使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

本实验方案的总体目标是提供一种简单的方法，用于评估组蛋白翻译后修饰的相对丰度，这些修饰在染色质生物学中发挥着关键作用，例如基因表达调控和染色体凝缩。该方法有助于回答染色质生物学领域中的关键问题，例如，在特定细胞或组织受到刺激或处理后，哪些组蛋白修饰的相对丰度发生了变化。

该技术的主要优势在于，通过基于质谱的蛋白质组学方法，我们可以在单次分析中同时定量已知蛋白质上的大多数已知翻译后修饰。组蛋白修饰分析具有多种应用，包括评估个体或模式系统在药物处理或应激条件下的表观遗传变化和染色质功能。除了Simone之外，我实验室的另外两名成员也将演示本方案的操作步骤。

Natarajan Bhanu，研究员，以及 Kelly Karch，研究生。如本工作流程所示，本方案共包含10个步骤，涵盖从细胞培养物或组织中进行组蛋白纯化、组蛋白衍生化、消化与脱盐，以及采用纳流液相色谱进行质谱分析。本视频中仅演示其中部分选定的操作步骤。

开始从完整细胞中分离细胞核的操作时，将之前收获并储存在负80摄氏度的细胞置于冰上解冻。按照方案文本所述，配制细胞核分离缓冲液（NIB）。取出五分之一体积的NIB，并加入NP-40替代物，使其终浓度为0.2%。剩余的五分之四体积将用于洗涤步骤。

用不含NP-40替代物的NIB缓冲液洗涤细胞沉淀，细胞沉淀体积与缓冲液体积比为1:10。在700 × g离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀置于冰上，加入含0.2% NP-40替代物的NIB缓冲液（细胞沉淀体积与缓冲液体积比为1:10），裂解细胞沉淀。

通过轻柔吹打使细胞匀浆。将匀浆后的细胞置于冰上孵育5到10分钟，使细胞裂解并释放细胞核。在4°C条件下，以1000 RCF离心5到10分钟。

沉淀物主要含有细胞核，而上清液主要含有胞质成分。如需要，保存胞质组分。通过使用沉淀物体积与缓冲液体积比为1:10的不含NP-40替代物的NIB缓冲液，轻轻重悬沉淀物以洗涤细胞核沉淀。

在4°C条件下以1000 RCF离心五分钟，去除上清液。在完全去除NP-40替代物后，按核体积与硫酸体积1:5的比例加入冰浴预冷的0.2摩尔硫酸。通过轻柔吹打将核重新悬浮于硫酸中。

将样品在4°C条件下孵育，同时保持恒定旋转或轻柔振荡，持续两到四小时。接着，在4°C条件下以3400 RCF离心五分钟，将上清液转移至新管中。再次离心，并将上清液转移至新管，以去除任何不溶性物质。

为沉淀组蛋白，向收集的上清液中按1:3的体积比加入预冷的100%三氯乙酸（TCA）。样品变浑浊表明组蛋白的存在。通过轻轻翻转离心管数次进行混匀。

将混合物置于冰上孵育至少一小时。在3400 RCF下离心五分钟。离心后，组蛋白将附着在管壁并沉积于管底。

在离心管最底部还会形成白色不溶性沉淀物，其中主要含有非组蛋白和其他生物分子。用移液器小心吸除上清液，注意不要刮擦管壁或底部的沉淀物。使用玻璃巴斯德移液管，用100%预冷丙酮（含0.1%盐酸）冲洗离心管，使液体覆盖附着在管壁和底部的沉淀蛋白。

在3400 RCF下离心两分钟。小心吸除上清液，避免刮擦管壁或沉淀物。用100%预冷的丙酮冲洗离心管，再次离心，然后在不刮擦管壁或沉淀物的情况下移除上清液。

随后，按照方案文本所述进行组蛋白定量和纯度分析。在组蛋白衍生化之前，还可选择通过反相高效液相色谱法对组蛋白变体进行分离。开始此操作时，将组蛋白样品溶解于40 µL的50 mmol/L碳酸氢铵溶液（pH 8.0）中。

通过将 P10 移液器吸头插入样品中（不吸取），并将吸头接触 pH 指示试纸来检测 pH 值。使用氢氧化铵和甲酸将 pH 值调节至 8.0。此后，所有涉及丙酸酐的操作均必须在通风橱中进行。

每次最多处理三到四个样品，以保持丙酸酐的反应活性。将丙酸酐与乙腈按体积比1:3混合，配制新鲜的丙酰化试剂。按体积比1:4将丙酰化试剂加入各样品中。

迅速加入氢氧化铵以将溶液的 pH 值重新调至 8.0。通常，按 1:5 的体积比向样品中加入氢氧化铵即可有效恢复至 pH 8.0。立即涡旋混匀。

检测pH值。将样品在室温下孵育15分钟。所有样品完成丙酰化后，在真空浓缩仪中将样品干燥至10至20 µL。

用ddH2O重悬或稀释样品，直至终体积达到40微升。由于盐类会干扰液相色谱和质谱分析，样品在分析前必须进行脱盐处理。在本视频中，仅演示阶段尖端（stage-tips）的构建过程。

使用 P1000 移液器吸头从固相萃取柱上打下一个 C18 材料圆片。用熔融石英毛细管将微型圆片从 P1000 吸头中推出，并送入 P100 或 P200 移液器吸头的底部。确保圆片牢固地卡在吸头底部。

若脱盐样品量超过25微克，请在同一支P100或P200吸头中使用两个C18微型盘。使用离心机适配器将尖端柱固定在1.5毫升或2毫升微量离心管中。通过离心加入50微升100%乙腈，以活化C18材料并去除潜在污染物。

随后按照方案文本所述进行样品脱盐。组蛋白肽存在多种同重素形式。组蛋白分析中两种常见且丰度较高的形式如图所示。

如上所示，它们的前体离子质量及其相对同位素的提取离子色谱图完全相同。然而，如下所示的产物离子提取离子色谱图则能够区分这两种同量异位素形式。仅应使用以红色标出的特异性碎片离子来估算这两种物质的相对丰度。

对经或未经视黄酸刺激的人类胚胎干细胞中提取的组蛋白进行了分析。两种组蛋白H3肽的相对定量结果显示，在诱导分化的人类胚胎干细胞中，乙酰化水平明显降低。该结果与先前报道一致，即与分化中的细胞相比，胚胎干细胞具有更高的乙酰化水平。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成：第一天进行组蛋白提取，第二天进行蛋白质衍生化与消化，第三天进行肽段衍生化、StageTip纯化及液相色谱-质谱（LC-MS）分析。组蛋白纯化除用于肽段分析外，还可应用于其他研究目的，包括中等长度肽段（middle-down）和自上而下（top-down）蛋白质组学，从而能够表征组蛋白的组合修饰模式。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于质谱的蛋白质组学方法来鉴定和定量组蛋白的翻译后修饰。