Name: 一个有效的方法获取反分化脂肪细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 了解一种高效获取反分化脂肪细胞的新型细胞培养方法。该方法使用优化培养基处理皮下脂肪组织，可显著提升DFAT细胞质量与生成效率，为再生医学和组织工程研究提供可靠技术支持。

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本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）先进研究与技术创业促进计划（START计划，项目编号：ST261006IP，TM）以及文部科学省私立大学战略研究基础推进计划（2014–2019年，项目编号：S1411018，TM）的资助。

人皮下脂肪样本取自在日本东京日本大学板桥医院整形外科、泌尿科、小儿外科和骨科接受手术的患者。患者均签署书面知情同意书，研究方案经日本大学医学院伦理委员会批准。
1. 组织制备
<ol>
	<li>将手术室的组织样本运送至实验室。</li>
	<li>在50 ml离心管中，用5 ml不含磷酸盐的缓冲液（PBS(-)）于室温（RT）洗涤1-2 g脂肪组织一次，然后将样本置于10 cm塑料培养皿中。</li>
</ol>
2. 胶原酶消化
<ol>
	<li>从 PBS(-) 中取出样本，然后向含有组织样本的培养皿中加入 10 ml 无菌的 0.1% (w/v) 胶原酶溶液（胶原酶 II 型）。</li>
	<li>用手术剪将组织剪碎约 15 分钟，直至呈糊状。</li>
	<li>随后将剪碎的组织在 37 °C 条件下，于 50 ml 离心管中用 0.1% (w/v) 胶原酶溶液消化 30 分钟（60 rpm），并在摇床上轻轻振荡。</li>
	<li>将消化后的样本通过 100 µm 滤膜过滤至 50 ml 离心管中。接着，将 10 ml 添加了 2% FBS 的 DCM（见材料表）通过滤膜冲洗。</li>
</ol>
3. 细胞分离
<ol>
	<li>将过滤后的细胞在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>此时，在 50 ml 离心管中准备 5 ml 含 2% FBS 的 DCM。</li>
	<li>接着，使用 1,000 µl 移液器吸取漂浮的脂肪细胞，并将细胞加入含有培养基的 50 ml 离心管中。</li>
	<li>随后，轻轻振荡 50 ml 离心管，使 DCM 培养基与细胞充分混匀。</li>
	<li>然后，将离心管在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>使用 18 G 针头和 20 ml 注射器弃去管底的培养基。</li>
	<li>接着，向收集的细胞中加入 10 ml 含 2% FBS 的 DCM。</li>
	<li>通过轻轻振荡 50 ml 离心管，使 DCM 与细胞混匀。</li>
	<li>将离心管在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。</li>
</ol>
4. 细胞接种
<ol>
	<li>向一个12.5 cm的培养瓶中加入41 ml添加了20% FBS的DCM或DMEM。</li>
	<li>接着，使用200 µl移液器向培养瓶中加入40 µl脂肪细胞。</li>
	<li>然后，用添加了20% FBS的DCM或DMEM补足培养瓶。关键步骤：此时应确保细胞在培养基中均匀分散。肉眼检查已脱落的细胞，之后将培养瓶平放在圆形培养皿的盖子上以保持水平。</li>
	<li>最后，将培养瓶放入培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下静置培养7天。</li>
	<li>培养一周后，倒置培养瓶并观察去分化脂肪细胞（DFAT细胞）。随后按照文献10所述方法评估DFAT细胞的生成效率，因为此时成纤维样细胞（DFAT细胞）已位于与脂肪细胞不同的区域。</li>
	<li>更换培养基时，移除之前的细胞培养液后，向培养瓶中加入5 ml添加了20% FBS的DCM或DMEM。更换培养基后，让DFAT细胞继续生长一周。</li>
	<li>使用细胞计数器，统计在不同细胞培养条件（DCM vs. DMEM）下生成的DFAT细胞数量。</li>
</ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

经历成熟过程的脂肪细胞 体外 去分化，即所谓的顶壁培养法，可使细胞逆转为更原始的表型并获得增殖能力。这类细胞被称为去分化脂肪细胞（DFAT细胞）。研究评估了DFAT细胞的多向分化潜能。流式细胞术分析和基因表达分析显示，与脂肪源性基质细胞（ASCs）相比，DFAT细胞具有更高的同质性。6事实上，DFAT细胞的细胞表面抗原谱与ASCs中的非常相似。6因此，DFAT细胞的功能可能与MSCs相似。
另一组成功生成 DFAT 细胞的研究团队采用了添加 20% 小牛血清的 DMEM F12 培养基7-8。尽管我们尝试使用添加 10% FBS 的培养基来制备 DFAT 细胞，但该方案所产生的 DFAT 细胞数量显著低于添加 20% FBS 的条件（数据未显示）。因此，FBS 的浓度和/或其成分对于 DFAT 细胞的去分化和/或增殖均具有重要意义。作为未来研究的一部分，我们将进一步阐明血清成分调控 DFAT 细胞生成与增殖的机制。另一方面，DCM 中的葡萄糖、脂肪酸及其他化学成分含量低于本研究中使用的 DMEM。这...

细胞治疗与组织工程是再生医学领域的研究热点1-5。尽管这些治疗手段具有广阔的应用前景，但目前仍存在若干技术难题，限制了其临床应用。在这方面，与诱导多能干细胞（iPS细胞）的制备类似，所有组织工程技术都必须产生不含外源基因转导的细胞，以确保患者安全。因此，我们研究团队首次成功制备了人源DFAT细胞6。此后，多个研究小组已采用我们的方法生成了哺乳动物来源的DFAT细胞7-9，进一步凸显了该模型的实用价值。
在多项研究过程中，我们发现通过调整细胞培养基的成分，可以改变细胞培养环境的质量。这一发现提高了DFAT细胞制备的成功率，并改善了细胞质量；这两者都是高效生成用于未来临床试验细胞的关键因素。为此，我们开发了一种改良的DFAT细胞培养基（DCM，一种类似于间充质干细胞培养基的培养基，含有重组人胰岛素、血清白蛋白、L-谷氨酸以及多种脂肪酸和胆固醇）及一种DFAT细胞生成与扩增的方法（有关DCM成分的更多信息可应要求提供）。利用该方法，成功获得了高质量的DFAT细胞，这些细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞类型分化的能力。总体而言，该经过验证的细胞培养方案提升了DFAT细胞的质量，在细胞治疗和组织工程的临床应用中具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC 培养基&amp;nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>该培养基在文中定义为 DCM</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>高砂医用工业株式会社</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，100 &amp;mu;m，黄色</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&amp;nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12.5 cm&amp;sup2; 倾斜颈矩形细胞培养瓶，带蓝色透气螺旋盖</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&amp;nbsp;</td><td>353107</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Z 系列库尔特计数仪</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

一种获取去分化脂肪细胞的高效方法

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

组织工程与细胞治疗在临床上具有广阔的应用前景。在这方面，多能细胞（如间充质干细胞，MSCs）有望在不久的将来被用于恢复受损器官的功能。然而，目前这些治疗方法的临床应用仍受到若干技术问题的限制，包括分离MSCs过程的高度侵入性以及其扩增效率低下等。本文介绍了一种高效生成去分化脂肪细胞（DFAT细胞，即类似MSC的细胞）的方法。有趣的是，DFAT细胞可被诱导分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。尽管此前已有其他研究团队提出了多种从成熟脂肪组织中生成DFAT细胞的方法，但我们的方法在效率上更具优势。在此，我们证明，添加20%胎牛血清（FBS）的DFAT细胞培养基（DCM）在生成DFAT细胞方面优于添加20% FBS的DMEM培养基。此外，采用本细胞培养方法获得的DFAT细胞还可被再分化为多种组织类型。因此，本研究提供了一个非常有趣且实用的组织去分化研究模型。

本研究改进了DFAT细胞生成的方法和工具包（图1）。我们的方法可使用含20%胎牛血清（FBS）的DCM和DMEM两种培养基生成DFAT细胞（图2A）。因此，我们比较了DCM与DMEM在DFAT细胞生成中的效率。结果显示，无论脂肪细胞数量如何，DCM在促进DFAT细胞增殖方面均比DMEM高出三倍（图2A和图2B）。与使用10% FBS的方案相比，使用20% FBS也有助于增强细胞生长（数据未显示）。我们进一步证实，利用DCM生成的DFAT细胞具有再分化为脂肪细胞以及分化为成骨细胞的能力（图3）。相关检测方法详见我们之前的研究6。
<img alt="脂肪细胞转化为DFAT细胞的过程示意图，显示离心、去分化和细胞生长。" src="/files/ftp_upload/...

我们已改进了DFAT细胞的生成条件，并在此提供有关使用优化培养基生产这些细胞的信息。

组织工程与细胞治疗在临床上具有广阔的应用前景。在这方面，多能细胞（如间充质干细胞，MSCs）可被用于……

本新型细胞培养方法的总体目标是更高效地生成去分化脂肪细胞。该方法可能有助于再生医学领域的研究人员解答有关生成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞过程中多个关键问题。由于本细胞培养方案的主要优势在于能够提高去分化脂肪细胞（DEFAT细胞）的质量，因此有望在不久的将来应用于改进现有的细胞治疗和组织工程应用。从手术室将患者的皮下脂肪样本送至实验室后，称取组织重量，并取1至2克脂肪组织样本放入15毫升离心管中。随后用5毫升PBS洗涤样本，然后将样本转移至10厘米塑料培养皿中。吸除PBS。然后向含有样本的培养皿中加入10毫升无菌的0.1%（重量/体积）胶原酶溶液。接着使用手术剪将组织剪碎，直至其达到匀浆状的一致性。将剪碎的组织和胶原酶溶液转移至15毫升离心管中，在37°C下以60 RPM振荡消化30分钟。消化完成后，将消化后的样品通过100微米滤网过滤至一个新的15毫升离心管中。随后，将10毫升添加了2% FBS的DEFAT培养基通过滤网。为从细胞悬液中分离脂肪细胞，首先在室温下以100 × g离心过滤后的细胞1分钟。离心期间，在一个15毫升离心管中准备5毫升含2% FBS的DCM。接着，使用1000微升移液器吸取离心后管中的漂浮脂肪细胞，并将细胞加入含有培养基的15毫升离心管中。轻轻振荡离心管，使DCM培养基与细胞充分混匀。然后，在室温下以100 × g离心试管1分钟。离心后，使用18号针头和20毫升注射器吸出试管底部的培养基。然后向细胞中加入10毫升含2% FBS的二氯甲烷（DCM），并通过轻轻摇动试管混匀。将细胞再次在室温下以100 × g离心一分钟。开始接种时，向一个12.5厘米的培养瓶中加入41毫升添加了20% FBS的DCM或DMEM。然后使用200微升移液器吸取40微升脂肪细胞，并将其加入培养瓶中。然后用 DCM 或添加 20% FBS 的 DMEM 培养基填充锥形瓶。关键是要将细胞均匀分散在培养基中。将锥形瓶放置在圆形培养皿的盖子上，以保持其水平。最后，将锥形瓶放入设定为5%二氧化碳和37°C的培养箱中，静置七天。培养一周后，倒置锥形瓶并检查去分化的脂肪细胞。接着，吸除培养基，然后向锥形瓶中加入5毫升DCM或DMEM，培养基中需添加20%FBS。更换培养基后，让DEFAT细胞继续生长一周。一周后，使用细胞计数器计数在不同细胞培养条件下生成的DEFAT细胞数量。此图像显示了在DMEM中培养14天后的DEFAT细胞克隆。图中显示的是 DEFAT 细胞在 DCM 中培养 14 天后的形态。每张图中的比例尺代表 200 微米。通过细胞计数仪对 DEFAT 细胞的增殖进行定量，并比较了 DCM 与 DMEM 在生成 DEFAT 细胞方面的效率。如图所示，使用 DCM 后可观察到细胞增殖能力增强。在此实验中，采用 DCM 生成的人源 DEFAT 细胞在相应的诱导培养基中培养三周，以评估 DEFAT 细胞的再分化与分化能力。通过碱性磷酸酶染色及茜素红 S 染色，检测到细胞具有成骨潜能；最终通过油红 O 染色证实其成脂潜能。为了成功制备高质量的DEFAT细胞，必须极为谨慎地进行含有基质的胶原酶消化及脂肪细胞分离操作。通过这些努力，我们经过验证的细胞培养方法旨在推动发育生物学和再生医学领域当前及未来的科研工作。

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发育生物学

一个有效的方法获取反分化脂肪细胞

成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。...

通过成熟脂肪细胞在顶壁培养中的去分化生成人类脂肪源性干细胞

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。...

稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本方案概述了从刺鼠（Acomys）中分离骨骼肌和心肌纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）的方法Acomys) 通过 酶解离与荧光激活细胞分选。通过本方案获得的FAPs可有效扩增，并分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。...

棘鼠模型中纤维脂肪生成祖细胞的分离、扩增与分化

本文介绍了一种可将自体脂肪组织转化为多种具有不同理化特性和功能的脂肪组分物质的实验方案。...

创新的脂肪组织分选技术：将脂肪转化为特化组分

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

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