完整的工作流程为组蛋白翻译后修饰的分析采用自下而上质谱法:从组蛋白提取数据分析
May 17th, 2016
这个协议概述了表征使用质谱（MS）组蛋白的翻译后修饰的完全集成的工作流程。该工作流包括使用纳米流液相色谱法和用于数据分析的指令的细胞培养物或组织中，组蛋白衍生和消化，MS分析组蛋白纯化。该协议被设计为内完成2 - 3天。
该方案的总体目标是提供一个简单的程序来评估组蛋白翻译后修饰的相对丰度，这些修饰在染色质生物学中起着重要作用，例如基因表达调控和染色体浓缩。这种方法可以帮助回答染色质生物学领域的关键问题。例如，哪些组蛋白修饰在刺激或处理给定细胞或组织时会改变它们的相对丰度。
该技术的主要优点是，通过使用基于质谱的蛋白质组学，我们可以在一次分析中同时定量已知蛋白质上的大多数已知 PTM。组蛋白修饰分析有许多应用，包括估计药物治疗或应激后个体或模型系统的表观遗传变化和染色质作。除了 Simone，我实验室的另外两名成员将演示该协议的程序。
研究专家 Natarajan Bhanu 和研究生 Kelly Karch。如本工作流程所示，这是一个 10 步方案，包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化、消化和脱盐以及使用纳流液相色谱进行质谱分析。本视频将仅演示选定的程序。
要开始从完整细胞中分离细胞核的程序，请在冰上解冻先前收获并储存在零下 80 摄氏度的细胞。并按照协议文本中的说明准备核隔离缓冲液或 NIB。去除五分之一体积的 NIB 并加入 NP-40 替代品，最终浓度为 0.2%剩余的五分之四体积将用于洗涤。
用不含 NP-40 Alternative 的 NIB 洗涤细胞沉淀物，细胞沉淀体积与缓冲液体积的比例为 1：10。以 700 RCF 离心 5 分钟，然后去除上清液。将细胞沉淀物置于冰上，以细胞沉淀体积与缓冲液体积的 1：10 比例加入含 0.2% NP-40 替代品的 NIB，以裂解细胞沉淀物。
通过轻轻移液使细胞均质化。将匀浆细胞在冰上孵育 5 至 10 分钟，使细胞裂解并释放细胞核。在 4 摄氏度下以 1000 RCF 离心 5 至 10 分钟。
沉淀主要包含细胞核，而上清液主要包含细胞质成分。如果需要，保存细胞质部分。使用沉淀体积与缓冲液体积的 1：10 比例，轻轻地重新悬浮不含 NP-40 Alternative 的 NIB 来洗涤细胞核沉淀。
在 4 摄氏度下以 1000 RCF 离心 5 分钟，然后取出超自然气瓶。从细胞核沉淀中完全去除 NP-40 替代品后，按细胞核体积与硫酸体积的 1：5 比例加入冰冷的 0.2 摩尔硫酸。通过轻轻移液将细胞核重新悬浮在硫酸中。
在 4 摄氏度下以恒定旋转或轻轻摇晃孵育样品 2 至 4 小时。接下来，将样品在 3400 RCF 下在 4 °C 下离心 5 分钟，然后将上清液转移到新试管中。再次离心并将上清液转移到新试管中，以去除任何不溶性物质。
要沉淀组蛋白，将冷冻的 100% 三氯乙酸或 TCA 以 1：3 的体积比例添加到收集的上清液中。组蛋白的存在表现为样品变得浑浊。将试管倒置几次进行混合。
将混合物在冰上孵育至少一小时。在 3400 RCF 下离心 5 分钟。离心后，组蛋白将覆盖管的侧面，并沉积在底部。
在试管的最底部也会形成一个白色的不溶性颗粒，其中主要包含非组蛋白和其他生物分子。通过抽吸小心地去除上清液，不要刮擦管的侧面或管底部的沉淀。通过使用玻璃巴斯德移液管，用 100% 冰冷的丙酮加 0.1% 盐酸冲洗试管，以覆盖覆盖侧面和底部的沉淀蛋白质。
在 3400 RCF 下离心 2 分钟。小心吸出上清液，不要刮擦侧面或沉淀。用 100% 冰冷的丙酮冲洗试管，再次离心，然后去除上清液，不要刮擦侧面或沉淀。
随后，按照方案文本中的说明进行组蛋白定量和纯度分析。在组蛋白衍生化之前，也可以通过反相 HPLC 对组蛋白变体进行可选的分级分离。通过将组蛋白样品溶解在 40 μL 50 毫摩尔碳酸氢铵 （pH 8.0） 中来开始此程序。
将 P10 移液器吸头插入样品中而不吸液，然后将移液器吸头接触 pH 指示条，以检查 pH 值。使用氢氧化铵和甲酸将 pH 值调节至 8.0。从这里开始，所有涉及使用丙酸酐的步骤都必须在通风橱中进行。
一次最多处理 3 到 4 个样品，以保持丙酸酐反应性。通过将丙酸酐与乙腈以 1：3 的体积比例混合来制备新鲜的丙酰化试剂。将丙酰化试剂以 1：4 的体积比添加到每个样品中。
快速加入氢氧化铵，使溶液的 pH 值重新达到 8.0。通常，以 1：5 的体积比向样品中加入氢氧化铵以重新建立 pH 值 8.0 是合适的。涡旋立即混合。
检查 pH 值。将样品在室温下孵育 15 分钟。所有样品都经过丙酰化后，在真空浓缩器中将样品干燥至 10 至 20 μL。
用 ddH20 重悬或稀释样品，直到达到 40 μL 的最终体积。由于盐分会阻碍液相色谱和质谱分析，因此必须在分析前对样品进行脱盐。在本视频中，将仅演示 stage-tips 的结构。
使用 P1000 移液器吸头从固相萃取盘上打孔 C18 材料盘。使用熔融石英毛细管将迷你圆盘从 P1000 吸头中推出，并推入 P100 或 P200 移液器吸头的底部。确保椎间盘牢固地楔入尖端底部。
如果对超过 25 μg 的样品进行脱盐，请在同一个 P100 或 P200 吸头中使用两个 C18 迷你圆盘。使用离心机适配器将载物台吸头固定在 1.5 或 2 ml 微量离心管中。用 50 μL 100% 乙腈旋转以活化 C18 材料并去除潜在污染物，从而冲洗填料。
随后按照方案文本中的说明进行样品脱盐。组蛋白肽以多种同量异位形式存在。显示了组蛋白分析中常见的两个示例。
如上所示，它们的母离子质量和相对同位素的提取离子色谱图是相同的。但是，子离子的提取离子色谱图（如下所示）可以区分两种同量异位形式。只能使用以红色突出显示的独特碎片离子来估计两种物质的相对丰度。
分析从人胚胎干细胞中提取的组蛋白，有和没有视黄酸刺激。两种组蛋白 H3 肽的相对定量显示，在刺激分化的情况下，人胚胎干细胞中的乙酰化明显减少。这与先前关于胚胎干细胞中乙酰化程度高于分化细胞的报道一致。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。组蛋白提取 1 天，蛋白质衍生化和消化 2 天，肽衍生化和 LC-MS 分析第 3 天。组蛋白纯化可用于肽分析以外的其他目的，包括自中而下和自上而下的蛋白质组学，其中可以表征组合组蛋白修饰。
观看此视频后，您应该对如何使用基于质谱的蛋白质组学鉴定和定量组蛋白翻译后修饰有很好的了解。
概述
本协议提供了一种使用质谱法对组蛋白翻译后修饰进行表征的全面工作流程。它包括组蛋白纯化、衍生化、消化和分析步骤，设计为在2-3天内完成。
关键研究组件
科学领域
- 染色质生物学
- 组蛋白修饰
- 质谱法
背景
- 组蛋白翻译后修饰对基因表达调控至关重要。
- 理解这些修饰可以揭示染色质动力学的洞察。
- 该方法允许同时定量多种PTM。
- 应用包括研究对治疗的表观遗传变化的反应。
研究目的
- 评估组蛋白修饰的相对丰度。
- 研究细胞刺激后组蛋白修饰的变化。
- 为在各种生物学背景下进行组蛋白分析提供可靠的方法。
使用的方法
- 从细胞培养物或组织中提取组蛋白。
- 组蛋白衍生化和消化。
- 使用纳流液相色谱法进行质谱分析。
- 定量组蛋白修饰的数据分析。
主要结果
- 成功分离和定量组蛋白修饰。
- 实验室成员展示了工作流程。
- 洞察各种条件下组蛋白修饰的动力学。
- 在研究染色质生物学和表观遗传学方面的潜在应用。
结论
- 本协议提供了一种分析组蛋白修饰的稳健方法。
- 质谱法实现了对PTM的全面分析。
- 工作流程可以适应各种实验条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of histone post-translational modifications (PTMs) using bottom-up mass spectrometry addresses a critical need for unbiased, high-throughput epigenetic profiling in discovery-stage biopharma R&D. This workflow enables simultaneous measurement of diverse histone PTMs and variants, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in chromatin-targeted therapeutic programs. Integration of this approach enhances portfolio decision-making by providing robust, scalable data on chromatin state changes in response to candidate interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of chromatin regulatory mechanisms through multiplexed PTM quantification.
- Supports functional target validation by revealing PTM dynamics upon cellular stimulation or compound treatment.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing direct epigenetic effects from secondary changes.
- Improves predictive confidence for chromatin-modifying target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts for histone PTM abundance across multiple conditions.
- Enables assay standardization and reproducibility by minimizing antibody-based bias and epitope masking.
- Supports high-throughput screening readiness for epigenetic modulator libraries.
- Delivers scalable, platform-compatible data for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns epigenetic biomarker quantification with disease-relevant chromatin states in preclinical models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement of PTM changes in response to treatment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin modification profiles.
- Provides mechanistic insight into drug-induced chromatin remodeling relevant to disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This mass spectrometry-based workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust epigenetic profiling at key inflection points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PTM changes under defined perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative PTM measurements suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides high-resolution, multiplexed data outputs for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of chromatin state biomarkers with disease models and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for ongoing epigenetic studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes PTM quantification, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust epigenetic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of chromatin-modifying therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry-based proteomics and chromatin biology.
- Demands access to nano-LC-MS instrumentation and advanced data analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to various cell types and tissues, but may require optimization for specific biological systems.
- Sample throughput and data complexity may limit routine use in resource-constrained settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Isolation of Nuclei from Intact Cells
3:18
Extraction and Purification of Histones from Nuclei
5:53
Chemical Derivatization of Histones Using Propionic Anhydride for Bottom-up Analysis
7:43
Sample Desalting with Stage-tips
8:59
Results: Characterization of Histone Post-translational Modifications
10:10
Conclusion
