Name: 附NCAM作为一个案例研究聚唾液酸（PSA）:为河童（Vκ）抗体结合特异性含轻链人类（IgM抗体）抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 了解利用免疫沉淀和蛋白质印迹技术鉴定IgM抗体靶抗原的方法。该技术适用于神经科学和免疫学研究，有助于发现癌症及中枢神经系统疾病的新型生物标志物和治疗靶点。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（R01 GM092993、R01 NS048357 和 R21 NS073684）、美国国家科学基金会（CAREER 奖）、明尼苏达州生物技术与医学基因组学合作伙伴奖、国家多发性硬化症学会（CA1060A）以及梅奥诊所临床与转化科学中心（CCaTS）的资助。作者感谢Applebaum基金会、Hilton基金会、Peterson基金会、Sanford基金会、Moon和Marilyn Park主任基金以及McNeilus家族提供的支持。

促进髓鞘再生和中枢神经系统修复的抗体专利由梅奥诊所（Mayo Clinic）获得并持有。作者存在潜在的利益冲突。

人天然IgM自身抗体是免疫治疗的理想候选分子，已显示出治疗多种疾病（包括癌症和中枢神经系统疾病）的治疗潜力1-7。这些抗体的优势在于不会引发免疫反应，从而避免中和抗体的产生，而中和抗体的生成会显著降低有效治疗剂量和疗效。尤为重要的是，所有具有治疗潜力的抗体均为IgM同种型，并属于天然抗体（NAb）库3-5,8,9,37,40,42-45。IgM抗体在潜在临床应用中的主要障碍在于其抗原的鉴定，而许多情况下这些抗原仍不明确。通常用于IgG抗体的标准化技术往往不适用于鉴定IgM的抗原。
本方案描述了PSA-NCAM作为再生性人源IgM抗体HIgM12抗原的鉴定过程，该抗体在多发性硬化症（MS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）的动物模型中具有疗效15-18。所采用的方法主要适用于所有具有特异性Vκ轻链VκI、VκIII和VκIV的人源抗体，以及具有VκI轻链的小鼠抗体，而与抗体的同种型无关。
本方案中最关键的步骤是IgM抗体在亲和层析中的应用。更具体地说，需要成功的抗体作为下拉试剂，在免疫沉淀中从复杂的组织或细胞培养裂解液中分离或富集抗原。富集的抗原组分可与同型对照抗体的免疫沉淀产物进行比较，并通过质谱分析其差异。该步骤的一个基本要求或限制是必须存在正确的抗体Vκ轻链及宿主（人、小鼠），以使抗体能够结合蛋白L琼脂糖。使用与琼脂糖偶联的甘露糖结合蛋白（也称为甘露糖结合凝集素）替代蛋白L琼脂糖，可能是免疫沉淀不含特定Vκ轻链的IgM抗体的一种潜在替代方法。然而，正如Arnold et al.35 所述，抗原结合型IgM抗体无法与甘露糖结合蛋白结合，因为当IgM与其抗原结合后，目标糖链似乎变得不可接近。基于这些发现，甘露糖结合蛋白不能用作免疫沉淀负载抗原的IgM分子的结合基质35。其他可能的替代方法包括使用琼脂糖偶联的二抗抗IgM IgG抗体46,47，或使用表面活化的磁珠48。针对IgM的IgG抗体可通过化学交联固定于琼脂糖A或琼脂糖G上，以减少目标抗原共洗脱的抗体量。由于大多数免疫沉淀实验旨在分离或耗竭IgM，而并不关注其抗原，因此很难对不同IgM免疫沉淀方法在成功鉴定抗原方面的表现进行恰当比较。此外，使用IgM进行的免疫沉淀主要用于通过抗体与纯化抗原的孵育来确认已知或预期的单一抗原49。针对人IgM的琼脂糖偶联IgG抗体的一个缺点是，与起始材料相比，免疫沉淀获得的血清IgM分子产率极低（10–15%）50。相比之下，表面活化的磁珠已成功应用于包括IgM在内的不同同型抗体，用于免疫沉淀与瘙痒病相关的纤维48。该方法不受特定κ（Vκ）或λ（λ）链或特定宿主的限制，可显著拓宽可用于免疫沉淀的IgM抗体范围。
实验方案中的另一个重要步骤是抗体作为检测抗体（一抗）在Western印迹或其他筛选平台中发挥作用的能力。成功的抗体必须能够以足够高的亲和力靶向其抗原，从而在存在非离子型或可能为离子型去污剂的条件下仍能实现抗原结合。高亲和力抗体在经过亲和成熟过程的IgG抗体中较为常见，但在IgM同种型抗体中则较少见，这也是在生化研究背景下 commercially available 的IgM检测抗体相对较少的原因之一。高亲和力结合是分子抗原免疫共沉淀（immunoprecipitation, IP）和Western印迹的必要条件。降低IP缓冲液和裂解缓冲液中的去污剂浓度或完全不使用去污剂，可使低亲和力抗体通过其Fab区实现对抗原的识别与结合。相比之下，在不同浓度去污剂条件下，各类同种型对照抗体通过其Fc区与蛋白L琼脂糖结合的能力并未受到显著影响。然而，裂解缓冲液和IP缓冲液中去污剂浓度过低会阻碍细胞膜的破裂，进而影响特定分子的释放与分离。同样地，Western印迹洗涤缓冲液中若去污剂浓度偏低，例如， PBS-T 允许低亲和力抗体与抗原结合，但同时会增加非特异性结合，因此不可取。
抗原蛋白核心的存在是本方法的另一个必要条件。在蛋白质印迹中，可检测到具有翻译后修饰（例如，糖蛋白、脂蛋白）以及未经修饰的蛋白质，但无法检测单独的脂质或碳水化合物。无论是否存在去垢剂，均无法从组织或细胞裂解液中对脂质（例如，鞘脂类）进行免疫沉淀。由于去垢剂与脂质的理化性质极为相似，难以实现脂质与抗体之间的特异性结合；然而，去垢剂对于破坏细胞膜以实现特定分子的选择性分离又是必需的。据我们所知，迄今为止尚未有仅由碳水化合物组成且不含蛋白核心的免疫沉淀实验被报道。这一问题尤为重要，因为IgM抗体常靶向碳水化合物和糖脂，而这些分子并不一定与蛋白质单元相连。在缺乏蛋白核心的情况下，需采用其他层析技术来分离并进行脂质和碳水化合物的免疫学鉴定。例如，可通过细胞脂质的薄层层析（TLC），随后在TLC板上使用抗体进行检测（免疫-TLC）来实现这一目的51,52。
已有研究描述了其他抗PSA抗体，并将其结果与HIgM12以及市售的抗PSA IgM（克隆号2-2B）进行了比较。在PSA研究领域最常用的抗体是一种IgG抗体（克隆号735），可作为小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体获得 53该抗PSA IgG抗体可检测不同中枢神经系统细胞类型（包括小胶质细胞）上SynCAM和NCAM中的PSA 41与抗PSA IgG抗体不同，人IgM抗体HIgM12、HIgM42以及抗PSA小鼠IgM（克隆2-2B）在小鼠胚胎期及出生后早期的各个阶段均无法识别SynCAM上的PSA（但在NCAM上可以），而未多聚唾液酸化的SynCAM则易于检测 15所使用的IgM抗体也无法检测到小胶质细胞上的PSA图3和图4）。抗体亚型之间差异的可能解释是，PSA-SynCAM 的水平相较于 PSA-NCAM 较低，同时 IgM 抗体的结合亲和力可能低于抗 PSA IgG。为了验证这一假设，我们在胚胎期 E17 的 NCAM 基因敲除动物中进行了免疫沉淀实验，此时存在大量 SynCAM，并使用 HIgM12 作为抗体 &#34;下拉试剂&#34;15在E17野生型同窝对照中，HIgM12免疫沉淀PSA-NCAM的程度表现出相似的强度 &#34;下拉&#34; 通过使用洗脱抗原进行后续Western blot并采用密度测定法检测PSA-NCAM与IgM重链的比较，结果显示HIgM12对其靶标PSA至少具有足够的亲和力。与野生型同窝对照不同，HIgM12在NCAM基因敲除动物中未能检测到附着于SynCAM的PSA。使用人源抗PSA IgM（HIgM42）进行免疫沉淀实验也获得了相同的结果。HIgM12、HIgM42以及小鼠抗PSA IgM（克隆2-2B）在野生型和NCAM基因敲除动物胚胎期及出生后发育阶段的Western blot中，均无法识别与SynCAM结合的PSA。鉴于HIgM12仅需极低浓度（0.1 µg/ml）即可在使用少量中枢神经系统组织（每孔0.1 µg CNS组织）的Western blot中特异性检测到与NCAM结合的PSA 15 似乎不太可能仅因亲和力低，就导致在三种不同方法中均完全无法通过 HIgM12 检测到 PSA-SynCAM。
我们得出结论：抗PSA IgM抗体与常被报道的抗PSA IgG抗体（克隆735）之间存在显著差异。目前尚不清楚为何过去未更频繁地使用 commercially available 抗PSA IgM抗体来验证抗PSA IgG抗体735所获得的结果。这一点尤其值得关注，因为HIgM12已在多种疾病模型中证明具有疗效。尽管其他抗PSA IgM抗体可能具有类似的治疗效果，但抗PSA IgG抗体（克隆735）在多发性硬化（MS）和肌萎缩侧索硬化（ALS）模型中是否具有相似的治疗效果，仍有待明确。
简而言之，本文所述方法主要用于鉴定再生性人源抗体HIgM12的抗原，以支持多发性硬化症（MS）以及可能的其他神经退行性疾病潜在临床试验的开展。对于具有生物学活性的抗体而言，鉴定其抗原是理解其作用机制的关键步骤。这一点在当前大量单克隆抗体正在进行人体安全性与有效性试验的背景下尤为重要。尽管迄今为止进入临床试验的IgM类抗体数量较少，但近年来杂交瘤技术的进步，以及越来越多研究揭示了此类抗体具有治疗潜力1-10,37,40,42-45，迫切需要发展适用于鉴定非蛋白IgM抗原的新方法或改进方法。

IgM 类型的抗体在治疗包括癌症和中枢神经系统疾病在内的多种疾病方面展现出巨大的治疗潜力1-7。Vollmers 研究团队在癌症患者中鉴定出大量抗体，这些抗体有望作为肿瘤特异性生物标志物或活性治疗剂，能够通过诱导凋亡通路来杀伤恶性细胞4,8,9。有趣的是，所有被鉴定出具有治疗潜力的抗体均为 IgM 类型，并属于&#34;天然自身抗体&#34;（NAbs）这一类别。
同样，Rodriguez 团队鉴定出能够促进多发性硬化症（MS）模型中慢性脱髓鞘脊髓病变再髓鞘化的鼠源和人源抗体。与具有抗肿瘤效应的抗体相同，所有促进再髓鞘化的抗体均为天然抗体（NAbs），且属于IgM同种型1,6,7,10。目前大多数已鉴定的IgM抗体的精确抗原仍不明确，包括正处于MS患者I期临床试验阶段的人源再髓鞘化促进抗体rHIgM2211。尽管学术界以及与工业界合作的脂质和碳水化合物研究领域专家已多次尝试11，但仍未成功鉴定出rHIgM22的抗原。用于鉴定IgG抗体抗原的标准技术在IgM抗体上的失败，凸显出亟需优化针对此类抗体的鉴定方法，因为IgM抗体极有可能识别的是碳水化合物或脂质类抗原。
本文的重点是人源再生性抗体HIgM12及其抗原鉴定所用的实验方法。抗体HIgM12最初从华氏巨球蛋白血症患者中鉴定获得，可在体外促进神经突起生长in vitro12-14，其靶标为附着于神经细胞黏附分子上的多聚唾液酸（PSA-NCAM）15,16。HIgM12可在肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中延长寿命17，并改善泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染小鼠的功能预后。具体而言，在慢性脱髓鞘小鼠模型中，单次低剂量腹腔注射HIgM12后八周，可促进小鼠自发的水平与垂直运动活动，并增加脊髓中小至中等直径轴突的数量18。
神经细胞黏附分子（NCAM）是一种表达于神经元、胶质细胞、骨骼肌细胞和自然杀伤细胞表面的免疫球蛋白（Ig）超家族糖蛋白19-25。三种主要的NCAM亚型，即NCAM180、NCAM140和NCAM120，是同一初级转录本的选择性剪接变体，仅在其胞质区存在差异。在中枢神经系统（CNS）中，NCAM是主要的多聚唾液酸化分子（&#62; 95%），带有长链、带负电荷的唾液酸同聚物。当唾液酸聚合度n &#62; 10时称为多聚唾液酸（PSA），但也存在较短的寡聚结构，同样具有生物学意义。在中枢神经系统中表达的其他多聚唾液酸化蛋白包括SynCAM126、神经纤毛蛋白-2（NRP-2）27,28以及一种钠离子通道亚基25（综述见29）。
本文所述方法可用于鉴定含特定κ（Vκ）轻链的人和小鼠免疫球蛋白的抗原，这些轻链包括人源抗体的VκI、VκIII或VκIV轻链，以及小鼠抗体的VκI轻链，而无需考虑抗体的同种型（例如 IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）。该限制源于在IgM同种型抗体的免疫沉淀中使用了蛋白L琼脂糖。替代策略可包括使用甘露糖结合凝集素，或使用共价连接至琼脂糖珠的次级IgG抗IgM抗体，这些方法可能扩展本方法的应用范围，使其适用于更多含λ（λ）轻链的IgM抗体（见讨论部分）。健康个体血清中IgM Vκ轻链与IgM λ轻链的比例为1.5:130。
根据此处用于分离、富集和免疫学检测特定分子的色谱方法31，所有抗原必须至少包含一个小的蛋白质结构域。抗体的特异性结合表位可位于该蛋白质结构域内部或外部（例如，在糖蛋白、脂蛋白中）。为鉴定HIgM12的特异性抗原并缩小潜在候选分子范围，所采用的初步生化步骤是本方法中最关键的环节。文中以胶质细胞为例描述了细胞类型特异性的制备方法及基于细胞形态学的鉴定特征，但该方法可推广应用于中枢神经系统内或外的其他细胞类型。
迫切需要开发新的或改进的技术，以适用于越来越多具有治疗潜力的IgM抗体，特别是在那些抗体靶点为碳水化合物或脂质结构的人类疾病（占IgM抗原的大多数情况）中。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>高糖，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠，500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，高糖</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml，100 ml</td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 补充剂 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>无血清，10 ml</td></tr><tr><td>胎牛血清 - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>无菌冲洗用水</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1,000 ml，12/箱</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &amp;middot; xHBr，分子量 30,000–70,000 g/mol，50 mg</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 V 组分</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>热休克组分，无蛋白酶，pH 7，&amp;nbsp; 纯度 98%，100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;，分子量：180.16 g/mol，ACS 试剂，500 g</td></tr><tr><td>牛胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>基本无盐，冻干粉末，9,000 BAEE 单位/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>IV 型，冻干粉末，2,000 Kunitz 单位/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>重组大鼠碱性 FGF 蛋白</td><td>R&amp;D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>以 BSA 为载体蛋白，25 &amp;#181;g，冻干，&gt; 95%，16.2 kDa</td></tr><tr><td>重组大鼠 PDGF-AA 蛋白</td><td>R&amp;D systems</td><td>1055-AA-50</td><td>无载体，50 &amp;#181;g，冻干，&gt; 97%，&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;来源，12.5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml，不含谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>结晶状，1 kg，试剂级，分子量 30.03 g/mol（以单体计）</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris 碱)</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg，99.8% 纯度，粉末</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg，粉末</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，分子量：75.07 g/mol，白色结晶粉末，5 kg</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl，分子量：58.44 g/mol，5 kg</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，分子量：119.98 g/mol，500 g</td></tr><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>不含钙和镁，6 × 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC 处理细胞培养皿</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>60 mm 细胞培养皿，TC 处理聚苯乙烯，20/包，无菌</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm × 15 mm 培养皿</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>非 TC 处理细菌培养皿，20/包</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 孔，平底（单独包装），γ 射线灭菌，生长面积 9.5 cm²</td></tr><tr><td>75 cm&amp;sup2; 组织培养瓶</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&amp;sup2; 倾斜颈 U 形细胞培养瓶，带塞密封盖</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Protein L Plus 琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml，交联 6% 珠状琼脂糖 (CL-6B)，结合能力：10–20 mg IgG</td></tr><tr><td>4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10 孔，50 &amp;micro;l，适用于 Mini-PROTEAN 电泳槽</td></tr><tr><td>Immobilon-P 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF，0.45 &amp;micro;m，26.5 cm × 3.75 m 卷装</td></tr><tr><td>抗多聚唾液酸-NCAM 抗体，克隆</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 微升，宿主：小鼠，单克隆 IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml，4x 预混蛋白样品缓冲液</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml，98% 纯度，14.2 M</td></tr><tr><td>内切神经氨酸酶-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 微升，200 &amp;micro;g/ml，3,500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm 玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>圆形，No. 1；厚度：0.13–0.17 mm；尺寸：25 mm</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml，1 M</td></tr><tr><td>1x Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml，不含钙、镁、酚红</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>冻干粉末，100 mg</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>粉末，500 g</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml，200 mM&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

针对含kappa (vκ) 轻链的人源（igm）抗体的抗体结合特异性：以附着于ncam的多唾液酸（psa）为例的研究

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

IgM 同种型抗体在人类临床试验、人类疾病动物模型以及常规实验室检测技术中，常被忽视其作为潜在治疗剂或检测试剂的应用价值。然而，已有多种人源 IgM 抗体在癌症模型及中枢神经系统（CNS）疾病模型（包括多发性硬化症（MS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））中显示出疗效证据。IgM 抗体未被充分重视的原因包括：IgM 抗体在表达、纯化和稳定性方面的技术困难，难以鉴定（非蛋白类）抗原，其结合亲和力较低，以及在糖类和脂质研究领域存在基础认知的空白。
本文以 HIgM12 为例，提供了一套通过蛋白质印迹（Western blotting）、免疫共沉淀和免疫细胞化学方法检测抗原的详细实验方案。HIgM12 靶向与神经细胞黏附分子（NCAM）结合的多聚唾液酸（PSA）。为评估 NCAM 对 HIgM12 结合的重要性，实验采用了野生型（WT）小鼠和 NCAM 基因敲除（KO）小鼠的早期出生后脑组织，其中 KO 小鼠缺失中枢神经系统（CNS）中三种主要的剪接变体 NCAM180、140 和 120。进一步对 CNS 组织和培养的 CNS 细胞进行内切唾液酸酶消化处理，使我们确定 PSA 是 HIgM12 特异性结合的表位。

本部分展示了通过研究中枢神经系统中人IgM特异性PSA抗原可获得的结果示例。展示了在生化实验条件下及荧光免疫细胞化学中使用含特异性Vκ轻链的人IgM抗体的方法。
HIgM12 可从脑组织裂解液中免疫沉淀其抗原，并在蛋白质印迹实验中作为检测抗体（一抗）使用。同型对照抗体和琼脂糖L珠均未免疫沉淀出类似抗原，表明该免疫沉淀具有特异性图1）。使用野生型（WT）和NCAM基因敲除（KO）小鼠的中枢神经系统（CNS）裂解物进行的Western印迹实验表明，HIgM12特异性结合含有PSA的NCAM（图2A). 利用ENDO-NF对野生型小鼠中枢神经系统组织进行酶消化，鉴定出与NCAM相连的PSA是HIgM12的特异性结合表位图2B). 采用本文所述方法，可获得高纯度的 IBA-1 阳性大鼠小胶质细胞培养物（图3）。市售的抗PSA抗体（克隆号2-2B）通过荧光显微镜检测，在固定并通透处理的IBA-1阳性小胶质细胞中，无法标记细胞表面或细胞内的PSA表达位点。该结果与既往文献报道一致，即小胶质细胞不表达PSA-NCAM于细胞表面。 16,41 HIgM12 不标记纯化的大鼠小胶质细胞表面抗原。有趣的是，HIgM12 对经固定和通透处理的小胶质细胞进行标记时，呈现出非局限于特定细胞器的胞内近核周分布模式。图3）结果与使用抗PSA IgG抗体（克隆735）所获得的结果相反 26，该靶点作用于小胶质细胞高尔基体水平的PSA-SynCAM 41.
与小胶质细胞不同，HIgM12 和 A2B5 在活细胞条件下可靶向高度富集的大鼠 OPC 培养物中的细胞表面抗原（图4OPC 培养物中含有约 5% 的污染性小胶质细胞。 图5 在GFAP阳性的星形胶质细胞中，HIgM12与抗PSA单克隆抗体（克隆号2-2B）显示出几乎相同的细胞表面染色模式（图 5A）。使用HIgM12对经ENDO-NF消化的野生型星形胶质细胞与缓冲液对照处理的野生型星形胶质细胞进行免疫荧光标记，结果显示星形胶质细胞表面存在PSA图5B)。PSA阳性星形胶质细胞的存在 体内 仍需进一步证实。
<img alt="免疫沉淀结果；Western 印迹显示蛋白质条带；分子量范围为 39-204 kDa。" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：HIgM12 在免疫沉淀中作为“拉下”试剂。 使用 HIgM12、人同型对照 HIgM126 或仅琼脂糖 L 珠作为“拉下”试剂，从小鼠三个月龄全脑裂解液中进行免疫沉淀。洗脱的蛋白质通过 Western 印迹分析，并用 HIgM12 探针孵育膜。HIgM12 包被珠子洗脱的蛋白质分子量范围为 160–200 kDa，此外还有 IgM 重链（约 65–73 kDa）。该图已根据 J. Neurochem.15 修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="通过ENDONO进行NCAM基因敲除的脑组织蛋白印迹分析。蛋白条带：HlgM12、PSA、β-actin。" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2">
图2：HIgM12 靶向 NCAM 上的多聚唾液酸（PSA）部分。A. 分别提取出生后第7天（P7）、第13天（P13）、第16天（P16）和第27天（P27）的 NCAM 全基因敲除小鼠及其杂合子同窝对照小鼠的脑组织匀浆，通过 Western 印迹检测，膜上分别用 HIgM12、PSA 和 β-actin（作为上样对照）进行探针杂交。 B. 将 10 µg 成年野生型（WT）小鼠脑裂解液（溶于含 1% NP40 的 PBS 中，pH 6.5）分别与内切神经氨酸酶 N（ENDO-N）或具有 α2-3 多聚唾液酸聚合物特异性的（外）神经氨酸酶（Sialidase）或 PBS 在 37 ºC 下孵育过夜，每组样品均设置重复，进行 Western 印迹分析，并用 HIgM12、PSA 和 β-actin（作为上样对照）进行探针检测。该图改编自 J. Neurochem.15。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，IBA-1，HlgM12，PSA (2-2B)，DAPI，活细胞与固定细胞，叠加比较。" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：大鼠小胶质细胞缺乏PSA的现象与HIgM12标记缺失一致。 将大鼠小胶质细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上培养48小时，随后在冰上对活细胞进行HIgM12标记，或在固定后使用HIgM12或抗PSA单克隆抗体（克隆株2-2B）标记。细胞经三重标记：小胶质细胞标志物IBA-1（绿色）、HIgM12/PSA（红色）和DAPI（蓝色）。图像显示，HIgM12在大鼠原代小胶质细胞表面无结合信号（上排），抗PSA抗体（克隆株2-2B）在细胞表面及胞内储存部位均无结合信号（下排）。根据双极形态及IBA-1染色缺失，下排中少量PSA阳性细胞被推测为少突胶质前体细胞（OPC）。在固定细胞中，HIgM12染色呈现点状、围绕核周的分布模式，不局限于特定细胞器，被视为非特异性结合（中排）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞分化标志物的相差与荧光显微镜图像：A2B5、CD68、DAPI。" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： HIgM12 靶向大鼠 OPCs 细胞表面的 PSA-NCAM。 将大鼠 OPCs 和小胶质细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，于增殖培养基中培养 4 天，并在冰上用 HIgM12 或 A2B5（绿色）、巨噬细胞/单核细胞内标志物 CD68（克隆 ED-1）（红色）和 DAPI（蓝色）对活细胞进行三重标记。图像显示主要表达 OPC 标志物 A2B5（上排）和 HIgM12（下排）的细胞群体，仅有少量 CD68 阳性的小胶质细胞（约 5%）。添加相差图像和 DAPI 图像以显示各细胞群体的细胞完整性及细胞数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="星形胶质细胞免疫染色；GFAP、HIgM12、PSA。示意图；野生型 vs NCAM 基因敲除，缓冲液 vs Endo-NF。" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： HIgM12 与抗 PSA 单克隆抗体在小鼠混合胶质细胞中共同标记一类星形胶质细胞亚群。A. 来自野生型（WT）和 NCAM 全基因敲除（KO）动物的小鼠混合胶质细胞，包含星形胶质细胞、少突胶质细胞系细胞和小胶质细胞，培养 3 天后，在冰上进行活细胞标记，使用 HIgM12（绿色）、抗 PSA 单克隆抗体（克隆 2-2B）（红色），随后标记星形胶质细胞标志物 GFAP（紫色）和 DAPI（蓝色）。HIgM12 与抗 PSA 抗体在 GFAP 阳性的野生型星形胶质细胞上显示出几乎完全相同的染色模式，但在 NCAM 基因敲除小鼠的培养星形胶质细胞上无结合信号。本图改编自 J. Neurochem.15。 B. 混合胶质细胞的培养条件与 A 部分所述相同，经内切神经氨酸酶-NF（由 Dr. Martina Muehlenhoff 惠赠）或 PBS 对照处理过夜。细胞在冰上进行活细胞标记，使用 HIgM12（绿色），随后对胞内标志物 GFAP（红色）和 DAPI（蓝色）进行染色。HIgM12 可靶向 PBS 对照处理的混合胶质细胞培养物中的细胞表面抗原，但不能靶向经内切神经氨酸酶-NF 处理的混合胶质细胞。本图改编自 JNSCI16。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
所有图像均使用相同的仪器设置在 60 倍放大倍数下拍摄，并以相同方式处理。
<img alt="Western blot 和细胞培养缓冲液配方、表格图表、研究用途、方法组分。" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Table 1"> 
表1：缓冲液与溶液配方。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">请点击此处下载该表格。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>中枢神经系统组织</td>
			<td>ENDO-NF/PBS</td>
			<td>裂解缓冲液</td>
			<td>总体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. WT小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl (12 µg) ENDO-NF</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. WT小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl PBS</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. WT小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>无PBS或ENDO-NF</td>
			<td>9.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. NCAM基因敲除小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl (12 µg) ENDO-NF</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. NCAM基因敲除小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl PBS</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. NCAM基因敲除小鼠</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>无PBS或ENDO-NF</td>
			<td>9.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：P7野生型和NCAM基因敲除小鼠中枢神经系统组织的ENDO-NF消化。

我们提出了一种用于鉴定含有人和小鼠IgM抗体抗原的蛋白质组分的方案，这些抗体具有特异性的κ（Vκ）轻链。该方案不仅限于IgM类抗体，也适用于在免疫沉淀过程中能够以足够高亲和力结合其抗原的所有免疫球蛋白同种型。

针对含Kappa (Vκ) 轻链的人源（IgM）抗体的抗体结合特异性：以附着于NCAM的多唾液酸（PSA）为例的研究

IgM同种型抗体在人类临床试验、人类疾病动物模型以及检测试剂中常被忽视作为潜在治疗剂的作用……

本实验的总体目标是鉴定具有治疗潜力的抗体（尤其是IgM亚型）所对应的抗原。该方法填补了生物医学领域的一项知识空白，可能有助于发现用于癌症研究和中枢神经系统疾病的新生物标志物及免疫治疗剂。该技术的主要优势在于，它为一类具有巨大治疗潜力但长期被忽视的抗体打开了研究大门。该技术的应用前景可拓展至所有可通过抗体类药物进行靶向治疗的疾病的诊断与治疗。本研究有助于深入了解IgM抗体的抗原特性以及组织生长和亚培养过程。此外，该方法还可用于研究来自所有物种的其他抗体同种型。当我意识到IgM抗体在不同生化应用中具有特异且显著的结合能力时，我首次产生了本方法的构想。Robert Kahoud和Jens Watzlawik将演示该实验操作。开始此操作时，在耳平面对颅骨前部进行切割，并掀开颅骨。然后，将脑组织轻轻放入一个15毫升离心管中，并立即置于干冰上保存。五分钟后，将脑组织转移至一张洁净的称量纸上，使用干净的刀片迅速去除小脑和脑干。接着，称量冷冻的大脑皮层，然后将其重新放回置于冰上的15毫升离心管中。向裂解缓冲液中加入预冷的裂解缓冲液，使脑组织的终浓度为每微升裂解缓冲液含150微克脑组织。然后，通过1毫升移液器吸头反复吹打，再用配有27号针头的5毫升注射器反复吹打，将脑组织在裂解缓冲液中充分匀浆。随后，将脑组织裂解液置于冰上继续孵育30分钟，以确保组织完全裂解。30分钟后，通过连续离心去除去污剂、不溶性物质和脑脂质。弃去含有髓鞘和细胞碎片的沉淀，但每次离心后均保留上清液。将脑组织裂解液分装，并于-80摄氏度保存。在此步骤中，配制 200 毫升含 BSA 的 IP 缓冲液以及另外 200 毫升不含 BSA 的 IP 缓冲液。进行免疫沉淀反应时，将 100 微升 Protein L 琼脂糖凝胶悬液转移至一个 1.5 毫升微量离心管中，然后向管中加入 1 毫升含 BSA 的 IP 缓冲液。然后，通过倒置手动混匀。接着，通过离心对 Protein L 琼脂糖珠进行四次洗涤。之后，小心去除上清液，避免扰动琼脂糖沉淀，并重复洗涤步骤三次。然后，向含BSA的IP缓冲液中加入Protein L琼脂糖，并在4摄氏度下于旋转仪上孵育过夜。在800微升含BSA的IP缓冲液中加入30毫克裂解脑组织及20微克实验抗体、对照抗体或PBS。将30毫克裂解脑组织与冰冻IP缓冲液中的IgM抗体在1.5毫升微量离心管中于4摄氏度孵育过夜。第二天，在台式离心机中离心 Protein L 琼脂糖珠。弃去上清液，注意不要扰动琼脂糖沉淀。然后，将预冷的抗体-脑组织裂解液加入 Protein L 琼脂糖中。将抗体-抗原与Protein L琼脂糖悬液在4°C的摇床上孵育两小时。孵育两小时后，通过离心洗涤与琼脂糖L结合的抗体-抗原复合物。小心弃去上清液，避免扰动沉淀物，并向其中加入1毫升含0.2% BSA的冰上预冷IP缓冲液。使用含 0.2% BSA 的冰冻 IP 缓冲液再洗涤一次，随后使用不含 BSA 的冰冻 IP 缓冲液额外洗涤两次。之后，离心收集与琼脂糖 L 结合的抗体-抗原复合物。使用 200 微升移液器弃去上清液，直至蛋白 L 琼脂糖沉淀上方剩余约 50 微升溶液。然后，使用 10 微升移液器将其完全移除。将所有样品置于冰上。随后，向每个1.5毫升微量离心管中加入40 µL免疫沉淀洗脱缓冲液。用手指轻弹管壁六次，并在95 °C下加热5分钟。随后，将样品置于冰上孵育两分钟，并以30秒离心。然后，将35 µL上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，注意不要扰动沉淀。接下来，通过沿管壁内侧冲洗少量稀释后的样品，确认其中无Protein L琼脂糖微珠残留。如果存在Protein L琼脂糖珠，将样品在13,000 × g下离心30秒，然后将上清液转移至洁净离心管中。重复此步骤，直至无法检测到琼脂糖珠。随后，每孔上样10–20 µL稀释后的样品，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶及Tris-甘氨酸SDS缓冲体系，在常温下以100伏电压电泳约1小时，无需额外冷却。随后，将蛋白质转移至PVDF膜上。在4°C冷室中，使用预冷的转膜缓冲液，于100伏电压下转移2.5小时。在室温下，将膜置于含10%（w/v）脱脂奶粉的PBS-T溶液中，在水平摇床上封闭1小时。用 PBS-T 洗涤两次，每次 10 分钟。在含 5% BSA 的 PBS-T 中加入一抗孵育膜。在低温室中于摇床上孵育过夜。次日早晨，在25 °C条件下，先用过量PBS-T在摇床上清洗膜一次，随后在摇床上用PBS-T再清洗三次，每次10分钟。接着，将二抗与5%脱脂奶粉溶于PBS-T中，加入膜上，在25 °C摇床上孵育一小时。之后，在25 °C条件下，先用过量PBS-T清洗膜一次，再在摇床上用PBS-T清洗三次，每次10分钟。将1毫升预冷的辣根过氧化物酶增强化学发光底物A组分与1毫升B组分在25摄氏度下混合。将膜转移至纸巾上以去除多余液体，然后用纸巾擦干容器，再将膜转移回容器中。立即向膜上加入2毫升预混的增强型化学发光HRP底物，在25摄氏度孵育2分钟。每20秒手动倾斜容器一次，使膜均匀润湿。随后将膜转移至透明塑料封袋中，用纸巾去除多余液体和气泡。将塑料套管固定在胶带盒中并关闭盒盖。该图显示，HigM12 可从脑组织裂解液中免疫沉淀其抗原，并在 Western 印迹中作为检测试剂发挥作用。同型对照抗体和琼脂糖 L 珠均未免疫沉淀出类似抗原，表明该免疫沉淀具有特异性。此处利用野生型和NCAM基因敲除小鼠的中枢神经系统（CNS）裂解物进行的Western印迹实验，证明了HIgM与含多唾液酸（PSA）的NCAM特异性结合。通过使用ENDO-NF酶消化野生型小鼠的中枢神经系统组织，鉴定出附着于NCAM的PSA是HIgM12的特异性结合表位。采用本文所述方法，可获得高纯度的IBA-1阳性大鼠小胶质细胞培养物。与小胶质细胞不同，在活细胞条件下，HIgM12和A2B5所靶向的细胞表面抗原在大鼠少突胶质前体细胞（OPC）培养物中高度富集。一旦掌握，该技术可在13个工作小时内完成。通过此方法，还可采用Biacore或表面等离子体共振技术等其他方法，测定抗体与抗原的结合亲和力及结合常数。该技术建立后，为癌症研究、免疫治疗以及天然自身抗体领域的研究人员提供了识别蛋白质上碳水化合物表位的途径，从而用于鉴定人治疗性IgM抗体的抗原靶点。观看本视频后，您应能充分了解如何鉴定含有人类 IgM 抗体的研究工作中所涉及的糖蛋白抗原。该数据为多发性硬化症（MS）治疗提供了新的靶点。PSA ENCAP 是我们开发的一种抗体疗法，也是首批在采用严格疾病模型且病理特征与多发性硬化症相似的疾病中，通过活动箱实验显示出功能改善的治疗方法之一。

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

附NCAM作为一个案例研究聚唾液酸（PSA）：为河童（Vκ）抗体结合特异性含轻链人类（IgM抗体）抗体

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本方案描述了两种IgG类单克隆抗体（mAbs）的制备，这些抗体对鲸目动物的肌红蛋白具有强反应性。这些单克隆抗体被应用于基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条，以区分鲸目动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。...

基于胶体金的免疫层析试纸条的研制及其在鲸类肌红蛋白检测中的应用

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。...

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

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天然产物单克隆抗体的制备

本文介绍了一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中制备双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的实验方案。纯化后的 GPC3-S-Fab 对 GPC3...

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利用X射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

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从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

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通过非天然氨基酸引入与点击化学联用制备均一糖缀合物用于疫苗目的

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测定放射性标记抗体与固定化抗原结合亲和力（KD）

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使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

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