Name: 采用微计算机断层扫描对肿瘤发展的评估和后续反应来治疗肺癌的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解使用微计算机断层扫描技术评估小鼠肺腺癌模型中肿瘤结节发育的方法。该技术可实时监测肿瘤大小变化和治疗反应，提高肺癌研究效率并减少实验动物使用数量。

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本研究由日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）对 A.E.H.（资助号 25461196）和 T.B.（资助号 23390218 和 15H04833）的科研资助以及美国国立卫生研究院基金 HL111190（D.M.O.）资助。作者谨此感谢山本美幸在动物基因分型及组织切片制备过程中提供的帮助。我们感谢庆应义塾大学医学院协作研究资源中心在技术支援和试剂方面提供的支持。

动物实验已获庆应义塾大学机构动物护理与使用委员会批准。
注意：在本研究中，我们使用了 Sftpc-rtTA 和 Tre-Fgf9-ires-eGfp 双转基因小鼠，通过喂食含有强力霉素的饲料诱导后，这些小鼠会迅速发生肺腺癌6,7。然而，所有评估步骤均可应用于其他肺癌小鼠模型。
1. 实验概述：
<ol>
	<li>确定基线状态下肺部的情况：
	<ol>
		<li>在肿瘤诱导前，当DT小鼠年龄为8至12周时，进行首次微型CT扫描（见下文第2和第3节）。该扫描作为肺部基线影像，用于确认是否存在由转基因渗漏导致的自发性结节，并记录肿瘤诱导前肺部无任何已存在的病理改变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动肿瘤诱导：
	<ol>
		<li>将DT小鼠从普通饲料转换为含多西环素的饲料，以诱导肺泡细胞中成纤维细胞生长因子（FGF9）的表达，从而启动肿瘤发育。自由提供含多西环素饲料（200 ppm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认小鼠肺部肿瘤结节的形成：
	<ol>
		<li>进行微型CT扫描，与诱导前扫描结果对比，以确认肿瘤结节的出现和发展。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估对治疗的反应：
	<ol>
		<li>为检测微型CT能否识别治疗后肿瘤结节的变化，给予FGF受体（FGFR）抑制剂AZD4547，随后在治疗5周和10周后分别进行额外的微型CT扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终点评估：
	<ol>
		<li>处死所有接受治疗及对照组小鼠，并采集组织进行组织学评估（见下文第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备小鼠以进行显微CT图像采集：
<ol>
	<li>打开微型CT扫描仪和计算机。</li>
	<li>点击名为 &#34;R_m CT2&#34; 的软件，然后点击 &#34;warm up&#34;。</li>
	<li>从微型CT腔室中取出用于放置小鼠的样品床，并用塑料薄膜包裹样品床。</li>
	<li>通过向麻醉蒸发器中加入异氟烷至指定刻度线，设置麻醉诱导箱；将异氟烷流速设定为 3 L/min。</li>
	<li>打开氧气瓶，使氧气开始流入诱导箱，并将氧气流速设定为 1 L/min。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉诱导箱中，并通过观察其是否无自主活动以及对皮肤夹捏（轻轻夹起一小褶皮肤，不造成组织损伤或皮肤破损）无反应来确认其已处于深度麻醉状态。</li>
	<li>使用眼用润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>打开微型CT腔室，将小鼠背侧朝上放置于样品床上。固定小鼠头部，并从其下肢向下牵拉身体，以对称地拉伸并伸直身体。</li>
	<li>关闭流向诱导箱的麻醉气体，转而打开通向微型CT腔室连接管路的麻醉气体。</li>
	<li>将麻醉管置于小鼠鼻部，以持续给予麻醉剂。</li>
	<li>为固定小鼠位置，需用塑料薄膜将小鼠及其所处的样品床一起包裹。 
	注意：在整个扫描过程中，必须确保小鼠处于深度麻醉状态，并牢固包裹于样品床上，因为任何轻微的身体移动或扭转均会导致图像模糊，影响结果判读。</li>
	<li>关闭微型CT腔室。</li>
	<li>将微型CT系统参数调整为 90 kV 和 160 µA，扫描时间为 4.5 min；图像范围设为 24 × 19 mm，体素尺寸设为 50 × 50 × 50 µm；采用同步模式采集心跳信号。</li>
	<li>在 &#34;Database&#34; 中新建一个文件夹，用于保存本次扫描获得的图像。</li>
	<li>开始扫描。</li>
	<li>扫描完成后，将小鼠转移至空笼中，并持续观察直至其恢复意识。在小鼠完全从麻醉作用中恢复之前，不得将其与其他小鼠合笼饲养。</li>
</ol>
3. 诱导前微型CT图像的可视化与分析：
<ol>
	<li>要可视化微计算机断层扫描（micro-CT）图像，请从以下网站下载免费的 ImageJ 软件：<a href="http://imagej.nih.gov/ij/"> http://imagej.nih.gov/ij/</a> 注意：每个微型CT数据文件均由约500个TIF文件（.tif）堆叠而成。也可使用其他图像浏览软件。</li>
	<li>打开串行的微型CT图像文件，从颈部到腹部或从腹部到颈部，逐幅浏览每只小鼠的所有图像。</li>
	<li>利用未经处理的野生型小鼠的扫描图像，结合小鼠解剖学知识，识别胸部不同区域的密度及正常解剖结构（参见 图1A).
	<ol>
		<li>用计算机鼠标控制光标，从灰白色腹部内脏和膈肌处开始，向上滚动，经过胸部直至颈部。</li>
		<li>确定骨性胸廓的解剖标志（前方为胸骨，后方为椎骨，两侧为肋骨）。</li>
		<li>识别胸腔前部的心脏以及心脏附近和纵隔内的主要血管。</li>
		<li>观察气管管腔（在颈部和上胸部水平呈现为一个小的深色圆圈），其分为左、右主支气管，随后继续分支为越来越细的支气管。注意每条支气管均与两至三条血管紧密伴行。图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始检查未诱导的DT小鼠的扫描图像，并识别是否存在任何异常。
	<ol>
		<li>排除诱导前肺部影像异常的小鼠（例如， 结节，肺气肿性大疱， 等等。）不再参与任何后续实验。图1C-E，G，H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤诱导：
<ol>
	<li>对于肺部扫描正常的实验小鼠，通过将其食物从普通饲料更换为含多西环素的饲料（200 ppm），以诱导肿瘤发育。</li>
</ol>
5. 随访扫描：
<ol>
	<li>10 周后，对所有小鼠进行第二次显微 CT 扫描，以确认其肺部肿瘤结节的形成（见图 2）。</li>
	<li>将小鼠分为两组。一组给予 FGFR 抑制剂 AZD4547（通过胃管给药，125 µg/kg/天，每周 6 天，持续 10 周），另一组对照组给予安慰剂，持续 10 周。</li>
	<li>在 4 至 5 周后进行第三次扫描，以随访结节阴影的变化情况。</li>
	<li>在完成 10 周治疗后，进行第四次扫描。</li>
	<li>通过吸入 CO2 或腹腔注射戊巴比妥（0.1 mg/200 µl）处死所有小鼠。</li>
	<li>为识别肿瘤结节在诱导后及治疗过程中的动态变化，需在同一只小鼠不同时间点的连续扫描图像中定位相似位置，并观察任何异常阴影的出现或消失情况（图 3）。</li>
	<li>为便于在不同时间点识别同一只小鼠的相同切面，应将目标切面与小鼠胸腔内的解剖标志结构相关联。
	<ol>
		<li>可使用气管、气管分叉、左右主支气管、主动脉、膈肌以及大血管等作为解剖标志。 
		注意：胸骨结构（包括胸椎、肋骨和胸骨）作为定位标志的可靠性较低，因为小鼠在样本床上常存在轻微倾斜，容易导致扫描位置误判。同样，扫描文件中的图像序列编号也不适合作为长期追踪相同位置的依据，因为小鼠体长在不同时间点可能发生改变。若在不同时间点未能准确识别相同切面，可能导致结果出现假阳性或假阴性判断。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 小鼠安乐死&#160;和肺组织采集：
<ol>
	<li>用 CO 处死小鼠2 通过吸入或腹腔注射 0.1 mg/200 µl 戊巴比妥钠。</li>
	<li>沿腹壁纵向切开以暴露腹腔脏器。通过解剖腹主动脉放血，以减少肺部血容量。</li>
	<li>用精细剪刀剪开膈肌，这将导致胸腔负压丧失，从而使肺脏塌陷。通过剪除并移除前胸壁部分肋骨，暴露肺脏和心脏。剪开颈部前方的皮肤和软组织，清理后暴露气管。</li>
	<li>剪除心脏和胸腺。将镊子插入气管后方，以分离气管与食管。</li>
	<li>用G24套管插入气管，然后通过收紧套管插入部位周围的缝线将其固定。</li>
	<li>通过气管插管，利用25 cm水柱压力，将冰冷的4%多聚甲醛（PFA）灌注并固定肺组织。取下插管，扎紧缝线以防止PFA泄漏，随后切断气管上段与喉部相连的部分。</li>
	<li>将气管从缝合线中抽出，分离其附着点，并继续向下分离，连同肺一起取出 en-块。将其放入含有5 ml 4%多聚甲醛（PFA）的15 ml离心管中。将肺组织在PFA中固定过夜，以确保固定液充分渗透和完全固定，随后将组织处理成标准石蜡包埋块。8.</li>
	<li>使用切片机将石蜡包埋组织切成6 μm厚的切片，并采用标准技术进行苏木精-伊红染色.</li>
</ol>
7. 组织学评估：
注意：此处描述了使用&#34;切片扫描仪&#34;进行数字组织学评估的方法，但也可使用常规显微镜进行视觉组织学评估。
<ol>
	<li>打开切片扫描仪设备和计算机。</li>
	<li>点击 &#34;NDP scan&#34; 软件。</li>
	<li>选择扫描模式 &#34;Batch of slides&#34; 和 &#34;Semi-Auto Mode&#34;，以对一系列切片进行扫描。 
	注意：在连续扫描过程中，负责抓取切片的机械臂对玻片边缘的任何不规则情况都非常敏感。</li>
	<li>在将玻片装入仪器前，用手触摸检查所有玻片的边缘。如果盖玻片或封片介质有突出或干燥残留，需用刀片或手术刀将其清除。</li>
	<li>将切片装入切片盒中。打开标本舱门，将切片盒推入位置 &#34;one&#34;，然后关闭舱门。</li>
	<li>在计算机软件中，为切片盒中每个位置对应的切片输入简短的描述性名称，然后点击 &#34;OK&#34; 按钮。</li>
	<li>选择扫描模式：&#34;Brightfield&#34;。</li>
	<li>点击 &#34;Start Batch&#34; 开始初步扫描。 
	注意：当设备完成所有切片的扫描后，软件将自动检测每张切片上组织所在区域，并将其标记为感兴趣区域。</li>
	<li>如有需要，可通过按住鼠标左键并拖动区域边界来重新定义感兴趣区域。 
	注意：若将切片上过大的区域定义为感兴趣区域，将显著延长扫描时间。</li>
	<li>当对所有切片的感兴趣区域均满意后，点击 &#34;Scan&#34; 开始对所有切片进行扫描。 
	注意：扫描后的文件可数字方式以低分辨率和高分辨率查看，图像可导出为 JPEG 文件。</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int. J. Cancer. 136, 359-386 (2015).</li>
<li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> Am. J. Transl. Res. 15, 114-118 (2014).</li>
<li>Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small-cell+lung+cancers%3A+a+heterogeneous+set+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases.</a> Nat. Rev. Cancer. 14, 535-546 (2014).</li>
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<li>Santos, A. M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J. L., Puré, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+fibroblast+activation+protein+inhibits+tumor+stromagenesis+and+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeting fibroblast activation protein inhibits tumor stromagenesis and growth in mice.</a> J Clin Invest. 119, 3613-3625 (2009).</li>
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<li>Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Engineering+transgenic+constructs+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview: Engineering transgenic constructs and mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述基于显微CT的方法可用于实时识别肺部异常，并监测肺癌动物模型中肿瘤结节的发展及对治疗的反应，这将帮助开展肺癌相关实验的科研人员设计出更精确、高效的实验方案，同时节省时间和资源。我们此前曾使用磁共振成像（MRI）实现相同目的6。然而，MRI在肺结节检测中的扫描清晰度及检出阈值均逊于本研究中所述的显微CT扫描6。
以往使用类似肺腺癌小鼠模型的研究（具有不同的遗传背景和肿瘤诱导方法）显然存在多个缺陷，而这些缺陷若采用微型CT扫描本可避免或改进9,10。这些研究无法识别诱导前存在的肺部异常或结节，因而可能因纳入不合适的动物而导致结果混杂。此外，它们也无法确认诱导后或在将癌细胞移植至野生型小鼠（以诱导继发性肿瘤）后是否成功形成肿瘤，因此不得不等待4至8个月，随后盲目处死&#160;小鼠，再通过组织学方法鉴定肿瘤。当这些模型用于评估药物治疗潜力时，研究人员必须设置多个组别，并按时间顺序依次处死&#160;小鼠，通过组织学检测治疗对肿瘤结节的影响，并确定治疗效果的最大时间点11。
<p cla...

肺癌是全球癌症死亡的首要原因1。目前，世界各地的许多研究中心正在持续开展关于肺癌预防、早期检测和治疗的研究2,3。研究人员已开发出多种肺癌动物模型，这些模型在研究肺癌发生机制和起源细胞、确定癌症干细胞的存在，以及评估各种新型治疗策略方面已被证明具有重要价值4。早期的模型主要依赖于在敏感品系小鼠中通过致癌物诱导肿瘤发生5。随着基因敲除和转基因小鼠模型的发展，通过特异性操控遗传损伤来诱发肺癌，已显著提高了我们对肿瘤诱导的控制能力，并能更好地模拟人类肺癌的多个方面4。然而，肺癌动物模型应用中的一个主要挑战在于缺乏一种能够实时准确识别和监测小鼠肺部肿瘤发生与发展的方法，也无法记录后续肿瘤大小的变化，例如在治疗干预下的持续生长或缩小。这一局限性迫使研究人员不得不采用多种耗时、费力且耗费资源的技术来识别肿瘤并评估实验结果。由于不同小鼠对肿瘤诱导的反应存在固有的个体差异，每个实验组都需要使用大量动物以降低数据变异性。无法实时评估肿瘤生长或对治疗的反应，导致研究人员在长期实验方案中不得不盲目地在多个时间点处死&#160;小鼠，以确保获得所需数据，结果造成在过早或过晚时间点采集的样本资源浪费。
本研究介绍了一种利用小型动物显微计算机断层扫描（micro-CT）设备在活体小鼠中检测并随访肺部肿瘤的方法。我们使用了近期报道的 Sftpc-rtTA 与 Tre-Fgf9-ires-eGfp 双转基因（DT）小鼠模型，该模型在多西环素诱导后可迅速发展为肺腺癌6,7。micro-CT 的应用使我们能够（除其他用途外）在诱导前排除存在异常肺部病变的小鼠，诱导后确认肺部肿瘤结节的形成，并观察肿瘤结节对实验性治疗的反应变化。对小鼠实施终点安乐死&#160;及后续组织学评估验证了micro-CT实时检测结果的准确性。我们认为，该技术将有助于更科学地设计基于肺癌动物模型的实验，节约宝贵资源，缩短观察周期，并提高实验结果的准确性与理解深度。

<table><tbody><tr><td>微计算机断层扫描（micro-X-ray&amp;ndash;computed tomography）</td><td>Rigaku</td><td>R_mCT2</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer RS 数字病理系统</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>RS C10730</td><td></td></tr><tr><td>NDP.view2&amp;nbsp;查看软件</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>U12388-01</td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器 - 漏斗加注式</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>诱导室，2 L&amp;nbsp; 宽9.5 &amp;times; 深23 &amp;times; 高9.5</td><td>VETEQUIP</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Mylan</td><td>ES2303-01</td><td></td></tr><tr><td>AZD 4547</td><td>LC Labratories</td><td>A-1088</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Kyoritsu</td><td>SOM02-YA1312</td><td></td></tr><tr><td>G24 套管&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SP-FS2419</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>SLC Japan/PMI Nutrition International</td><td>5TP7</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件&amp;nbsp;</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Puralube vet 眼用软膏（眼部润滑剂）</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微型计算机断层扫描评估肺癌小鼠模型中肿瘤的发展及治疗反应的随访

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

肺癌是全球致死率最高的癌症。目前全球正在积极开展研究，以寻找肺癌的新疗法。多种肺癌小鼠模型正被用于研究癌症发生机制，并尝试不同的治疗策略。然而，由于缺乏一种能够实时识别小鼠肺部肿瘤结节形成并监测其大小变化的技术，难以准确描述疾病进展过程以及对治疗的及时反应。本研究介绍了一种利用微型计算机断层扫描（micro-CT）技术检测肺腺癌小鼠模型中肺部肿瘤发生的方法。接着，我们展示了通过每月进行micro-CT随访，可以识别肺部肿瘤的动态变化，例如新结节的出现、先前检测到的结节体积增大，以及治疗后结节缩小或完全消退。最后，通过终点组织学定量分析验证了该实时评估方法的准确性。该技术为开展更复杂的肺癌动物模型实验提供了可能，有助于更深入理解癌变机制及不同治疗方式的效果，同时节省了时间和资源。

在基线时对小鼠进行肺部异常的识别。在肿瘤诱导前，当DT小鼠年龄为8至12周时，对所有小鼠的肺部进行微型CT扫描。令人意外的是，约50%的小鼠显示出异常，导致我们认定其不适合纳入后续研究。这些异常表现为结节样阴影、大的单个或多个小肺气肿性大疱和/或肺叶不张。图1A、C、D-E、G-H）。然后， FGF9 转基因和肿瘤诱导被激活。仅对显示正常肺部扫描（无异常）的小鼠，从普通饲料更换为多西环素饲料以诱导 FGF9 肺泡细胞中的表达及随后的肿瘤形成。为确认在肿瘤诱导开始十周后小鼠肺部肿瘤结节的形成，进行了随访的微型CT扫描。结果显示，所有小鼠均形成了多个大小不一的结节图2， 比较 A 到 B 和 D 到 E）。采用显微CT扫描评估治疗反应，结果显示，经FGFR抑制剂AZD4547处理10周的小鼠，其治疗前扫描中可见的结节大小明显缩小或消失<st...

我们描述了一种利用微型计算机断层扫描（micro-computed tomography）在肺腺癌小鼠模型中检测肺部肿瘤结节形成的方法，并可用于长期监测结节大小随时间及治疗干预后的变化。该评估的准确性已通过终点组织学定量分析得到验证。

肺癌是全球致死率最高的癌症。目前，全球正在积极开展深入研究，以寻找肺癌的新疗法。多种小鼠……

本视频的总体目标是明确使用微型CT（Micro CT）在肺癌小鼠模型中评估肿瘤发展、治疗反应及其他实验时所具有的优势。该方法有助于在利用小鼠模型研究肺癌领域中的关键问题时提供答案，例如肿瘤何时开始生长、生长速率如何，以及对治疗干预的反应情况。该技术使我们能够识别出应从研究中剔除的动物个体，同时实时监测其肿瘤大小的变化。该技术可节省时间和精力，并显著减少每个研究组所需的小鼠数量。从 Micro-CT 扫描仪进入计算机控制系统，打开名为 RMCT2 的软件包，然后启动预热循环。接下来，通过用塑料包裹的方式准备用于小鼠的扫描仪样品台。接下来，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过皮肤夹捏法确认其是否已进入麻醉状态。轻轻夹捏一小褶皮肤即可。随后，涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。将小鼠背侧朝上放置在样品台上。固定小鼠头部，并从后肢向下牵拉身体，使身体对称地伸展并拉直。然后，将麻醉气体导入麻醉舱，并将气体导管置于动物鼻部附近，以维持持续麻醉。然后用塑料膜包裹小鼠和样品床，以固定小鼠位置。务必确保小鼠固定牢固，因为在扫描过程中任何移动或扭转都会导致图像模糊、无法使用。现在关闭扫描舱，将系统参数调整为90千伏和160微安，并将扫描时间设为4.5分钟。将图像范围设置为24毫米。然后，将系统设为与心跳同步模式。接着，在数据库中为新图像创建一个新文件夹并开始扫描。扫描完成后，将小鼠转移至一个空的笼子中，并持续观察直至其恢复意识。在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得将其放回同笼饲养的同伴中。在 ImageJ 中打开串行微型 CT 图像文件，逐张浏览每只小鼠从颈部到腹部或从腹部到颈部的所有图像。现在，利用未处理的野生型小鼠的扫描图像，识别胸部不同区域及正常解剖结构的密度。向上滚动，观察浅白色的腹部内脏和膈肌，识别从胸部至颈部的区域。注意骨性胸廓的解剖标志，包括胸骨、椎骨和肋骨。然后，在胸部前方识别心脏，以及靠近心脏和纵隔内的主要血管。气管管腔在颈部和上胸部水平呈现为一个小的暗色圆圈，其分为左右主支气管，随后继续分支为越来越细的支气管。注意每条支气管均与两至三条血管紧密伴行。现在开始检查未诱导的DT小鼠的扫描图像，识别是否存在任何异常。将诱导前肺部影像出现异常（如结节或肺气肿性大疱）的小鼠排除在实验之外。本实验应选用肺部扫描正常且可诱导产生FGF9肿瘤的小鼠。为诱导肿瘤，以每百万份200份的剂量在小鼠饲料中添加强力霉素。10周后，对这些小鼠进行第二次微型CT扫描，以确认其肺部已形成肿瘤结节。随后将小鼠分为两组。通过胃管给予一组受试对象FGFR抑制剂AZD4547，每周6天，持续10周；给予另一组受试对象安慰剂。在治疗开始后四周至五周进行第三次扫描，以随访结节阴影的变化。随后，在完成为期10周的全程治疗结束时，进行第四次扫描。通过比较不同时间点系列扫描图像中相同位置的肿瘤结节，识别其对治疗产生的动态变化。观察任何异常阴影的出现或消失。准确地定位到相同的解剖位置对于结果判读至关重要。使用胸腔内易于识别的解剖标志，例如气管、气管分叉、左右主支气管、主动脉和大血管以及膈肌。由于体位倾斜，骨骼作为解剖标志的实用性降低。在处死小鼠并暴露其颈部和肺部后，剪除心脏和胸腺。将镊子插入气管后方，以分离气管与食管。接下来，使用 G24 套管对气管进行插管，并通过结扎套管周围气管处的缝合线固定套管。随后，经套管以 25 cm 水柱压力将冰冻的 4% PFA 灌注至肺部，使肺膨胀并固定。然后，移除套管并收紧气管上的结扎线，以防止 PFA 泄漏。现在，剪断上段气管，包括其与喉部相连的部分。在从缝合线拉出气管的同时，将气管和肺从所有附着组织中分离。随后，将气管连同肺整体完整取出。将组织放入含有5 ml室温4% PFA的15 ml离心管中。肺组织在PFA中固定过夜，以确保固定液完全渗透和充分固定。随后，按常规步骤处理组织。在本研究的初步筛选中，约一半的8至12周龄DT小鼠在Micro-CT扫描中显示出肺部异常，因此不适合纳入研究。研究中，肿瘤诱导持续10周，随后开始治疗。接受FGFR抑制剂AZD4547治疗10周的小鼠，其治疗前扫描中可见的结节消失或体积减小。另一方面，接受安慰剂的对照组小鼠则显示结节大小无变化、增大和/或出现新的结节。对肺组织进行终点组织学评估，结果证实了Micro-CT扫描结果的准确性。经判断肺部清晰的小鼠，其肺组织学确实表现为正常。而出现异常的小鼠则表现出多种组织学改变，包括水疱和结节。经多西环素诱导10-12周后，所有动物均出现多个大小和位置不一的腺癌结节。随后使用FGFR抑制剂治疗10-12周后，结节数量减少且体积变小。观看本视频后，您应能够充分了解如何使用微型CT（Micro-CT）评估小鼠肺部肿瘤的发育情况，并跟踪这些肿瘤在不同实验处理下的变化。一旦掌握操作流程，每只小鼠的扫描可在不到10分钟内完成。在进行该操作时，必须始终确保小鼠处于深度麻醉状态，并牢固地固定在样品床上，以尽量减少扫描过程中的移动。该技术开发后，为肺癌和肿瘤干细胞领域的研究人员探索肿瘤发展的程度、进展性消退以及设置不同实验提供了可能。切记，X射线操作可能存在危险。进行此操作时，应始终遵循标准的机器运行规程。

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