模拟信号蛋白的功能：迈向人工信号转导治疗

本实验的总体目标是通过光谱学方法追踪由合成化学换能器诱导的两种蛋白质之间的非天然通信。该研究将证明开发信号蛋白的合成类似物的可能性，这类类似物能够执行自然界中不存在的信号转导通路。利用常见的分光光度计追踪非天然的蛋白质间通信，有助于开发和优化人工化学换能器的功能，并推动实现人工信号转导治疗的目标。

化学换能器由血小板源性生长因子（PDGF）适配体、二价乙酰唑胺GST抑制剂、荧光团和淬灭剂组成。本视频中不会演示化学换能器的合成过程。

但在文本方案中有描述。此处展示了化学换能器的工作原理。当两个EA基团结合到GST酶的活性位点时，化学换能器会抑制GST的酶活性。

加入PDGF会导致PDGF化学换能复合物的形成，该复合物会破坏换能器与GST之间的相互作用，从而恢复GST的酶活性。随后加入未修饰的PDGF适体可释放化学换能器，使其重新抑制酶的活性。

在开始研究血小板源性生长因子（PDGF）对谷胱甘肽 S-转移酶（GST）活性调控的实验之前，需在酶标仪中建立用于动力学测定的实验程序。将新实验创建为标准方案，并选择“程序”以打开“程序设置”窗口。

在窗口上方的弹出列表中，根据耗材制造商选择 384 孔板类型。在左侧菜单中选择“读取”。检测方法选择“吸光度”。

以及读数类型的终点。在波长窗口中输入 340 纳米。选择全板，并选择要测量的孔。

然后单击“确定”关闭读取窗口。在左侧菜单中，选择“开始动力学”。将运行时间设置为10分钟。

选择“最小间隔”选项，然后单击“确定”关闭动力学窗口。将读取线拖入动力学测量中。

选择“验证”按钮，然后选择“确定”按钮。保存实验。选择“播放”按钮。

将出现一个对话框，但在准备开始动力学测量之前，请勿点击“确定”按钮。在酶标仪设置完成后，下一步是准备样品，用于检测在化学换能剂和血小板源性生长因子（PDGF）存在条件下的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性。为了以三复孔形式测试四种不同浓度的PDGF，需准备四个样品，每个样品包含3.25 µL化学换能剂和3.25 µL GST M-1。

向每个样品中分别加入 0、1.2、2.4 或 4.9 µL 的 PDGF。然后向每个样品中加入适量的检测缓冲液，使总体积达到 130 µL。将样品在室温下孵育 10 分钟。

10 分钟后，将每种样品各 40 微升转移至 384 孔透明板的孔中。将四种样品中的每一种仅转移至同一行中的奇数孔或偶数孔，以便使用多通道移液器添加底物。

接下来，使用12通道多道移液器，迅速向每个样品中加入10 µL已预先在96孔板中配制好的每种底物。轻轻快速混匀，避免产生气泡。立即将酶标板插入酶标仪，并在对话框中点击“确定”按钮，开始动力学检测。

为了研究化学转导剂介导的GST激活抑制循环，准备五个样品，每个样品包含84.5 µL测定缓冲液、3.25 µL化学转导剂和3.25 µL GST M1-1。在室温下孵育三分钟。

向样本一中加入 3.65 µL 检测缓冲液，向样本二、三、四和五中各加入 3.65 µL PDGF。室温孵育 3 分钟。向样本一和样本二中各加入 3.12 µL 检测缓冲液，向样本三、四和五中各加入 3.12 µL PDGF 适配体。

室温孵育三分钟。向样品一、二和三中各加入24.4 µL检测缓冲液，向样品四和五中各加入24.4 µL PDGF。

室温孵育三分钟。向样品1至样品4中各加入7.8 µL检测缓冲液，向样品5中加入7.8 µL PDGF适配体。室温孵育五分钟。

将样品转移至384孔透明板中。为进行三复孔实验，请迅速向样品中加入底物。将板插入读板仪，并开始动力学测定。

开始本实验时，按照方案文本所述，在酶标仪中设置用于动力学测量的实验程序。在384孔透明板的两个孔中分别制备两个样品。对于每个孔，将1微升GST M1-1与1微升化学换能剂加入38微升的检测缓冲液中混合。

在两个孔之间留出一个空孔。使用12通道多通道移液器，迅速向每个孔中加入10 µL底物，并轻轻快速混匀，避免产生气泡。

立即将酶标板插入读板仪并开始动力学检测。当酶标仪在3.5分钟后打开时，迅速向其中一个孔中加入1.125 µL的PDGF，轻轻混匀，并让酶标板重新进入读板仪以完成后续的动力学检测。在准备本实验样品之前，应按照方案文本中的描述，在酶标仪中预先设置好用于动力学检测的实验程序。

将使用亚硝酸盐/硝酸盐比色试剂盒来测定一氧化氮的生成。在96孔板中，向第一排每孔加入50微升检测缓冲液，向第二排每孔加入70微升Griess试剂一。

在第三行的每个孔中加入70微升Griess二号试剂。准备四个样品，每个样品含有4.8微升化学转导剂。向样品一中加入155.2微升检测缓冲液。

对于样品二，加入 3.2 µL GST M1-1 和 152 µL 检测缓冲液。对于样品三，加入 9.6 µL PDGF 和 145.6 µL 检测缓冲液。对于样品四，加入 3.2 µL GST M1-1、9.6 µL PDGF 和 142.4 µL 检测缓冲液。

将样品在室温下孵育10分钟。在384孔透明板中，每孔加入50 µL样品，每个样本设三个复孔以进行实验。在同一行中仅向奇数孔或偶数孔加样，以便使用多通道移液器添加底物。

向每个样品中加入 0.54 µL 的 JS-K 前药。迅速向每个样品中加入 10 µL 谷胱甘肽溶液，并轻轻快速混匀，避免产生气泡。将酶标板插入读板仪，开始动力学测定。

动力学测定结束后，立即将每个样品的50微升用测定缓冲液转移至96孔板第一行的各个孔中。然后，将板中第二行每个孔中的50微升转移至第一行对应的孔中。再将板中第三行每个孔中的50微升转移至第一行对应的孔中。

室温下避光孵育10分钟。在测定550纳米处吸光度之前。不加化学换能剂与加入化学换能剂测定GST活性的结果表明，该化学换能剂可抑制GST活性。

通过向GST-化学换能器复合物中添加浓度递增的PDGF，GST得以重新激活。连续向GST-化学换能器复合物中加入PDGF以及未经修饰的PDGF适配体表明，PDGF与GST之间的信号传递是可逆的。在向GST-换能器复合物中加入PDGF后，3.5分钟内加入底物，GST活性迅速升高。

尽管在 GST、PDGF 和化学转导剂的混合物中加入 PDGF 适体后，GST 活性降低。这些结果表明，该系统能够实时响应其环境的变化。随后，利用 JS-K 研究了该系统控制前药活化的能力；JS-K 是一种抗癌前药，可通过 GST 活化释放有毒的一氧化氮。

通过向化学换能器中加入 JS-K 以及不同组合的 GST 和 PDGF 后对释放的一氧化氮量进行测定，结果证实只有当 GST 和 PDGF 同时存在时才能激活 JS-K。这些结果表明，一种合成试剂能够使生长因子触发谷胱甘肽 S-转移酶的催化活性，而该酶并非其天然的酶伴侣。因此，未来此类仿生分子可能被用于改变细胞对环境信号的响应，或赋予细胞新的特性。