一种获取去分化脂肪细胞的高效方法

本新型细胞培养方法的总体目标是更高效地生成去分化脂肪细胞。该方法可能有助于从事再生医学领域研究的科研人员解答有关成脂细胞、成骨细胞和软骨细胞生成过程中多个关键问题。由于本细胞培养方案的主要优势在于能够提升去分化脂肪（DEFAT）细胞的质量，因此有望在不久的将来应用于改进现有的细胞治疗和组织工程应用。

从手术室将患者的皮下脂肪样本送至实验室后，称量组织，并取1至2克脂肪组织样本放入15毫升离心管中。随后用5毫升PBS洗涤样本，然后将样本转移至10厘米塑料培养皿中。吸除PBS。

然后向含有样本的培养皿中加入10毫升无菌的0.1%（重量/体积）胶原酶溶液。接着使用手术剪将组织剪碎，直至形成匀浆状。将剪碎的组织和胶原酶溶液转移至15毫升离心管中，在37°C下消化30分钟，同时以60 RPM的速度震荡。

消化完成后，将消化后的样品通过100微米滤网过滤至新的15毫升离心管中。然后，将10毫升添加了2% FBS的DEFAT培养基通过滤网。为了从细胞悬液中分离脂肪细胞，首先在室温下以100 × g离心过滤后的细胞1分钟。

离心期间，在一个15毫升离心管中准备5毫升含2% FBS的DCM。接着，使用1000微升移液器吸取离心管中上层漂浮的脂肪细胞，并将细胞加入含有培养基的15毫升离心管中。轻轻振荡离心管，使DCM培养基与细胞充分混匀。

然后，在室温下以100 × g离心1分钟。离心后，使用18号针头和20毫升注射器吸出管底的培养基。随后向细胞中加入10毫升含2% FBS的二氯甲烷（DCM），并通过轻轻振荡试管混匀。

将细胞再次在室温下以100 × g离心1分钟。开始接种时，向一个12.5厘米的培养瓶中加入41毫升添加了20%胎牛血清（FBS）的DCM或DMEM培养基。然后使用200微升移液器吸取40微升脂肪细胞，并将其加入培养瓶中。

然后用添加了20% FBS的DCM或DMEM培养基填充锥形瓶。关键是要使细胞在培养基中充分分散。将锥形瓶放置在圆形培养皿的盖子上，以保持其水平。

最后，将锥形瓶放入设定为5%二氧化碳和37°C的培养箱中，静置七天。培养一周后，倒置锥形瓶并检查去分化的脂肪细胞。接着，吸除培养基，然后向锥形瓶中加入5 mL DCM或添加了20%FBS的DMEM。

更换培养基后，让DEFAT细胞继续生长一周。一周后，使用细胞计数器计数在不同细胞培养条件下生成的DEFAT细胞数量。此图像显示了在DMEM中培养14天后的DEFAT细胞克隆。

此处显示的是DEFAT细胞在DCM培养基中培养14天后的形态。每张图像中的比例尺均为200微米。通过细胞计数仪对DEFAT细胞的增殖情况进行定量，并比较了DCM与DMEM在生成DEFAT细胞方面的效率。

如图所示，使用 DCM 可观察到细胞增殖能力增强。在此实验中，利用 DCM 生成的人源 DEFAT 细胞在相应的诱导培养基中培养三周，以评估其重新分化和分化能力。通过碱性磷酸酶染色和茜素红 S 染色，检测到细胞具有成骨潜能；最后，通过油红 O 染色证实了其成脂潜能。

为了成功制备高质量的DEFAT细胞，必须极为谨慎地进行含有基质的胶原酶消化以及脂肪细胞分离操作。通过上述努力，我们经过验证的细胞培养方法旨在推动发育生物学和再生医学领域当前及未来的各项研究工作。