Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

本实验的总体目标是在杜氏肌营养不良症或 DMD 的狗模型中检查使用鸡尾酒反义寡核苷酸或 AON 跳跃多外显子的疗效和毒性。该方法可以帮助回答反义外显子跳跃疗法转化研究中的关键问题，例如反义寡核苷酸是否可以在大型动物模型中诱导多个外显子跳跃并破坏营养不良表达。在研究中使用狗模型的主要优点是，可以更可靠地推断大型动物的治疗结果到 DMD 患者。

虽然外显子跳跃是 DMD 非常有前途的治疗方法，但它也可以应用于其他遗传疾病，例如先天性肌营养不良症和肢带肌营养不良症。演示体外实验将由我们的实验室主任 Yoshitsugu Aoki 博士完成，演示体内实验将由我们系的博士后研究员 Mutsuki Kuraoka 博士完成。根据文本方案设计 AON 后，使用 6 孔板在含有 10% FBS 和 1%pen-strep 的 3 毫升 DMEM 中接种 1 到 5 倍 10 到每平方厘米三分之一的 CXMD 成肌细胞。

在 37 摄氏度下孵育细胞，直到 60% 至 80% 汇合。当细胞达到所需的汇合度时，使用还原血清培养基将阳离子脂质体转染试剂稀释至总体积为 100 μL，并让混合物在室温下静置 30 至 45 分钟。然后，用还原的血清培养基将 AON 稀释至最终体积为 100 μL。

将稀释的转染试剂与稀释的 AON 混合，并在室温下孵育 10 至 15 分钟。同时，从细胞中取出培养基，并使用新鲜培养基洗涤细胞 3 次。接下来，向转染混合物中加入 0.8 mL 培养基，然后将整个溶液添加到新鲜洗涤的细胞中。

在 37 摄氏度下孵育 3 小时。然后，向细胞中加入分化培养基或 DM，并孵育长达 10 天以进行分化。从第 3 天左右开始，检查差异。

为了对狗成肌细胞进行吗啉代转染，如本视频前面所示，培养 CXMD 成肌细胞。将鸡尾酒吗啉代在 65 摄氏度下加热 10 分钟。然后加入肽递送试剂，并将吗啉代调节至终浓度为 3 至 6 微摩尔。

接下来，使用 DM 替换成肌细胞中的培养基，并将吗啉代添加到每个孔中，终浓度为 1 微摩尔。孵育 16 至 18 小时。然后，为了收集细胞进行 RNA 提取，向细胞中加入 1 毫升硫氰酸胍-苯酚-氯仿，使其从板中分离。

在室温下孵育细胞 10 分钟后，将细胞转移到 1.5 mL 试管中。向每管中加入 200 微升氯仿，并在室温下孵育 2 分钟，直到可以看到三个独立的层，即 RNA 层、蛋白质层和 DNA 层。以 12， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心到试管中 15 分钟。

然后，去除顶层上清液并转移到含有 500 μL 异丙醇的试管中。在去除上清液并保存 RNA 沉淀之前，旋转上清液管。用乙醇洗涤沉淀，并以 8， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。

倒置试管 15 分钟以蒸发残留的乙醇，然后加入 15 至 30 μL 不含 RNase 的水。然后，使用 260 纳米的紫外-可见光谱法定量 RNA。要进行 RT-PCR，请将以下试剂混合在一起，并加水至最终体积为 25 μL。

将样品放入热循环仪中并运行以下程序。运行完成后，将产品储存在 4 摄氏度或 20 摄氏度。为了进行肌肉注射，在准备动物进行手术并根据文本方案进行麻醉后，使用手术刀在颅胫骨上纵向切割约 5 厘米的皮肤，或 CT.To 标记注射部位，使用手术针和手术线通过以 2 厘米的间隔制作两个缝合标记来缝合深筋膜。

用线标记注射部位非常重要，因为这样可以进行更准确的活检。接下来，使用 27 号针头将所需浓度的 AON 注射到肌肉中，然后将针头插入一分钟。然后，要进行开放性肌肉活检，请使用手术刀从 CT 肌肉中取出一块约 2 厘米长的肌肉组织。

将肌肉筋膜放回肌肉上，并使用 000 可吸收线闭合组织。然后，使用 000 尼龙线闭合皮肤。使用针头肌肉注射每公斤盐酸丁丙诺啡 0.02 毫克。

要将含有等量每种 AON 的鸡尾酒注射到肢体静脉中，同时根据文本协议握住动物，将静脉留置针插入肢体静脉。按照制造商的说明，使用输液泵或注射器驱动器，以每分钟 2.5 毫升的速度注射总共 50 毫升，持续 20 分钟。每周或每两周重复注射，因为抗肌萎缩蛋白表达会随着重复注射而积累。

要每周进行血液检查以检查毒性，请使用针头从前肢或后肢的皮下静脉之一采集 3 毫升血液。按照制造商的说明，包括以下评估。根据文本协议进行进一步分析。

用各种 2'OMePS 处理条件转染成肌细胞，以比较每种 AON 的有效性。此处显示的凝胶代表处理后 4 天收集的 RNA 的 RT-PCR 样品。凝胶上较高的条带代表框外 DMD 产物，在未处理的 Ex8A 和 Ex8B 处理的成肌细胞中可见。

Ex6A、Ex6B、Ex8A 和混合物处理的成肌细胞显示框内产物。cDNA 测序证实外显子 6 至 9 被跳过。如图所示，免疫细胞化学显示，与未处理的样品相比，AON 处理的狗细胞增加了抗肌萎缩蛋白阳性纤维。

为了比较各种 AON 治疗条件的疗效，CXMD 犬注射了 Ex6A 或不同剂量的 Ex6A、Ex6B 和 Ex8A 的混合物。DYS1 染色的肌肉样品显示，在鸡尾酒处理的样品中，抗肌萎缩蛋白表达增加，抗肌萎缩蛋白阳性纤维随着抗肌萎缩蛋白剂量的增加而增加。全身注射后，与 NT CXMD 狗相比，鸡尾酒处理的 CXMD 狗在 CT 和心肌样本中均显示出抗肌萎缩蛋白表达增加。

然而，与治疗的心肌相比，AON 治疗的骨骼肌显示出高得多的抗肌萎缩蛋白表达。此外，与 NT CXMD 犬相比，接受治疗的 CXMD 犬的组织病理学有所改善，中央有核纤维显着减少。一旦掌握，如果作得当，体外和体内实验都可以在几个小时内完成。

在尝试此程序时，仔细监测狗的健康状况很重要。系统性外显子跳跃发展后，为该领域的研究人员在 DMD 患者中开展人体临床试验铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何用反义寡核苷酸治疗狗有了很好的了解。