Name: 完整的工作流程为组蛋白翻译后修饰的分析采用自下而上质谱法:从组蛋白提取数据分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程，包括组蛋白提取、衍生化、消化和纳米流液相色谱分析。该方法可在2-3天内同时定量多种PTM，为染色质生物学和表观遗传学研究提供可靠技术。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（DP2OD007447、R01GM110174 和 R01AI118891）的资助。

1. 从培养物中收集细胞
<ol>
	<li>若细胞为悬浮培养，以300 rcf离心5分钟收集细胞。若为贴壁细胞，吸除并弃去培养基，用不含Ca2+和Mg2+的PBS（以下简称PBS）冲洗贴壁细胞。加入足量胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液（浓度为0.025%–0.5%，根据细胞系而定），使其覆盖培养皿表面，于37 °C孵育至细胞脱落（不同细胞系所需时间不同）。</li>
	<li>以300 rcf离心5分钟收集细胞，再用PBS洗涤两次，每次均通过离心收集细胞。</li>
	<li>根据1.8 ml离心管或15 ml锥形管上的刻度，大致估算细胞压积体积。 
	注意：此时来自培养的细胞可迅速在液氮中冷冻，并长期保存于-80 °C。</li>
</ol>
2. 从完整细胞中分离细胞核
<ol>
	<li>将细胞置于冰上解冻。</li>
	<li>将核分离缓冲液（NIB，表 1）置于冰上解冻。</li>
	<li>每 100 µl 压实细胞体积准备约 5 ml NIB 缓冲液（表 1）。每 1 ml NIB 缓冲液中加入以下蛋白酶抑制剂和稳定剂：1 µl 1 M DTT、2.5 µl 200 mM AEBSF、2 µl 2.5 µM 微囊藻毒素和 2 µl 5 M 丁酸钠。此后，含抑制剂的 NIB 缓冲液均简称为 NIB。 
	注意：若研究组蛋白磷酸化，需加入不含 EDTA 的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。</li>
	<li>取已配制好的 NIB 缓冲液的五分之一体积，加入 NP-40 替代物（表 1），使其终浓度为 0.2%。剩余的五分之四体积用于后续洗涤步骤。</li>
	<li>用细胞沉淀与不含 NP-40 替代物的 NIB 以 1:10（v/v）比例混合洗涤细胞沉淀。在 700 rcf 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀置于冰上，加入含 0.2% NP-40 替代物的 NIB 缓冲液（细胞沉淀与缓冲液体积比为 1:10，v/v），进行细胞裂解。</li>
	<li>若从组织样本中提取，可使用研钵和研杵或 Dounce 匀浆器进行匀浆；培养细胞可通过轻柔吹打实现匀浆。</li>
	<li>将匀浆后的细胞在冰上孵育 5–10 分钟。细胞将发生裂解并释放细胞核。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,000 rcf 离心 5–10 分钟。沉淀主要含有细胞核，上清液主要含有胞质成分。如需，可保留胞质组分。</li>
	<li>用不含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液以 1:10（v/v）比例轻柔重悬核沉淀进行洗涤。 
	注意：此洗涤步骤旨在提取组蛋白前彻底去除残留的去垢剂。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,000 rcf 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 2.10–2.11 至少两次，以完全去除 NP-40 替代物。当洗涤过程中轻柔吹打不再产生气泡时，表明 NP-40 替代物已被有效去除。</li>
	<li>从组织中提取组蛋白的操作：
	<ol>
		<li>用预冷的 NIB 缓冲液冲洗新鲜或已解冻的组织。</li>
		<li>将组织转移至置于冰上的培养皿中，并加入适量 NIB 缓冲液以保持组织湿润。</li>
		<li>用剃刀将组织切成尽可能小的碎片（&#60; 1 mm），以增加细胞核分离时的接触表面积。</li>
		<li>将切碎的组织转移至预冷的匀浆器中，并用移液器反复吹打以在 NIB 中洗涤。</li>
		<li>在 300 rcf 条件下离心 5 分钟，弃去缓冲液。</li>
		<li>按细胞与缓冲液体积比 1:10（v/v）加入含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液，并进行 5–10 次匀浆操作。</li>
		<li>检查细胞裂解情况，并根据需要重复匀浆。细胞是否裂解良好的一个指标是沉淀体积明显减少，最终沉淀应仅含细胞核。</li>
		<li>在 700 rcf 条件下离心 5 分钟，保留沉淀。该沉淀可用含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液（体积比 1:10，v/v）再提取 1–2 次；此阶段组蛋白已从染色质中释放，沉淀体积显著缩小。</li>
		<li>用 2–3 ml 不含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液洗涤两次，以去除残留的去垢剂。 
		注意：中间暂停点：样品可用最小体积的 NIB + 5% 甘油重悬，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从细胞核中提取和纯化组蛋白
注意：组蛋白富含碱性氨基酸残基，因此能够与DNA的磷酸骨架紧密结合。组蛋白是细胞核中最碱性的蛋白质之一，因此可在冰冻的硫酸（0.2 M H2SO4）中提取，从而最大限度地减少非组蛋白的污染，因为非组蛋白会在强酸中沉淀。随后可使用高浓度的三氯乙酸（TCA）（终浓度为33%）从硫酸溶液中沉淀组蛋白。TCA以100%浓度储存于棕色瓶中，置于4 °C保存。
<ol>
	<li>通过轻柔吹打，将细胞核重悬于体积比为1:5的预冷0.2 M H2SO4（表1）中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以恒定旋转或轻柔振荡孵育样品2–4小时。通常情况下，对于细胞沉淀体积超过500 µl的样品，2小时的提取已足以提取组蛋白；延长孵育时间可能导致其他碱性蛋白被共同提取。对于较小的核沉淀（&#60; 200 µl），建议孵育4小时以获得更高的得率。</li>
	<li>在4 °C下以3,400 rcf离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新离心管中。</li>
	<li>重复步骤3.3–3.4，以去除任何不溶性物质。</li>
	<li>为沉淀组蛋白，按体积比1:3向收集的上清液（现含有组蛋白）中加入预冷的100%三氯乙酸（TCA）（表1），使最终TCA浓度为33%。通过轻轻颠倒离心管数次混匀。 
	注意：加入TCA后样品会变浑浊，表明组蛋白的存在。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育至少1小时。对于起始沉淀量较小的样品，建议过夜沉淀。</li>
	<li>在3,400 rcf下离心5分钟。组蛋白会附着在离心管内壁并沉积于底部。在管底最下方会形成白色不溶性沉淀，主要成分为非组蛋白及其他生物分子。通过抽吸去除上清液，注意避免刮擦管壁或沉淀。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管，加入冰冻丙酮 + 0.1% HCl（表1）冲洗离心管，确保覆盖附着在管壁和底部的沉淀蛋白。</li>
	<li>在3,400 rcf下离心2分钟，小心抽吸上清液，避免刮擦管壁或沉淀。</li>
	<li>重复步骤3.9–3.10，使用100%冰冻丙酮进行洗涤。</li>
	<li>通过气流干燥、真空离心或敞口放置使沉淀干燥。丙酮挥发迅速。</li>
	<li>用尽可能小的体积的ddH2O（双蒸水）溶解组蛋白，以完全溶解白色层。组蛋白易溶于水。对于1.5 ml微量离心管中的沉淀，通常使用100 µl ddH2O即可充分回收组蛋白。</li>
	<li>在3,400 rcf下离心2分钟，将上清液转移至新离心管中。</li>
</ol>
4. 蛋白质浓度与纯度的估算
<ol>
	<li>检测蛋白质浓度时，可采用BCA法、Bradford蛋白测定法或氨基酸分析（AAA）。请勿使用280 nm吸光度法，因为组蛋白中芳香族氨基酸残基含量较低。</li>
	<li>通过15%丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分析并结合考马斯亮蓝染色（可选）验证提取组蛋白的纯度。</li>
	<li>若需获得高纯度的单一组蛋白变体，可继续进行组蛋白变体的HPLC-UV分级分离（第5节）；若不需要，则直接跳转至组蛋白翻译后修饰自下而上分析的样品制备步骤（第6节）。</li>
</ol>
5. 反相高效液相色谱法分离组蛋白变体（可选）
注意：可通过使用配备紫外检测器的反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC）对粗制组蛋白混合物进行分级分离，从而获得高纯度的组蛋白变体。这些纯化的组蛋白适用于对灵敏度和纯度要求较高的研究。然而，对于常规的组蛋白翻译后修饰（PTM）表征，此步骤可省略，因为分析本身已具备足够的灵敏度和全面性。完整组蛋白变体的分级分离理想情况下至少需要 100 - 300 µg 起始材料。
<ol>
	<li>根据起始组蛋白浓度连接适当的C18 5 µm色谱柱至高效液相色谱仪：若组蛋白量约为100 µg，使用2.1 mm × 250 mm色谱柱，流速为0.2 ml/min；若组蛋白量约为300 µg，则使用4.6 mm × 250 mm色谱柱，流速为0.8 ml/min。使用专用玻璃器皿按以下方法配制缓冲液A和缓冲液B：
	<ol>
		<li>配制缓冲液A：5% HPLC级乙腈，0.1%三氟乙酸（TFA）溶于HPLC级水。</li>
		<li>配制缓冲液B：95% HPLC级乙腈，0.1%三氟乙酸（TFA）溶于HPLC级水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将色谱柱连接至紫外检测器，并将吸光度检测波长设定为210–220 nm。</li>
	<li>用100%三氟乙酸（TFA）酸化溶于水中的组蛋白样品，使TFA终浓度达到0.1–1%。</li>
	<li>以推荐流速用100%缓冲液A平衡色谱柱至少15分钟，相当于约三个柱体积。利用此信号设定紫外检测器的零吸光度基线。</li>
	<li>准备适当规格的收集管，用于手动或自动样品收集器收集组分。</li>
	<li>进样浓度约为1 µg/µl或更高。若样品溶解于较大体积中，可能在上样过程中破坏色谱柱的平衡状态，导致保留能力下降。</li>
	<li>运行梯度程序如下：0至30% B在1分钟内完成，30%至60% B在90分钟内完成，60%至90% B在1分钟内完成。</li>
	<li>使用自动组分收集器以每分钟1次的频率收集组分（示例色谱图见图2）。使用适当规格的收集管以容纳全部体积。</li>
	<li>在真空浓缩仪中将分步收集的样品干燥。
	 
	注：中间暂停点：干燥后的组蛋白组分可在室温下短期保存（1–2天），或于-80 °C冰箱中长期保存。</li>
</ol>
6. 使用丙酸酐对组蛋白进行化学衍生化以进行自下而上分析
<ol>
	<li>将组蛋白样品溶解于 40 μl 的 50 mM NH4HCO3（pH 8.0）中（推荐用量：50 - 100 μg）。若样品原本溶于纯 ddH2O，可加入浓缩的 NH4HCO3 溶液，使其终浓度为 50 mM，pH 8.0。</li>
	<li>用 P10 移液枪吸头蘸取少量样品，使用 pH 指示试纸检测 pH 值，避免样品损失。可用 NH4OH 和甲酸调节 pH 至 8.0。 
	注意：本方案的后续步骤（步骤 6.3 - 6.7）应每次处理最多三至四个样品，以保持丙酸酐的反应活性。</li>
	<li>在使用丙酸酐的后续操作中，请使用通风橱。将丙酸酐与乙腈按 1:3（v/v）的比例混合，配制新鲜的丙酰化试剂。按 1:4（v/v）的比例向样品中加入丙酰化试剂。对于 40 µl 的组蛋白样品，加入 10 µl 丙酰化试剂。 
	注意：此步骤中可能出现白色沉淀，但其主要成分为盐和丙酸，无需特别处理。</li>
	<li>迅速加入 NH4OH，使溶液 pH 恢复至 8.0。注意：丙酸酐与肽段中的游离氨基反应会生成丙酸，导致 pH 下降。通常，按 1:5（v/v）的比例向样品中加入 NH4OH 即可恢复 pH 至 8.0；例如，向 40 µl 样品中加入 8 µl NH4OH。</li>
	<li>立即涡旋混匀。</li>
	<li>采用与步骤 6.2 相同的方法检测 pH。 
	注意：当 pH 超过 10.0 时，可能发生 pKa 较高的其他氨基酸残基的标记反应。</li>
	<li>室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>重复步骤 6.3 - 6.7，每次使用一批丙酰化试剂时，严格控制处理样品数不超过三或四个。</li>
	<li>使用真空浓缩仪将样品浓缩至 10 - 20 µl。此过程可蒸发未反应的丙酸酐、乙腈、乙酸以及 NH4OH 释放的氨气。即使样品完全干燥，也不会造成显著的样品损失。 
	注意：可使用异丙醇替代乙腈，但乙腈表面张力较低，蒸发速度更快。</li>
	<li>用 ddH2O 重悬或稀释样品，使最终体积达到 40 µl。</li>
	<li>重复步骤 6.2 - 6.9。进行两轮组蛋白丙酰化可确保&#62; 95% 的反应完成度。</li>
	<li>向丙酸酐瓶中充入氩气，以防止瓶内湿气与丙酸酐反应生成乙酸。 
	注意：中间可暂停点：样品可在 ddH2O 中重悬后于 -80 °C 保存，或以干燥状态保存。</li>
</ol>
7. 使用胰蛋白酶进行蛋白酶消化
<ol>
	<li>用50 mM NH4HCO3缓冲液重悬组蛋白，使其浓度达到1 μg/μl或更高。样品浓度过低会导致胰蛋白酶消化效率下降。 
	注意：此步骤中的组蛋白溶液pH需为8.0。若仍呈酸性，可用移液枪头加入NH4HCO3盐进行调节。</li>
	<li>按1:10（质量比）的比例将胰蛋白酶加入组蛋白样品中。</li>
	<li>在37 °C条件下孵育6–8小时。</li>
	<li>将样品置于-80 °C冷冻以终止消化反应。</li>
	<li>使用真空浓缩仪将样品浓缩至10–20 µl。 
	注意：中间暂停点：样品可在-80 °C长期保存。</li>
</ol>
8. 组蛋白肽N端的丙酰化
注意：本节描述了由胰蛋白酶消化产生的肽段N端的衍生化。该步骤可改善最短肽段的高效液相色谱（HPLC）保留效果例如， 组蛋白H3的第3至8位氨基酸，因为丙酰基会增加肽的疏水性。
<ol>
	<li>用 30 µl 的 100 mM NH4HCO3 重悬样品。</li>
	<li>重复步骤 6.1 - 6.9。 
	注意：此步骤中样品在真空下干燥所需时间较长是正常现象。</li>
	<li>用 50 - 100 µl ddH2O 加 0.1% TFA 或 0.5% 乙酸重悬或稀释样品。注意：长期储存建议使用乙酸，因为 TFA 长期存在会促进甲硫氨酸氧化。然而，若当天进行阶段装柱（第 9 节），则推荐使用 TFA，因其有助于提高色谱保留效果。 
	注意：中间暂停点：样品可在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
9. 使用 Stage-tips 进行样品脱盐
注意：此阶段样品中存在盐分。盐分会干扰HPLC-MS分析，因为在电喷雾过程中盐会发生离子化，抑制肽段的信号。盐还可能在肽段上形成离子加合物，降低未加合肽段的信号强度。由于加合后的肽段具有不同的质荷比，该肽段将无法被正确鉴定或定量。
<ol>
	<li>使用 P1000 移液枪吸头从固相萃取盘中打取一个 C18 材料圆片。用熔融石英毛细管将小圆片从 P1000 吸头中推出，并将其置于 P100/200 移液枪吸头底部。确保圆片牢固地卡在吸头底部（图 3）。 
	注意：P1000 吸头用于打取 C18 圆片的孔径较小。建议将吸头末端约 1 厘米剪去，以获得更大直径的孔。</li>
	<li>若需对超过 25 µg 的样品进行脱盐，可在同一 P100/P200 吸头中使用两个 C18 圆片。</li>
	<li>使用离心机适配器将 Stage-tip 固定于 1.5 ml 或 2 ml 微量离心管中。采用低速（300 - 400 rcf）离心；通常溶剂在不到一分钟内即可通过树脂。</li>
	<li>通过离心加入 50 µl 100% 乙腈，以活化 C18 材料并去除潜在污染物。</li>
	<li>通过缓慢离心冲洗 80 µl 0.1% 三氟乙酸（TFA），对圆片进行平衡。</li>
	<li>用乙酸将样品酸化至 pH 4.0 或更低。使用 pH 试纸检测 pH 值，以尽量减少样品损失。通过缓慢离心将样品加载至圆片上。</li>
	<li>通过缓慢离心冲洗 70 - 80 µl 0.1% TFA，洗涤样品。</li>
	<li>通过缓慢离心冲洗 70 µl 75% 乙腈和 0.5% 乙酸，洗脱样品。将洗脱液收集至 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥样品。 
	注意：可暂停步骤：样品可在 -80 °C 下长期保存。</li>
</ol>
10. 组蛋白肽段分析
注意：nLC-MS 平台的设置应与传统的肽段分析相同。建议使用 200 - 300 nl 流速的色谱柱（75 µm 内径分析柱，C18 填料），因其在灵敏度与稳定性之间达到了良好的平衡。质谱采集方法可采用数据依赖性采集（DDA）结合靶向扫描19，或数据非依赖性采集（DIA）20,21，两种方法均在代表性结果及图4中有所描述。
<ol>
	<li>配制高效液相色谱（HPLC）缓冲液 — A：含0.1%甲酸的HPLC级水；B：含0.1%甲酸的HPLC级乙腈。</li>
	<li>设置HPLC方法如下：0至30分钟内，缓冲液B从0%升至30%；随后5分钟内，从30%升至100% B，并在100% B条件下等度洗脱8分钟。若HPLC未设置在上样前自动平衡色谱柱的程序，则需增加以下步骤：1分钟内从100% B梯度降至0% B，随后在0% B条件下等度流动10分钟。将分析流速设定为250 - 300 nl/min。</li>
	<li>设置质谱（MS）采集方法，进行DDA结合靶向扫描19或DIA 20,21（图4）。确保质谱的循环周期约为每2秒完成一次完整的MS扫描，以便在色谱峰上获得足够的数据点，从而实现更准确的定量。注意：使用C18色谱时，上述梯度条件下平均基线峰宽约为30秒。</li>
	<li>将约1 µg样品上样至HPLC色谱柱。</li>
	<li>运行已设定的HPLC-MS/MS方法。 
	注意：本方案中不推荐具体的色谱柱、质谱仪或质谱参数细节，因为各蛋白质组学实验室已优化的任意系统均适用于该方法。各蛋白质组学实验室应使用其已优化的配置，因为组蛋白肽段的分离行为与传统肽段相似。</li>
</ol>
11. 数据分析
<ol>
	<li>将质谱原始文件导入软件以进行峰面积积分。注意：推荐使用 EpiProfile22，因其针对组蛋白肽段进行了优化；该软件利用色谱洗脱的保留时间信息，可对已知组蛋白肽段实现可靠的峰面积提取。此外，Skyline23 也是实现此目的的理想软件。
	<ol>
		<li>通过将某一肽段的峰面积除以该肽段所有修饰形式的总峰面积，计算其相对丰度。注意：在进行发现性分析时，推荐使用 Mascot 来鉴定修饰组蛋白肽段的质谱信号。该工具的性能已在近期文献中有所描述24。其他蛋白质组学数据库搜索引擎亦可使用，但根据我们的测试，其表现相对较差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案在成本、时间和性能方面均经过优化。也可采用其他制备方法，但这些方法存在局限性，尤其是在与质谱（MS）分析联用时。例如，可采用高盐提取法替代三氯乙酸（TCA）沉淀法（第3节）来纯化组蛋白26。高盐提取法本质上更为温和，因其不使用强酸，可保留对酸敏感的翻译后修饰（PTMs），并提高组蛋白的提取得率，因为TCA沉淀会共沉淀大量其他染色质结合蛋白。然而，高盐提取所得样品中的盐浓度过高，不适用于HPLC-MS/MS分析。另一种替代方案是在不进行丙酰化的情况下进行组蛋白消化（第6–8节），例如通过缩短胰蛋白酶孵育时间并降低酶与底物的比例27，或使用ArgC作为消化酶28–30。但建议使用丙酸酐进行衍生化处理，因其可生成疏水性更强的肽段，从而在液相色谱过程中获得更好的保留效果。
在化学衍生化中，已评估了多种有机酸酐，并对其优点进行了全面讨论18。然而，丙酸酐在效率、副产物最小化以及提高肽段疏水性之间达到了最佳平衡。丙酸酐理论上可购得同位素标记形式，这使得通过混合多个样品并在质谱水平上根据重同位素标签引入的不同质量加以区分，从而实现多重分析。然而，这种分析会导致液相色谱-质谱（LC-MS）色谱图复杂性增加，并减少每个单一条件下可进样的样品量。
在这方面，应强调该方案中的一些关键要点。若获得阴性结果，可将以下内容作为检查清单，用于排查操作过程中的错误。首先，在细胞核沉淀后，应使用不含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液仔细洗涤沉淀（第 2.10 节），直至完全去除去垢剂（可通过混匀时无气泡产生来判断）。若未做到这一点，将影响后续使用酸进行组蛋白提取的效果。其次，在使用 TCA 沉淀组蛋白后（第 3.9 节），用丙酮洗涤沉淀物至关重要。若残留高浓度酸，且直接进行丙酰化和消化步骤（第 6.1 节），则会对后续操作造成不利影响；但若进行组蛋白分级分离（第 5 节），则不会产生问题。第三，丙酰化反应必须迅速完成（第 6.3–6.7 节）。为此，应避免将同一丙酰化混合液（丙酸酐 + 乙腈）用于超过 3–4 个连续样品。此外，胰蛋白酶消化的最关键因素是 pH 值（第 7 节）。若 pH 值未维持在 8.0 左右（7.5–8.5），消化效果将不理想。此问题可能源于该步骤样品中含有较多丙酸。NH4可根据需要添加OH。此外，对于熟悉蛋白质组学操作流程的研究人员而言，可能会习惯于通过酸化样本来终止胰蛋白酶消化反应，但此操作不应进行，因为它会破坏后续反应。 即， 肽段N端的丙酰化（第8.1节）。最后，同样重要的是，在数据分析时需注意：未修饰肽段实际上并非未修饰；所有游离的赖氨酸残基和N端均会被丙酰化（56.026 Da）占据。因此，若对仅对应于肽段序列的质荷比进行提取离子色谱分析，将无法得到任何结果。
该方法的局限性主要与无法检测组合型翻译后修饰有关，这是由于肽段序列较短所致；此外，由于不同修饰形式的肽段可能具有不同的电离效率，导致对修饰真实丰度的评估存在偏差。第一个问题可通过将该技术与中等规模或自上而下（middle-down 或 top-down）分析方法相结合来解决（参见文献16综述）。尽管此类分析在技术上更具挑战性，但它非常适合研究多种修饰共存的频率。此外，它还能更有效地分辨组蛋白变体，而这一点在自下而上（bottom-up）分析中并不总能实现，因为某些肽段在不同组蛋白变体中具有相同的序列。第二个与电离效率相关的问题可通过使用合成肽段文库来解决31。该方法可更准确地估算组蛋白翻译后修饰的相对丰度。然而，在大多数实验中，研究目标是分析不同条件下特定修饰的相对变化。在这种情况下，由于所有样本具有相同的偏差，因此无需进行此类校正。
总之，本方案利用与串联质谱联用的纳米液相色谱，可在3天内完成组蛋白PTM的分析。与其他非质谱技术的比较， 即， 使用基于抗体的策略（如引言中所述）并不适用，因为它们无法达到接近此通量水平。此外，基于抗体的技术无法发现新的修饰，仅能用于确认和定量已预测的修饰位点。因此，我们推测，由于组蛋白修饰在调控基因表达以及进而影响蛋白质组调控中的关键作用，基于组蛋白肽段的自下而上蛋白质组学（bottom-up proteomics）将在蛋白质组学实验室中日益普及。此外，本文所述方案包含了样品制备和数据分析软件方面的最新改进，使得即使从未有过此类高度修饰肽段表征经验的实验室，也能更简便地开展组蛋白分析。

表观遗传学被定义为研究基因表达的可遗传变化，这些变化由不改变潜在DNA序列的机制引起1。在发育过程中，表观遗传调控至关重要，因为即使生物体的DNA含量不变，也会经历显著的表型变化。维持正常表观遗传调控需要多个关键组分，包括组蛋白翻译后修饰（PTMs）、组蛋白变体、非编码RNA、DNA甲基化以及DNA结合因子，这些组分通过不同机制影响基因表达2。例如，DNA甲基化是一种高度稳定的修饰，可抑制基因转录3，而组蛋白变体和组蛋白翻译后修饰则更为动态，能够以多种方式影响染色质结构和功能4。
组蛋白翻译后修饰主要定位于N端尾部，因为这是蛋白质中最暴露且最灵活的区域。然而，与普通蛋白质相比，核小体核心也存在大量修饰5。尽管在过去十年中，组蛋白修饰标记已被广泛表征，但许多已知组蛋白修饰与其功能之间的关联仍不明确。这在很大程度上是因为大多数组蛋白翻译后修饰并非单独发挥作用，而是与其他翻译后修饰协同作用（&#34;串扰&#34;），共同调控特定过程，例如转录6,7。例如，p21基因上的组合修饰H3S10K14ac可激活其转录，而单独存在其中任一修饰时则不会引发该效应8。蛋白质HP1通过识别H3K9me2/me3并将该修饰扩散至邻近核小体，从而压缩染色质结构。然而，当相邻的S10位点发生磷酸化时，HP1便无法结合H3K9me2/39。在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，H3K4的乙酰化会抑制蛋白spChp1与H3K9me2/me3的结合10。此外，组蛋白赖氨酸去甲基化酶PHF8在H3K4me3、K9ac和K14ac三种翻译后修饰同时存在时，表现出最高的核小体结合效率11。这些实例凸显了全面掌握组蛋白翻译后修饰变化的重要性，而非仅关注单一修饰。
序列变异体的存在也增加了组蛋白分析的复杂性，因为组蛋白异构体通常具有高度相似的序列，但在染色质中常发挥不同的功能。例如，H2A.x 具有一个C端序列，在DNA损伤时比经典H2A更容易被磷酸化12，并且在雄性小鼠减数分裂过程中性染色体的失活中起必需作用13；类似地，CENP-A 在着丝粒中取代经典组蛋白 H314。尽管功能不同，这些变异体与其对应的经典组蛋白共享大部分氨基酸序列，因此难以对它们进行独立鉴定和定量。
基于抗体的技术（如蛋白质印迹）已被广泛用于组蛋白的表征。然而，基于抗体的方法存在以下局限性：（i）只能确认某种修饰的存在，无法鉴定未知的翻译后修饰（PTM）；（ii）由于共存修饰的存在可能影响结合亲和力，因而具有偏倚性；（iii）无法识别组合型修饰，因为可用于此类目的的抗体极为有限；（iv）在高度相似的组蛋白变体或相似的翻译后修饰之间（例如，赖氨酸残基的二甲基化与三甲基化）存在交叉反应。Egelhofer et al. 指出，超过25%的商用抗体在点印迹或蛋白质印迹实验中未能通过特异性检测，而在特异性抗体中，又有超过20%在染色质免疫沉淀实验中失败15。目前，质谱（MS）是研究新型和/或组合型翻译后修饰最合适的分析工具，并已在组蛋白研究中得到广泛应用（详见16综述）。这主要归因于质谱具有高灵敏度和高质量精度，以及可进行大规模分析的可能性。
自下而上的策略是基于质谱的组蛋白表征及其翻译后修饰（PTMs）分析中最常用的蛋白质组学策略，该策略通过酶解将完整的蛋白质消化为短肽段（5 - 20 个氨基酸）。这种消化有助于液相色谱（LC）分离和质谱（MS）检测。分子量在 600 - 2,000 Da 范围内的肽段通常比大分子量物质更容易电离，且具有更高的质量准确度和分辨率。此外，短肽段也更适用于碰撞诱导解离（CID），从而提升 MS/MS 碎裂效果。然而，组蛋白在自下而上的质谱分析中存在挑战，因其富含碱性氨基酸残基，特别是赖氨酸和精氨酸。因此，胰蛋白酶消化会产生过短的肽段，难以在液相色谱中保留，并导致 PTMs 的定位不明确。为解决这一问题，本方案包含赖氨酸及肽段 N 端的化学衍生化17。推荐使用丙酸酐进行高效化学衍生化，相较于其他试剂更具优势18。此类衍生化可封闭未修饰及单甲基化赖氨酸残基的 ε-氨基，从而使胰蛋白酶仅在精氨酸残基的 C 端进行蛋白水解。衍生化的胺基无法与溶液交换质子，因此肽段通常仅带双电荷或三电荷，有利于质谱和串联质谱（MS/MS）检测。此外，N 端衍生化增加了肽段的疏水性，从而增强其在反相色谱中的保留能力。本文描述了组蛋白纯化及其用于自下而上蛋白质组学分析 PTMs 的操作流程（图 1）。该策略可实现对氨基酸序列中相对邻近的组蛋白单个修饰标记及组合修饰标记的定量分析。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>用于细胞收获</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>微囊藻毒素</td><td>Sigma</td><td>M4194</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，不含EDTA（100倍浓缩液）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 替代物</td><td>CALBIOCHEM</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>硫酸，ACS级</td><td>Fisher Chemical</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Biorad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 29:1 &amp;#8212; 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>C18 柱（5 &amp;#181;m）2.1&amp;nbsp;mm × 250&amp;nbsp;mm</td><td>Grace</td><td>218TP52</td><td></td></tr><tr><td>C18 柱（5 &amp;#181;m）4.6&amp;nbsp;mm × 250&amp;nbsp;mm</td><td>Grace</td><td>218TP54</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级乙腈</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>丙酸酐</td><td>Sigma</td><td>240311</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>PRV5113</td><td>用于组蛋白的质谱消化</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>C18 萃取盘</td><td>Empore</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr></tbody></table>

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

核小体是染色质的最小结构单位，由缠绕在组蛋白八聚体上的147个碱基对的DNA组成。组蛋白的功能通过多种核蛋白介导的广泛翻译后修饰来实现。这些修饰对于维持细胞核的完整性至关重要，因为它们调控染色质结构，并招募参与基因调控、DNA修复和染色体浓缩的酶类。尽管科学界大多数研究人员采用基于抗体的技术来表征组蛋白PTM的丰度，但这些方法通量较低，且对高度修饰的蛋白质存在偏差，因为邻近的修饰可能遮蔽抗原表位。本实验方案描述了使用纳米液相色谱（nLC）和质谱（MS）对组蛋白修饰进行精确定量的方法。该方法旨在单次分析中同时表征多种组蛋白PTM以及多种组蛋白变体的相对丰度。在本方案中，组蛋白首先用丙酸酐衍生化，随后用胰蛋白酶消化，生成长度为5–20个氨基酸的肽段。消化后，组蛋白肽段新暴露的N端进一步衍生化，以提高在nLC-MS过程中的色谱保留能力。该方法可实现跨越四个数量级的组蛋白PTM相对定量。

以人胚胎干细胞（hESCs）为例，我们分析了经或未经视黄酸（RA）刺激后提取的组蛋白，起始材料为200 µl细胞沉淀。在细胞培养中加入RA可诱导胚胎干细胞分化。从细胞沉淀中提取出约50–100 µg组蛋白，该产量足以进行多次组蛋白肽段的液相色谱-质谱（LC-MS）进样。经过衍生化、酶解和脱盐处理后，样品通过高性能液相纳米色谱系统，以串联模式加载至75 µm × 15 cm C18色谱柱（颗粒直径3 µm，孔径300 Å），该系统配备微流控芯片，并连接至杂合线性离子阱-轨道阱质谱仪。质谱采集采用数据非依赖采集（DIA）模式。同时，样品也使用数据依赖采集（DDA）方法进行分析，该方法采用纳米流速超高效液相色谱（UHPLC）联用杂合离子阱-轨道阱质谱仪（数据未显示）。每个采集周期中，首先进行一次完整的轨道阱全扫描，扫描范围为290至1,400 m/z，分辨率设为60,000（在200 m/z处），自动增益控制（AGC）目标值为106。随后启用数据依赖采集模式，动态排除时间为30秒。MS/MS扫描针对最强的母离子依次进行，单电荷离子被排除在MS/MS分析之外。隔离窗口设为2 m/z。母离子通过碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，碰撞能量为35%。MS/MS检测采用离子阱，扫描模式为常规扫描范围和常规扫描速率，AGC目标值为104。
采用软件对原始质谱数据进行分析，以提取前体离子和碎片离子色谱图，所用软件包括 Skyline23 和 EpiProfile22。EpiProfile 针对组蛋白肽段进行了优化，因其集成了基于肽段保留时间先验知识的智能峰面积提取功能。另一方面，Skyline 则针对数据非依赖性采集（DIA）分析进行了优化，因此所展示的 DIA 图像（图 4 和 图 5A）均截自该软件。从提取的离子色谱图中获取曲线下面积，并以此估算各肽段的丰度。对同一肽段的 [M + H]+、[M + 2H]2+ 和 [M + 3H]3+ 离子均计算其色谱峰面积，尽管在大多数情况下 [M + 2H]2+ 为主要存在形式。由此获得特定修饰形式肽段的原始丰度。为获得翻译后修饰（PTM）的相对丰度，将某一组蛋白肽段所有不同修饰形式的总和设为 100%，特定修饰形式肽段的峰面积除以该肽段在所有修饰形式下的总峰面积，即得其相对丰度。
组蛋白肽以多种同重质形式存在（图5）。同重肽， 例如， K18ac 和 K23ac 只能在 MS/MS 水平上进行定量，利用其特有的碎片离子来确定同重物质的比例图5A 和 5B）。该比值用于划分两种同量异序物种色谱峰的面积。在使用 DDA 时，这些同量异序形式会被列入目标质荷比列表中，因为需要在整个洗脱过程中选择这些肽段进行碎裂，而这在标准 DDA 实验中不会发生。随后通过监测碎片离子的洗脱轮廓来区分同量异序物种的相对丰度。另一方面，DIA 类型的采集方法无需任何包含列表。然而，这种采集方法与传统的数据库搜索不兼容，因此可能阻碍未知修饰肽段的发现。
通过高分辨质谱采集（> 30,000），可将赖氨酸乙酰化（+ 42.011 Da）与几乎等重的三甲基化（+ 42.047 Da）区分开。此外，乙酰化比三甲基化更具疏水性，导致乙酰化肽段的洗脱时间晚于相应的三甲基化肽段。由于赖氨酸发生了丙酰化修饰，同一肽段的未修饰形式洗脱更晚。综上所述，对于含有一个可修饰位点的肽段，其疏水性顺序为：二甲基化与三甲基化 < 乙酰化 < 未修饰（丙酰化）< 单甲基化（丙酰化）。
在诱导分化后，hESC 显示出乙酰化肽段的显著减少（图 6A 和 6B）。这并不意外，因为先前的研究报道了与正在分化的细胞相比，ESC 中乙酰化水平更高25，反映了多能性染色质普遍具有的开放状态。通过聚焦组蛋白 H3，共定量了 35 种不同的修饰形式（图 6C）。然而，利用该方法可检测的组蛋白蛋白异构体总数超过 200 种，包括所有组蛋白变体以及低丰度的修饰形式（数据未显示）。此外，我们的分析表明，技术重复之间具有高度可重复性，这由误差棒较小的尺寸（代表 ± 标准差）得以证明。综上所述，本部分描述了如何利用 nLC-MS 数据提取组蛋白修饰肽段的相对丰度。
<img alt="组蛋白纯化流程图；包括液相色谱-质谱分析、衍生化、分级步骤。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：自下而上质谱/质谱组蛋白分析的工作流程。 显示了组蛋白分析的十个步骤，并估算了每个步骤所需的时间。括号中给出了本文稿中的相应章节编号。第5节描述了用于分离各种组蛋白变体的样品分级步骤，除非需要对特定变体进行高灵敏度分析，否则该步骤可以省略。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱图与凝胶电泳结果；蛋白质分离分析及条带可视化。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：组蛋白变体分离的反相高流速液相色谱及考马斯亮蓝凝胶电泳。 (A) LC-UV 色谱图显示完整组蛋白的分离情况。根据洗脱时间可区分不同的组蛋白 H3 变体。组分可通过手动或自动馏分收集器进行收集。(B) 三次重复组蛋白纯化的考马斯亮蓝染色凝胶结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纸色谱法实验步骤；移液器使用；溶质分离分析；实验室实验。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：Stage-tipping Plug的制备。 使用P1000移液器吸头，从固相萃取盘片上打下一个C18材料制成的小圆片（第二幅图）。该微型圆片会粘附在吸头内（中间图），因此可利用任意细小毛细管将其推出，并装入更小的P100/200移液器吸头中。本示例中，我们使用了外径为700 µm的熔融石英毛细管。应将微型圆片推至P100/200移液器吸头底部，直至无法再推进（最后一幅图）。该Stage吸头现已可用于组蛋白脱盐，因其具有足够的容量，足以保留足够量的样品以进行多次重复实验。具体而言，一个微型圆片足以处理15–20 µg的样品。若需处理更多样品，可将多个圆片依次叠放装填。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DDA 与 DIA 质谱技术：通过色谱图比较前体离子和碎片离子。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：DDA 与 DIA 方法的示意图。 使用 DDA 时，质谱扫描循环的特点是根据前体离子的强度和电荷状态，依次选择前体离子进行 MS/MS 碎裂。一旦某个前体离子被碎裂，它将被加入排除列表，以避免重复选择同一肽段，从而使质谱能够“深入”检测丰度较低的信号。这种采集方法是蛋白质组学中发现模式的首选技术。定量通过在已鉴定的 MS/MS 谱图附近积分特定离子的全扫描信号来实现。在 DIA 中，每个扫描循环都会对整个 m/z 范围内的离子进行碎裂。该方法不太适用于发现模式，但可生成所有离子（包括前体离子和产物离子）的色谱轮廓。这有助于实现更可靠的定量，并区分同量异位形式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质色谱结果；保留时间与强度关系图；肽序列表格；分析图表。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5： 同量异序肽的定量分析。 (A) 在组蛋白分析中常见的两种同量异序肽示例。它们前体离子及其相对同位素的提取离子色谱图（XIC，上方）完全相同。然而，产物离子的XIC（下方）可实现对这两种同量异序形式的区分。值得注意的是，应仅使用特异性片段离子来评估这两种物质的相对丰度。(B) 上述两种肽的特异性片段离子示意图（以红色标出）。(C) 在Homo sapiens中常被分析、且至少存在一种同量异序对应物的肽列表。表中列出了这些组蛋白肽之间的序列变异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组蛋白修饰分析，比较经与未经视黄酸处理的人胚胎干细胞中各修饰形式的柱状图与面积图。" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：经与未经视黄酸处理的人胚胎干细胞的代表性结果。 (A) 组蛋白H3肽段KQLATKAAR（第18–26位氨基酸）在所有其修饰蛋白异构体中的相对定量。相对丰度以所有蛋白异构体总和为100%进行估算（未显示未修饰肽段的相对百分比）。(B) 组蛋白H3肽段KSTGGKAPR（第9–17位氨基酸）的相对定量。(C) 经与未经视黄酸处理的细胞中检测到的经典组蛋白H3肽段的相对丰度。该图显示了在两种处理条件下，哪些修饰的丰度更高（> 50%）。总体而言，我们证明了在细胞分化诱导过程中，组蛋白H3在大多数赖氨酸残基上的乙酰化水平下降。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液 #</td>
			<td colspan="7">成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">核分离缓冲液（NIB）储备液配制如下，并以 100 ml 分装于 -20 °C 冷冻保存；解冻后的 NIB 可在 4 °C 保存数周：15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 和 250 mM 蔗糖。用 HCl 将缓冲液 pH 调至 7.5。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">蛋白酶抑制剂（使用前新鲜加入缓冲液）：1 M 二硫苏糖醇（DTT）溶于 ddH2O（1,000x）；200 mM AEBSF 溶于 ddH2O（400x）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="7">磷酸酶抑制剂（使用前新鲜加入缓冲液）：2.5 µM 微囊藻毒素溶于 100% 乙醇（500x）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="7">组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（使用前新鲜加入缓冲液）：5 M 丁酸钠，通过用 NaOH 滴定 5 M 丁酸至 pH 7.0 制得（500x）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="7">NP-40 替代液：10% v/v 溶于 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="7">0.2 M H2SO4 溶于 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="7">三氯乙酸（TCA）：100% w/v 溶于 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="7">丙酮 + 0.1% 盐酸（HCl）：0.1% v/v HCl 溶于丙酮</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 溶液。

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。

核小体是染色质的最小结构单位，由缠绕在组蛋白八聚体上的147个碱基对的DNA组成。组蛋白……

本实验方案的总体目标是提供一种简单的方法，用于评估组蛋白翻译后修饰的相对丰度，这些修饰在染色质生物学中发挥着关键作用，例如基因表达调控和染色体凝缩。该方法有助于回答染色质生物学领域中的关键问题，例如，在特定细胞或组织受到刺激或处理后，哪些组蛋白修饰的相对丰度会发生改变。该技术的主要优势在于，通过基于质谱的蛋白质组学方法，我们可以在单次分析中同时定量已知蛋白质上的大多数已知翻译后修饰。组蛋白修饰分析具有多种应用，包括评估个体或模式系统在药物处理或应激条件下的表观遗传变化和染色质功能。除Simone外，我实验室的另外两名成员也将演示本方案的操作步骤。Natarajan Bhanu，一名研究专家，以及Kelly Karch，一名研究生。如本工作流程所示，这是一个包含10个步骤的实验方案，包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化、消化与脱盐，以及使用纳米流液相色谱进行质谱分析。本视频中仅演示部分选定的操作步骤。开始从完整细胞中分离细胞核的操作时，将先前收获并储存在负80摄氏度下、现置于冰上融化的细胞取出。按照方案文本所述，配制细胞核分离缓冲液（NIB）。取出五分之一体积的NIB，并加入NP-40替代物，使其终浓度为0.2%。剩余的五分之四体积将用于洗涤步骤。用不含 NP-40 替代物的 NIB 缓冲液洗涤细胞沉淀，细胞沉淀体积与缓冲液体积比为 1:10。在 700 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞沉淀置于冰上，加入含 0.2% NP-40 替代物的 NIB 缓冲液（细胞沉淀体积与缓冲液体积比为 1:10），裂解细胞。通过轻柔吹打使细胞匀浆。将匀浆后的细胞置于冰上孵育5至10分钟，使细胞裂解并释放细胞核。在4摄氏度下以1000 RCF离心5至10分钟。沉淀物主要含有细胞核，而上清液主要含有胞质成分。如需要，保存胞质组分。通过使用沉淀物体积与缓冲液体积比为1:10的NIB（不含NP-40替代物）轻轻重悬沉淀物，洗涤细胞核沉淀。在4°C条件下以1000 RCF离心五分钟，弃去上清液。在完全去除细胞核沉淀中的NP-40替代物后，按细胞核体积与硫酸体积1:5的比例加入冰预冷的0.2摩尔硫酸。通过轻柔吹打将细胞核重新悬浮于硫酸中。将样品在4°C条件下，以恒定旋转或轻柔振荡孵育2至4小时。随后，在4°C、3400 ×g 条件下离心样品5分钟，并将上清液转移至新管中。再次离心，并将上清液转移至新管，以去除任何不溶性物质。为了沉淀组蛋白，按1:3的体积比将预冷的100%三氯乙酸（TCA）加入收集的上清液中。样品变浑浊表明组蛋白的存在。通过轻轻倒置离心管数次混匀。将混合物置于冰上孵育至少一小时。在3400 RCF下离心五分钟。离心后，组蛋白将附着在管壁并沉积于管底。在离心管最底部还会形成白色不溶性沉淀，其中主要含有非组蛋白和其他生物分子。用移液器小心吸除上清液，注意不要刮擦管壁或底部的沉淀物。使用玻璃巴斯德移液管，用100%冰冷丙酮加0.1%盐酸冲洗离心管，使液体覆盖附着在管壁和底部的沉淀蛋白。在3400 RCF下离心两分钟。小心吸除上清液，避免刮擦管壁或沉淀物。用100%预冷的丙酮冲洗管壁，再次离心，然后在不刮擦管壁或沉淀物的情况下移除上清液。随后，按照方案文本中所述进行组蛋白定量和纯度分析。在组蛋白衍生化之前，还可选择通过反相高效液相色谱法对组蛋白变体进行分离。开始此操作时，将组蛋白样品溶解于40 µL的50 mmol/L pH 8.0碳酸氢铵溶液中。通过将 P10 移液器吸头插入样品中（不吸取），并将吸头接触 pH 指示试纸来检测 pH 值。使用氢氧化铵和甲酸将 pH 值调节至 8.0。此后，所有涉及丙酸酐的操作步骤均须在通风橱中进行。每次处理三到四个样品，以保持丙酸酐的反应活性。通过将丙酸酐与乙腈按1:3的体积比混合，配制新鲜的丙酰化试剂。按1:4的体积比将丙酰化试剂加入各样品中。迅速加入氢氧化铵以将溶液的 pH 值重新调至 8.0。通常，按 1:5 的体积比向样品中加入氢氧化铵即可有效恢复至 pH 8.0。立即涡旋混匀。检测pH值。将样品在室温下孵育15分钟。所有样品完成丙酰化后，在真空浓缩仪中将样品干燥至10至20微升。用ddH20重悬或稀释样品，直至终体积达到40微升。由于盐类会干扰液相色谱和质谱分析，因此样品在分析前必须进行脱盐处理。在本视频中，仅演示阶段尖端（stage-tips）的构建过程。使用 P1000 移液枪吸头从固相萃取盘上打下一个 C18 材料的小圆片。用熔融石英毛细管将微型圆片从 P1000 吸头中推出，并送入 P100 或 P200 移液枪吸头的底部。确保圆片牢固地卡在吸头底部。若脱盐的样品量超过25微克，请在同一支P100或P200吸头中使用两个C18微型盘。使用离心机适配器将阶段式吸头固定在1.5毫升或2毫升微量离心管中。通过离心加入50微升100%乙腈，以活化C18材料并去除潜在污染物。随后按照方案文本中所述进行样品脱盐。组蛋白肽以多种同重形式存在。组蛋白分析中两种常见且丰度较高的形式如图所示。上述显示的它们前体离子质量及其相对同位素的提取离子色谱图完全相同。然而，如下所示的产物离子提取离子色谱图可区分这两种同量异位形式。应仅使用以红色突出显示的特异性碎片离子来估算这两种物质的相对丰度。对经或未经视黄酸刺激的人类胚胎干细胞中提取的组蛋白进行了分析。两种组蛋白H3肽段的相对定量结果显示，在诱导分化的人类胚胎干细胞中乙酰化水平明显降低。该结果与先前报道一致，即与分化中的细胞相比，胚胎干细胞具有更高的乙酰化水平。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成：第一天进行组蛋白提取，第二天进行蛋白质衍生化与消化，第三天进行肽段衍生化、StageTip纯化及液相色谱-质谱（LC-MS）分析。组蛋白纯化除用于肽段分析外，还可应用于其他研究目的，包括中等长度肽段（middle-down）和自上而下（top-down）蛋白质组学，从而能够表征组蛋白的组合式修饰。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于质谱的蛋白质组学方法来鉴定和定量组蛋白翻译后修饰。

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