天性肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。体外实验将由本实验室主任青木义恭博士（Dr. Yoshitsugu Aoki）演示，体内实验将由本部门博士后研究员仓冈睦纪博士（Dr. Mutsuki Kuraoka）演示。根据文本方案设计反义寡核苷酸（AONs）后，使用6孔板，在3 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM培养基中，以每平方厘米1至5 × 10³个CXMD成肌细胞的密度进行接种。将细胞在37摄氏度下孵育，直至细胞融合度达到60%至80%。当细胞达到所需融合度时，使用低血清培养基将阳离子脂质体转染试剂稀释至总体积100 µL，并在室温下静置30至45分钟。随后，用低血清培养基将AONs稀释至终体积100 µL。将稀释后的转染试剂与稀释后的AONs混合，在室温下孵育10至15分钟。在此期间，移除细胞中的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞三次。随后，向转染混合物中加入0.8毫升培养基，然后将整个溶液加入 freshly washed cells 中。在37摄氏度下孵育三小时。然后向细胞中加入分化培养基（DM），并继续孵育最多10天以诱导分化。从第3天左右开始，检测分化情况。为了对犬肌母细胞进行吗啉代寡核苷酸转染，请按照本视频前面演示的方法培养 CXMD 肌母细胞。将吗啉代寡核苷酸混合物在 65 摄氏度加热 10 分钟。然后加入肽类递送试剂，并将吗啉代寡核苷酸调整至终浓度为 3 至 6 微摩尔。接下来，使用DM替换成肌细胞中的培养基，并向每孔加入终浓度为1微摩尔的吗啉代寡核苷酸。孵育16至18小时。然后，为收集细胞进行RNA提取，向细胞中加入1毫升硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液，使细胞从培养板上脱落。将细胞在室温下孵育10分钟后，转移至1.5毫升离心管中。每管加入200微升氯仿，在室温下孵育2分钟，直至出现三层分离的液体：RNA层、蛋白质层和DNA层。在4°C条件下，以12,000 × g离心15分钟。然后，去除上清液的上层部分，并转移至含有 500 微升异丙醇的离心管中。在去除上清液并保留 RNA 沉淀之前，先对上清液管进行离心。用乙醇洗涤沉淀，并在 4 摄氏度条件下以 8,000 × g 离心 5 分钟。将离心管倒置15分钟，以挥发残留的乙醇，然后加入15至30微升无RNase的水。接着使用260纳米处的紫外-可见光光谱法对RNA进行定量。进行RT-PCR时，将以下试剂混合，并加水至终体积为25微升。将样品放入热循环仪中，并运行以下程序。程序结束后，将产物保存在4摄氏度或20摄氏度。进行肌肉注射时，在按照文本方案准备动物并实施麻醉后，使用手术刀在胫前肌（CT）区域纵向切开皮肤约五厘米。为标记注射位点，使用手术针和缝合线在深筋膜上缝合，每隔两厘米做一个缝线标记，共做两个标记点。用缝合线标记注射部位非常重要，这有助于更准确地进行活检。接下来，使用27号针头将所需浓度的反义寡核苷酸（AONs）注入肌肉，并将针头留置一分钟。然后，进行开放性肌肉活检时，使用手术刀从CT肌肉中切取一段长约两厘米的肌肉组织。将肌筋膜重新覆盖在肌肉上，使用000号可吸收缝线缝合组织。然后，使用000号尼龙缝线缝合皮肤。用针头进行盐酸丁丙诺啡的肌肉注射，剂量为每千克体重0.02毫克。按照文本方案固定动物后，将静脉留置针插入肢体静脉，注入含有等量每种反义寡核苷酸（AON）的混合液。使用输液泵或注射泵，按照制造商说明书，以每分钟2.5毫升的速度在20分钟内共注射50毫升。每周或每两周重复注射一次，因为重复注射可使抗肌萎缩蛋白的表达逐渐累积。为进行每周血液检测以评估毒性，使用针头从动物前肢或后肢的皮下静脉采集三毫升血液。按照试剂盒制造商的说明，进行以下检测项目。其他进一步分析请依据文本方案执行。为了比较每种反义寡核苷酸（AON）的效果，成肌细胞被转染了各种2'OMePS处理条件。此处所示凝胶代表处理后四天收集的RNA的RT-PCR样本。凝胶上位置较高的条带代表阅读框外的DMD产物，在未经处理的Ex8A和Ex8B处理的成肌细胞中均可见到。Ex6A、Ex6B、Ex8A 和鸡尾酒疗法处理的成肌细胞均显示出框内产物。cDNA 测序证实外显子 6 至外显子 9 已被跳过。如本图所示，免疫细胞化学结果显示，经 AON 处理的狗细胞中抗肌萎缩蛋白阳性纤维较未处理样本有所增加。为了比较不同反义寡核苷酸（AON）治疗条件的效果，将CXMD犬分别注射Ex6A，或Ex6A、Ex6B和Ex8A的混合物，并设置不同剂量。经DYS1染色的肌肉样本显示，接受混合物治疗的样本中肌营养不良蛋白表达增加，且肌营养不良蛋白阳性纤维的数量随剂量增加而上升。在全身性注射后，与未经治疗的CXMD犬相比，接受混合物治疗的CXMD犬在胫骨前肌（CT）和心肌样本中均显示出更高的肌营养不良蛋白表达水平。然而，与经处理的心肌相比，经AON处理的骨骼肌中抗肌萎缩蛋白的表达水平显著更高。此外，与未经治疗的CXMD犬相比，经治疗的CXMD犬表现出改善的组织病理学特征，其中中央核纤维数量显著减少。一旦掌握操作要点，体外和体内实验若规范进行，均可在数小时内完成。在进行该操作过程中，必须密切监测犬的健康状况。系统性外显子跳跃技术的发展，为该领域的研究人员在杜氏肌营养不良症（DMD）患者中开展人体临床试验奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用反义寡核苷酸治疗犬类动物。

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