A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

本实验的总体目标是通过使用 CRISPR-Cas9 技术提高突变痘苗病毒的生成效率。这种方法可以帮助创造新的痘苗病毒载体，用于生物学研究和医学研究，特别是用于基因治疗和疫苗接种。使用这种方法进行病毒检测至关重要，因为很难识别和发现阳性斑块。

这种技术的主要优点是它大大提高了使我们的突变体成为牛痘病毒的效率。从收获的 CV-1 细胞开始，将其浓度调整为每毫升 100， 000 个细胞。然后将 2 mL 悬浮液接种到 6 孔板的每个孔中进行转染。

第二天，用 0.5 ng gRNA-N2 质粒和 0.5 ng/pSTCas9 质粒转染细胞。然后孵育 24 小时。24 小时后，更换培养基。

接下来，准备 VVL15 病毒。用 DMEM 将骨架 VVL15 病毒稀释至每毫升 200， 000 PFU。然后将 100 微升稀释的病毒加入转染的 CV-1 细胞的每个孔中。

2 小时后，用 1 μg 穿梭供体载体转染细胞以表达 HR，并孵育细胞 24 小时。第二天，使用细胞刮刀分离转染的 CV-1 细胞。然后将细胞悬液收集到冷冻管中，并在零下 80 摄氏度下储存以备将来使用。

为了开始第一轮纯化修饰的 VV，每孔接种 15 个六孔板，每孔 300， 000 个未修饰的 CV-1 细胞。第二天，将转染的 CV-1 细胞的冷冻悬液在 37 摄氏度下解冻 3 分钟，然后剧烈涡旋悬液 30 秒以裂解细胞。然后用 3 ml DMEM 稀释 1 μL 裂解物。

将半毫升这种稀释液添加到未修饰的 CV-1 细胞的每个板孔中。然后将板放回培养箱中两天。两天后，使用荧光显微镜识别 RFP 阳性斑块。

可以用 10 倍物镜发现它们。识别出斑块后，使用记号笔准确标记板下方的斑块。现在为每个要收获的阳性噬菌斑准备一个含有 200 μL 无血清 DMEM 的冷冻管。

接下来，重要的是从带有标记噬菌斑的孔中吸出所有培养基。然后，使用 200 微升移液器组吸出 30 微升，从冷冻管中部分加载 10 微升培养基，然后刮擦斑块并吸取细胞与剩余的抽吸。将其弹出到冷冻管中，再重复此过程两次，靶向相同的 RFP 阳性噬菌斑以收集尽可能多的细胞。

将收集的样品储存在零下 80 摄氏度，或者如果要立即进行第二轮纯化，请将冻存管在干冰上冷冻 10 分钟。第二轮纯化修饰的 VV 与第一轮一样，使用第一轮的冷冻细胞进行。但是，对于每个 RFP 阳性线，可以选择六个以上的 RFP 阳性斑块。

重复选择过程，直到由一个阳性斑块形成的所有斑块都是 RFP 阳性，表明该斑块是纯净的，这可能需要额外的三到五轮。提前一天，准备一个六壁板，每孔有五十万个 CV-1 细胞。第二天，将冷冻的纯化牙菌斑在 37 摄氏度下解冻 3 分钟。

然后用力涡旋噬菌斑 30 秒，制成裂解物。将所有裂解物（包括细胞碎片）加入 CV-1 细胞孔中，并在板中孵育 3 天。不要使用其他五个孔。

每天在显微镜下检查细胞。当超过一半的细胞出现细胞病变时，收获受感染的细胞。理想情况下，所有细胞都应该是细胞病变的。

使用细胞刮刀将细胞收集在 15 毫升试管中，并加入培养基。然后以 300 g 的浓度沉淀细胞 3 分钟。弃去上清液并继续使用 PCR 验证突变体 VV 的修饰，或将细胞沉淀冷冻在负 80 摄氏度以备后用。

与传统方案相比，所述方法将重组效率提高了 100 倍以上。例如，VV N1LG 是改性的目标。如前所述，将表达 Cas9 的血浆和 N1L 特异性 gRNA 共转染到 CV-1 细胞中，以提高它们的同源重组效率。

转染后 1 天，RFP 在 CV-1 细胞中表达。接下来，用来自同源重组的全裂解物感染 CV-1 细胞。在 CV-1 细胞中观察到 RFP 阳性和阴性斑块。

按照纯化方案，获得纯重组体。来自突变牛痘病毒纯噬菌斑的细胞裂解物感染后的所有噬菌斑都呈现 RFP 信号。PCR 验证靶基因是否缺失。

与完整的 N1L 对照不同，修饰后的病毒显示 RFP 阳性信号，而 N1L 没有信号。所有病例均对非靶向基因 A52R 呈阳性。看完这个视频，你应该对如何快速制作新的痘苗病毒载体有了很好的了解。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 10 天内完成。开发后，这项技术为生物医学科学领域的研究人员铺平了道路，以探索新的病毒载体，以开发用于治疗和预防癌症和传染病的生物制剂。