针对含Kappa (Vκ) 轻链的人源（IgM）抗体的抗体结合特异性：以附着于NCAM的多唾液酸（PSA）为例的研究

本实验的总体目标是鉴定具有治疗潜力的抗体（尤其是IgM亚型）所对应的抗原。该方法填补了生物医学领域的一项知识空白，可能有助于发现用于癌症研究和中枢神经系统疾病的新生物标志物及免疫治疗剂。该技术的主要优势在于，它为一类具有巨大治疗潜力但长期被忽视的抗体打开了研究大门。

该技术的应用前景可拓展至所有可由抗体类治疗药物靶向的疾病的诊断与治疗。该方法可用于研究IgM抗体的抗原，以及组织的生长和继代培养。此外，它也可能适用于来自所有物种的其他抗体同种型。

当我意识到IgM抗体在不同生化应用中具有特异且显著的结合能力时，我首次提出了这一方法。Robert Kahoud和Jens Watzlawik将演示该操作过程。开始此操作时，在耳部水平处向前方切开颅骨，并将颅骨剥离。

然后，将脑组织轻轻放入一个15毫升离心管中，并立即置于干冰上保存。五分钟后，将脑组织转移至一张洁净的称量纸上，使用干净的刀片迅速去除小脑和脑干。接着，在将大脑半球重新放回置于冰上的15毫升离心管之前，迅速称量其冷冻状态下的质量。

向裂解缓冲液中加入冰冷的裂解缓冲液，使脑组织的终浓度为每微升裂解缓冲液含150微克脑组织。然后，使用1毫升移液器吸头反复吹打使脑组织在裂解缓冲液中匀浆，随后用配有27号针头的5毫升注射器进一步吹打匀浆。之后，将脑组织裂解液置于冰上继续孵育30分钟，以确保组织完全裂解。

30 分钟后，通过连续离心去除去垢剂、不溶性物质和脑脂质。弃去含有髓鞘和细胞碎片的沉淀，但每次离心步骤后均保留上清液。将脑组织裂解液分装，并于 -80 °C 保存。

在此步骤中，配制 200 毫升含 BSA 的 IP 缓冲液和另外 200 毫升不含 BSA 的 IP 缓冲液。进行免疫沉淀反应时，将 100 微升 Protein L 琼脂糖凝胶悬液转移至一个 1.5 毫升微量离心管中，然后向该管中加入 1 毫升含 BSA 的 IP 缓冲液。

然后，通过倒置手动混匀。接着，通过离心法将Protein L琼脂糖珠洗涤四次。之后，去除上清液时注意不要扰动琼脂糖沉淀，并重复洗涤步骤再进行三次。

然后，向含 BSA 的 IP 缓冲液中加入 Protein L 琼脂糖，并在 4 摄氏度下于旋转仪上孵育过夜。在含有 BSA 的 800 微升 IP 缓冲液中加入 30 毫克裂解的脑组织，再加入 20 微克的实验抗体、对照抗体或 PBS。将 30 毫克裂解的脑组织与冰上预冷的 IP 缓冲液及 IgM 抗体加入 1.5 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天，在台式离心机中离心 Protein L 琼脂糖珠。弃去上清液，注意不要扰动琼脂糖沉淀。然后，将预冷的抗体-脑组织裂解液加入 Protein L 琼脂糖中。

将抗体抗原与Protein L琼脂糖悬液在4摄氏度下于旋转仪上孵育两小时。两小时后，通过离心洗涤与琼脂糖L结合的抗体抗原复合物。小心弃去上清液，避免扰动沉淀物，并向其中加入含有0.2% BSA的1毫升冰上预冷的IP缓冲液。

使用含0.2% BSA的预冷免疫沉淀缓冲液再洗涤一次，随后使用不含BSA的预冷免疫沉淀缓冲液额外洗涤两次。之后，离心收集与琼脂糖L结合的抗体-抗原复合物。使用200微升移液器弃去上清液，直至蛋白L琼脂糖沉淀上方残留约50微升溶液，然后使用10微升移液器将其完全移除。

将所有样品置于冰上。随后，向每个1.5毫升微量离心管中加入40 µL免疫沉淀洗脱缓冲液。用手指轻弹管壁六次，并在95 °C下加热5分钟。

随后，将样品置于冰上静置两分钟，并以30秒离心。然后，将35 µL上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，注意不要扰动沉淀。接下来，沿管壁内侧冲洗少量稀释后的样品，以确认不存在Protein L琼脂糖珠。

如果存在Protein L琼脂糖珠，将样品在13,000 × g下再次离心30秒，并将上清液转移至洁净离心管中。重复此步骤直至无法检测到琼脂糖珠。随后，每孔上样10–20 µL稀释后的样品，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶及Tris-甘氨酸SDS缓冲体系，在常温下以100伏电压电泳约1小时，无需额外冷却。

随后，将蛋白质转移至 PVDF 膜。在4℃冷室中，使用低温转移缓冲液，于100伏电压下电转2.5小时。在室温下，将膜置于含10%（重量/体积）脱脂奶粉的PBS-T溶液中，在摇床上封闭1小时。

用 PBS-T 每次 10 分钟，洗涤两次。在含 5% BSA 的 PBS-T 中加入一抗孵育膜。在冷室中于摇床上过夜孵育。

次日早晨，用过量 PBS-T 在 25 摄氏度下洗涤膜一次，随后在摇床上用 PBS-T 每次 10 分钟，共洗涤三次。接着，将二抗和 5% 脱脂奶粉溶于 PBS-T 中加入膜上，在摇床上 25 摄氏度孵育一小时。之后，用过量 PBS-T 在 25 摄氏度下洗涤膜一次，随后在摇床上用 PBS-T 每次 10 分钟，共洗涤三次。

将1毫升冷藏的增强型化学发光HRP底物组分A与1毫升组分B在25°C下混合。将膜转移至纸巾上以去除多余液体。然后，在将膜重新转移回容器之前，用纸巾将容器擦干。

立即向膜上加入 2 毫升预混的增强型化学发光 HRP 底物，在 25 摄氏度孵育 2 分钟。每 20 秒手动倾斜容器一次，使膜均匀润湿。随后，将膜转移至透明塑料封套中，并用纸巾去除多余的液体和气泡。

将塑料套管固定在胶带盒中并关闭。该图显示，HigM12 可从大脑脑组织裂解液中免疫沉淀其抗原，并在 Western 印迹中作为检测试剂发挥作用。同型对照抗体和琼脂糖 L 珠均未免疫沉淀出类似抗原，表明该沉淀具有特异性。

此处利用野生型和NCAM基因敲除小鼠的中枢神经系统（CNS）裂解物进行的Western印迹实验，证明了HIgM与含有多聚唾液酸（PSA）的NCAM特异性结合。通过使用ENDO-NF酶消化野生型小鼠的中枢神经系统组织，鉴定出连接在NCAM上的PSA是HIgM12的特异性结合表位。采用本文所述方法，可获得高纯度的IBA-1阳性大鼠小胶质细胞培养物。与小胶质细胞相反，在活细胞条件下，HIgM12和A2B5所靶向的细胞表面抗原在大鼠少突胶质前体细胞（OPC）培养物中高度富集。

一旦掌握，该技术可在13个工作小时内完成。采用此方法后，可进一步使用Biacore或表面等离子共振技术等其他方法，测定抗体与抗原的结合亲和力及结合常数。该技术的建立，为癌症研究、免疫治疗和天然自身抗体领域的研究人员提供了识别蛋白质上碳水化合物表位的途径，从而用于鉴定人源治疗性IgM抗体的抗原靶点。

观看本视频后，您应能充分了解如何鉴定含有人类 IgM 抗体的研究工作中所涉及的糖蛋白抗原。该数据为多发性硬化症（MS）治疗提供了新的靶点。PSA ENCAP 是我们开发的一种抗体疗法，也是首批在采用严格疾病模型且病理特征类似于多发性硬化症的活动箱实验中显示出功能改善的治疗方法之一。