Name: 模拟信号蛋白的功能:走向人工信号转导疗法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 了解如何利用合成化学转导器实现蛋白质之间的非自然通讯，通过PDGF适配体与GST抑制剂的组合调控酶活性。该方法为人工信号转导疗法的开发提供了新思路。

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本研究由明娜瓦基金会、人类前沿科学计划组织以及欧洲研究理事会资助（启动资助 338265）。

1. “化学换能器”的合成
<ol>
	<li>初步准备
	<ol>
		<li>通过将278 ml三乙胺与114 ml乙酸及400 ml超纯水混合，配制2 M三乙基乙酸铵（TEAA）缓冲液。调节pH至7，并加水定容至1 L。储存于避光瓶中。 
		注意：该溶液可稳定保存数年。</li>
		<li>将18 mg抗坏血酸溶于20 ml超纯水中，配制5 mM抗坏血酸溶液。使用新鲜配制的溶液；该溶液在一天内稳定。</li>
		<li>将25 mg五水合硫酸铜溶于10 ml超纯水中，另将58 mg三(苄基三唑基甲基)胺（TBTA）溶于11 ml二甲基亚砜（DMSO）中，分别配制溶液后混合，得到10 mM Cu(II)/Tris(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) 溶液。室温保存并避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>偶联步骤
	<ol>
		<li>将100 nmol修饰寡核苷酸（ODN-1）溶于80 µl新鲜超纯水中。加入20 µl 2 M TEAA（pH = 7），再加入80 µl新配制的抗坏血酸溶液（5 mM水溶液）。</li>
		<li>将1.5 µmol（574.5 µg）叠氮修饰的依他尼酸溶于180 µl DMSO中，加入上述溶液。用氩气脱气60秒，迅速加入40 µl Cu(II)/TBTA溶液（10 mM，溶于55% (v/v) DMSO/水）。</li>
		<li>再次通入氩气，密封后室温下搅拌过夜。</li>
		<li>通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）监测反应进程并纯化偶联产物（流动相：A) 5%乙腈、5% TEAA、90%超纯水；B) 65%乙腈、5% TEAA、30%超纯水）。24</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过血小板源性生长因子调控 GST 活性
<ol>
	<li>初步准备
	<ol>
		<li>通过将33.9 ml磷酸盐缓冲液（PBS×1）与16.1 ml超纯水混合，配制50 ml检测缓冲液，使终浓度为8 mM磷酸盐，并加入23.8 mg MgCl₂2 以达到 5 mM 的终浓度。</li>
		<li>将GST M1-1蛋白溶于含有50 mM Tris（pH 7.5）、50 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的缓冲液中，配制成终浓度为30 µM的储备液。将该溶液分装成小份，于-80 ˚C保存。根据2.1.5.1节所述方法新鲜稀释，用测定缓冲液稀释后置于冰上保存。 
		注意：该溶液在约5小时内保持稳定，或直至酶活性出现下降。</li>
		<li>根据以下说明准备底物：
		<ol>
			<li>将10 mg还原型谷胱甘肽（GSH）溶于325 µl超纯水中，配制成终浓度为100 mM的储存液。取21 µl该储存液加入979 µl检测缓冲液中，配制成终浓度为2.1 mM的工作液。</li>
			<li>将10 mg 2,4-二硝基氯苯（CDNB）溶于492 µl乙醇中，配制成终浓度为100 mM的储备液。取43.2 µl储备液，加入956.8 µl测定缓冲液中，稀释成终浓度为4.32 mM的工作液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在96孔板中，将每种底物分别加入单独的一行（12个孔）。每个孔中至少加入60 µl，以确保溶液能够快速且方便地吸取。用铝箔覆盖板子以避光。</li>
		<li>在测定缓冲液中配制以下贮存液：
		<ol>
			<li>将GST M1-1稀释50倍，使二聚体的终浓度为0.6 µM。</li>
			<li>将“化学换能器”稀释至30 µM的储备溶液。</li>
			<li>将PDGF稀释至终浓度为40 µM。</li>
			<li>将PDGF适配体稀释至终浓度为250 µM。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在存在“化学换能器”和血小板源性生长因子（PDGF）的情况下测定谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性。
	<ol>
		<li>在酶标仪中设置用于动力学测量的实验程序。
		<ol>
			<li>创建一个新实验作为“标准方案”。</li>
			<li>点击“步骤”以打开步骤设置窗口。</li>
			<li>在窗口上方的弹出列表中，根据培养板制造商选择“384孔板”类型。</li>
			<li>在左侧菜单中点击“Read”。</li>
			<li>选择检测方法为“吸光度”。</li>
			<li>关于读数类型，选择“终点法”。</li>
			<li>在波长窗口处写上 340 nm。</li>
			<li>点击右上角的“全板”按钮，并选择要测量的孔。</li>
			<li>单击“ok”以关闭“Read”窗口。</li>
			<li>在左侧菜单中选择“start kinetic”。</li>
			<li>将运行时间设为10分钟。</li>
			<li>选择最小间隔选项。</li>
			<li>单击“ok”关闭动力学窗口。</li>
			<li>将“读取”线拖动到动力学测量中。</li>
			<li>按下“validate”按钮，然后按下“ok”按钮。</li>
			<li>保存实验。</li>
			<li>按下“play”按钮。此时将出现一个对话框——仅当需要开始测量时，再按下“ok”按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为了进行三组重复实验，准备四个样品，每个样品包含 3.25 µl 的“化学换能器”和 3.25 µl 的 GST M1-1。分别向每个样品中加入 0、1.2、2.4 或 4.9 µl 的 PDGF，以及 123.5、122.3、121.1 或 118.6 µl 的检测缓冲液。</li>
		<li>室温下孵育溶液10分钟。</li>
		<li>在384孔透明板中，向每个孔加入40 µl样品。在同一行中，仅将样品加入奇数孔或仅加入偶数孔，以便使用多通道移液器添加底物。</li>
		<li>使用12通道多通道移液器，迅速从96孔板（第2.1.4节中预先配制）的各底物中加入10 µl。轻轻快速混匀，避免产生气泡。将酶标板插入读板仪，立即开始动力学测定。由于GST反应动力学较快，应尽量缩短底物添加与动力学测定开始之间的时间间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>“化学换能器”介导的谷胱甘肽S-转移酶激活/抑制循环
	<ol>
		<li>为了进行三组重复实验，准备5个样品，每个样品包含84.5 µl检测缓冲液、3.25 µl“化学换能器”和3.25 µl GST M1-1。室温孵育3分钟。</li>
		<li>向样品1中加入3.65 µl检测缓冲液，向样品2-5中加入3.65 µl PDGF。室温孵育3分钟。</li>
		<li>向样品1-2中加入3.12 µl检测缓冲液，向样品3-5中加入3.12 µl PDGF适配体。室温孵育3分钟。</li>
		<li>向样品1-3中加入24.4 µl测定缓冲液，向样品4-5中加入24.4 µl PDGF。室温孵育3分钟。</li>
		<li>向样品1-4中加入7.8 µl检测缓冲液，向样品5中加入7.8 µl PDGF适配体。室温孵育5分钟。</li>
		<li>在384孔透明板中，向每孔加入40 µl样品。在同一行中，仅将样品加入奇数孔或仅加入偶数孔。</li>
		<li>使用12通道多通道移液器，从每个底物（预先在96孔板中配制）快速加入10 µl。轻轻且迅速混匀，避免产生气泡。将板插入读板仪，开始动力学测定。</li>
		<li>计算 V0 [mOD/min] 通过从 t = 1.5 min 时测得的 340 nm 处吸光度减去 t = 0.5 min 时测得的 340 nm 处吸光度，计算每种条件下的数值，以评估激活/抑制的可循环性。25</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估“化学换能器”对环境变化的实时响应。
	<ol>
		<li>PDGF添加的实时效应
		<ol>
			<li>在酶标仪中设置用于动力学测量的实验程序。</li>
			<li>重复步骤 2.2.1.1–2.2.1.10。</li>
			<li>将运行时间设为3.5分钟。</li>
			<li>选择最小间隔选项。</li>
			<li>单击“ok”以关闭动力学窗口。</li>
			<li>将“读取”线拖动到动力学测量中。</li>
			<li>在左侧菜单中选择“选择平板进出”。</li>
			<li>选择“铺板（无对话框）”选项。</li>
			<li>在左侧菜单中选择“延迟”选项，并输入 30 秒。</li>
			<li>在左侧菜单中选择“选择平板输出/输入”。</li>
			<li>选择“直接进板（无对话框）”选项。</li>
			<li>通过重复步骤 2.2.1.4 至 2.2.1.14 创建第二次动力学测量，但在步骤 2.2.1.11 中将动力学时间设置为 25 分钟而非 10 分钟。</li>
			<li>按下“validate”按钮，然后按下“ok”按钮。</li>
			<li>保存实验。</li>
			<li>按下“播放”按钮。此时将出现一个对话框——仅当需要开始测量时，再按下“确定”按钮。</li>
			<li>将1 µl GST M1-1与1 µl“化学换能器”在38 µl分析缓冲液中混合，制备两个样品。将样品加入384孔透明板中的两个孔内，两孔之间留出一个空孔。</li>
			<li>使用12通道多通道移液器，迅速从每种底物中加入10 µl，轻轻快速混匀以避免产生气泡，将酶标板插入读板仪并开始动力学测定。</li>
			<li>当培养板开启（3.5 分钟后），迅速加入 1.125 µl PDGF 一 轻轻混匀各孔，然后将酶标板继续孵育，以完成后续的动力学检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>添加PDGF适配体的实时效应
		<ol>
			<li>重复步骤 2.4.1.1–2..4.1.15。</li>
			<li>通过将1 µl GST M1-1、1 µl“化学换能器”和1.125 µl PDGF加入36.9 µl检测缓冲液中，配制两个样品。将样品加入384孔透明板的两个孔中，两孔之间留出一个空孔。</li>
			<li>使用12通道多通道移液器，迅速从每种底物中加入10 µl，轻轻快速混匀以避免产生气泡，将酶标板插入读板仪并开始动力学测定。</li>
			<li>当培养板打开后（1.5 分钟后），迅速加入 1.2 µl PDGF 适配体 一 轻轻混匀各孔，然后将酶标板继续封闭，以进行后续的动力学检测。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在“化学转导剂”和血小板源性生长因子（PDGF）存在下检测GST对JS-K前药的激活作用。
	<ol>
		<li>在酶标仪中设置用于动力学测量的实验程序。
		<ol>
			<li>创建一个新实验作为“标准方案”。</li>
			<li>点击“procedure”以打开程序设置窗口。</li>
			<li>在窗口上方的弹出列表中，根据培养板制造商选择“384孔板”类型。</li>
			<li>在左侧菜单中点击“Read”。</li>
			<li>关于检测方法，选择“吸光度”。</li>
			<li>关于读数类型，选择“终点法”。</li>
			<li>在波长窗口处写上 305 nm。</li>
			<li>点击右上角的“全板”按钮，并选择要测量的孔。</li>
			<li>单击“确定”以关闭“读取”窗口。</li>
			<li>在左侧菜单中选择“start kinetic”。</li>
			<li>将运行时间设置为10 min。</li>
			<li>选择最小间隔选项。</li>
			<li>点击“确定”以关闭动力学窗口。</li>
			<li>将“读取”线拖动到动力学测量中。</li>
			<li>按下“validate”按钮，然后按下“ok”按钮。</li>
			<li>保存实验。</li>
			<li>按下“播放”按钮。此时将出现一个对话框——仅当需要开始测量时，再按下“确定”按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用亚硝酸盐/硝酸盐比色法检测试剂盒检测一氧化氮（NO）的生成。在96孔板中，向第一排各孔加入50 µl检测缓冲液，向第二排各孔加入70 µl格里斯试剂I，向第三排各孔加入70 µl格里斯试剂II。</li>
		<li>为了进行三组重复实验，准备四个样品，每个样品含有 4.8 µl 的“化学换能剂”。向样品 1 中加入 155.2 µl 检测缓冲液；向样品 2 中加入 3.2 µl GST-M1-1 和 152 µl 检测缓冲液；向样品 3 中加入 9.6 µl PDGF 和 145.6 µl 检测缓冲液；向样品 4 中加入 3.2 µl GST-M1-1、9.6 µl PDGF 和 142.4 µl 检测缓冲液。</li>
		<li>室温下孵育溶液10分钟。</li>
		<li>在384孔透明板中，向每个孔加入50 µl样品。在同一行中仅使用奇数孔或仅使用偶数孔，以便使用多通道移液器添加底物。</li>
		<li>向每个孔中加入 0.54 µl JS-K（DMSO 中 5 mM）。</li>
		<li>使用12通道多道移液器，迅速从96孔板中的GSH溶液加入10 µl，轻轻快速混匀以避免产生气泡。将酶标板插入读板仪，开始动力学检测。</li>
		<li>动力学测量结束后，立即使用12通道多通道移液器从每个样品中吸取50 µl加入预先准备好的96孔板的检测缓冲液行中，并迅速加入50 µl Griess I试剂和50 µl Griess II试剂。室温避光孵育10分钟，于550 nm处测定吸光度。 
		注意：测定缓冲液和试剂的体积取决于试剂盒的说明书。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出了一种设计和测试“化学转导器”的方法，该转导器可在不修饰天然蛋白质的情况下，诱导两种天然不相关的蛋白质（GST 和 PDGF）之间的人工通信。通过使用酶学检测方法，可实时检测这种非天然的 GST-PDGF 通信；该方法通过监测在“化学转导器”存在下，随着 PDGF 浓度增加时 GST 活性的变化来实现检测。除了检测 PDGF 对 GST 的激活作用外，这些检测方法还可用于追踪竞争性适配体对 GST 的去活化作用，以及 PDGF 介导的抗癌前药的裂解过程。已有文献报道过其他可开关的蛋白质结合剂，它们能够响应寡核苷酸输入来调控蛋白质活性26。然而，本文所述的实验方案展示了一种用于追踪新型蛋白质结合剂功能的方法，这类结合剂可响应天然蛋白质的存在而发挥作用。通过这种方式，可实时检测蛋白生物标志物对酶的调控作用，从而为利用此类系统选择性激活前药及其他 GST 底物开辟了新途径。
需要注意的是，谷胱甘肽S-转移酶（GST）的反应动力学非常迅速，因此，为了从该酶学检测中获得可靠的结果，必须尽量缩短底物添加与开始测量之间的时间。此外，由于酶或底物浓度的微小变化都可能对...

信号转导通路在几乎所有细胞过程中都发挥着重要作用，使细胞能够快速响应外界环境信号。1 这些通路通常由信号分子与细胞外受体结合而启动，进而激活细胞内酶类。细胞内信号的放大与传递依赖于信号蛋白的功能，这些蛋白通过形成蛋白质-蛋白质相互作用网络，以高度特异性可逆地激活酶类。由于这些网络的失调常常导致癌症的发生，因此人们高度关注建立“癌症信号转导治疗”策略2，即设计药物以破坏异常的信号转导通路。我们最近提出了一种替代性的信号转导治疗策略，该策略依赖于药物诱导产生非天然信号转导通路的能力。3 具体而言，我们认为通过设计模拟信号蛋白功能的合成分子，有可能间接调控细胞功能。例如，这些人工构建的网络可使蛋白质生物标志物激活能够切割前药的酶类。此外，这些信号蛋白模拟物还可能激活非天然的细胞信号通路，从而产生治疗效果。
为了验证该方法的可行性，我们近期设计了一种合成的“化学转导器”4，该转导器可使血小板源性生长因子（PDGF）通过激活谷胱甘肽-S-转移酶（GST）来触发抗癌前药的裂解，而GST并非其天然结合靶标。该“转导器”的结构包含一个抗PDGF的DNA适配体，并通过修饰连接了一个二价的GST抑制剂。因此，这种合成分子属于一类具有不同蛋白质结合位点的分子家族5-7，例如化学诱导二聚剂（CIDs）8-10，同时也归属于基于寡核苷酸-合成分子偶联物的蛋白质结合剂类别11-21。
本文描述了此类系统设计所依据的一般原理，并提供了利用常规酶学检测方法合成和测试这种“转导器”功能的详细实验方案。本研究旨在促进开发更多此类“转导器”，可用于介导细胞内蛋白质-蛋白质通讯，从而诱导人工细胞信号通路的建立。
图1 示意性地描述了合成“化学转导器”的工作原理，这类转导器能够介导非天然的蛋白质-蛋白质通讯。在此图示中，一种“化学转导器”整合了针对蛋白质I和II的合成结合剂（结合剂I和II），使得蛋白质II能够触发蛋白质I的催化活性，而蛋白质II并非蛋白质I的天然结合伙伴。在缺乏蛋白质II的情况下，该转导器会结合到酶（蛋白质I）的催化位点并抑制其活性（图1，状态ii）。然而，当“转导器”与蛋白质II结合时，会促进结合剂I与蛋白质II表面之间的相互作用（图1，状态iii），从而降低其对蛋白质I的亲和力。结果，溶液中“游离”转导器的有效浓度降低，导致转导器-蛋白质I复合物解离，进而重新激活蛋白质I（图1，状态iv）。综上所述，这些步骤突出了高效“转导器”设计所依赖的三个基本原理：（1）“转导器”应对每种目标蛋白质具有特异性的结合剂；（2）结合剂II与蛋白质II之间的相互作用应强于结合剂I与蛋白质I之间的相互作用；（3）结合剂I必须能够与蛋白质II的表面发生相互作用。最后这一原则并不要求结合剂I单独对蛋白质II具有高亲和力和选择性。相反，该原理基于我们近期的研究结果，表明将一个合成分子带至蛋白质附近时，很可能促进该分子与蛋白质表面之间的相互作用。19,22,23
<img alt="结合物、底物和产物的蛋白质相互作用机制示意图。" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1">
图1：“化学转导剂”的工作原理。当“化学转导剂”被加入到活性蛋白I中（状态i）时，它通过结合剂I与蛋白I的活性位点结合，从而抑制其活性（状态ii）。然而，在蛋白II存在的情况下，未结合的“化学转导剂”通过结合剂II与蛋白II相互作用，促使结合剂I与蛋白II表面发生相互作用。这种由诱导产生的结合剂I与蛋白II之间的相互作用降低了结合剂I的有效浓度，导致“转导剂”-蛋白I复合物解离，从而使蛋白I重新激活（状态iv）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1-氯-2,4-二硝基苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>生物实验室</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)</td><td>默克-密理博</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>默克-密理博</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>生物工业公司</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>依他尼酸</td><td>东京化成工业株式会社</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽-S-转移酶 M1-1</td><td>以色列结构蛋白质组学中心（以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>还原型L-谷胱甘肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>耶鲁大学W. M. 凯克基金会生物技术中心</td><td></td><td>定制订单</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>以色列结构蛋白质组学中心（以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 柱</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>2695 分离模块</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱柱</td><td>沃特斯</td><td>XBridgeTM OST C18 色谱柱（2.5 &amp;mu;M, 4.6 mm &amp;times; 50 mm</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱柱</td><td>沃特斯</td><td>XBridgeTM OST C18 色谱柱（2.5&amp;nbsp;&amp;mu;M，10 mm &amp;times; 50 mm</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 混合型</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟信号蛋白的功能：迈向人工信号转导治疗

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

信号转导通路通过信号蛋白的功能介导，调控细胞对各种环境信号的响应，这些信号蛋白相互作用并以高度特异性激活彼此。因此，模拟这些蛋白功能的合成试剂可能被用于产生非天然的信号转导步骤，从而改变细胞功能。本文提供了设计“化学转导剂”的指导原则，这类转导剂可诱导天然蛋白之间的非天然通讯。此外，还提供了合成和测试一种特定“转导剂”的详细实验方案，该转导剂能够诱导两种无关联的蛋白——血小板源性生长因子（PDGF）与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）——之间的通讯。本文也阐述了如何利用这种非天然的PDGF-GST通讯来控制抗癌前药的裂解，表明此类系统在“人工信号转导治疗”中的应用潜力。本研究旨在促进开发更多此类“转导剂”，用于介导细胞内蛋白质-蛋白质通讯，进而诱导人工细胞信号通路的形成。

一种“化学换能器”的设计、合成及其诱导PDGF与GST之间人工通讯的作用机制如图2所示。该“换能器”的结构整合了一个PDGF DNA适配体和一个双乙炔酸酰胺（bEA），后者是一种已知的GST抑制剂（图2a）19。这些结合元件使“换能器”能够以不同的亲和力分别结合PDGF和GST，其解离常数（kd）分别为26 nM和144 nM4。此外，根据该设计，当“换能器”结合PDGF后，bEA单元会与PDGF表面发生非特异性相互作用，从而显著降低bEA抑制剂的活性19,22,23。图2b展示了该系统的工作机制。当将“换能器”加入具有活性的GST中时，两个EA单元会同时结合该二聚体酶的两个活性位点，从而抑制其活性。然而，在存在PDGF的情况下，会形成PDGF-“换能器”复合物，阻止bEA单元对GST的抑制作用。这将导致GST-“换能器”复合物解离，从而使GST重新激活。随后，通过加入未经修饰的PDG...

我们提出了设计合成“化学转导剂”的指南，这类转导剂能够诱导原本不相关的天然蛋白质之间产生相互作用。此外，还提供了合成和测试一种特定“转导剂”的详细实验方案，该转导剂可使生长因子激活一种解毒酶，从而调控抗癌前体药物的裂解过程。

信号转导通路通过信号蛋白的功能介导，调控细胞对各种环境信号的响应……

本实验的总体目标是通过光谱学方法追踪由合成化学换能器诱导的两种蛋白质之间的非天然通信。该研究将证明开发信号蛋白的合成类似物的可能性，这类类似物能够执行自然界中不存在的信号转导通路。利用常见的分光光度计追踪非天然的蛋白质间通信，有助于开发和改进人工化学换能器的功能，并推动我们更接近实现人工信号转导治疗的目标。化学换能器由血小板源性生长因子（PDGF）适体、二价乙酰唑胺GST抑制剂、荧光团和淬灭剂组成。本视频中不会演示化学换能器的合成过程。但在文本方案中有描述。此处展示了化学换能器的工作原理。当两个EA基团结合到GST酶的活性位点时，化学换能器会抑制GST的酶活性。加入血小板源性生长因子（PDGF）可形成PDGF化学换能器复合物，该复合物会破坏换能器与GST之间的相互作用，从而恢复GST的酶活性。随后加入未修饰的PDGF适配体可释放化学换能器，使其重新抑制该酶的活性。在开始研究血小板源性生长因子（PDGF）对谷胱甘肽 S-转移酶（GST）活性调控的实验之前，需在酶标仪中建立用于动力学测定的实验程序。创建一个新的实验作为标准方案，选择“程序”以打开“程序设置”窗口。在窗口上方的弹出列表中，根据耗材制造商选择相应的 384 孔板类型。在左侧菜单中选择“读取”，检测方法选择“吸光度”。终点检测模式。在波长设置窗口中输入340纳米。选择全板读取，并选定需要测量的孔位。然后单击“确定”关闭读数窗口。在左侧菜单中选择“开始动力学”。将运行时间设置为10分钟。选择“最小间隔”选项，然后单击“确定”关闭动力学窗口。将读数线拖入动力学测量中。选择“验证”按钮，然后选择“确定”按钮。保存实验。选择“播放”按钮。此时将出现一个对话框，但在准备开始动力学测量之前，请勿点击“确定”按钮。在设置好酶标仪后，下一步是准备用于检测在化学换能剂和PDGF存在下GST活性的样品。为了以三复孔检测四种浓度的PDGF，需准备四个样品，每个样品均含有3.25 µL化学换能剂和3.25 µL GST M-1。向每个样品中分别加入 0、1.2、2.4 或 4.9 µL 的 PDGF。然后向每个样品中加入适量的检测缓冲液，使总体积达到 130 µL。将样品在室温下孵育 10 分钟。10 分钟后，将每个样品的 40 微升转移至 384 孔透明板中的孔内。将四个样品中的每一个仅转移至同一行中的奇数孔或偶数孔，以便使用多通道移液器添加底物。接下来，使用12通道多通道移液器，迅速向每个样品中加入10 µL此前在96孔板中预先配制好的每种底物。轻轻快速混匀，避免产生气泡。立即将板放入酶标仪中，并在对话框中点击“确定”按钮，开始动力学测定。为了研究化学转导剂介导的GST激活抑制循环，准备五个样品，每个样品包含84.5 µL测定缓冲液、3.25 µL化学转导剂和3.25 µL GST M1-1。在室温下孵育三分钟。向样本一中加入 3.65 微升检测缓冲液，向样本二、三、四和五中加入 3.65 微升 PDGF。室温孵育 3 分钟。向样本一和样本二中加入 3.12 微升检测缓冲液，向样本三、四和五中加入 3.12 微升 PDGF 适配体。室温孵育三分钟。向样品一、二、三中各加入24.4微升检测缓冲液，向样品四和五中各加入24.4微升PDGF。室温孵育三分钟。向样品一至四中各加入7.8微升检测缓冲液，向样品五中加入7.8微升PDGF适配体。室温孵育五分钟。将样品转移至384孔透明板中。为进行三复孔实验，请迅速向样品中加入底物。将板插入酶标仪，并开始动力学检测。开始本实验时，按照方案文本中的描述，在酶标仪中设置用于动力学测量的实验程序。在384孔透明板的两个孔中分别制备两个样品。对于每个孔，将1 µL GST M1-1与1 µL化学换能剂加入38 µL的检测缓冲液中混合。在两个孔之间留出一个空孔。使用12通道多通道移液器，迅速向每个孔中加入10微升底物，并轻轻快速混匀，避免产生气泡。立即将酶标板插入酶标仪并开始动力学检测。当酶标仪在3.5分钟后开启时，迅速向其中一个孔中加入1.125微升PDGF，轻轻混匀，然后让酶标板重新进入酶标仪以完成后续的动力学检测。在准备本实验样品之前，按照方案文本中所述，在酶标仪中预先设置用于动力学检测的实验程序。将使用亚硝酸盐/硝酸盐比色试剂盒来测定一氧化氮的生成。在96孔板中，向第一行各孔加入50 µL测定缓冲液，向第二行各孔加入70 µL Griess One试剂。每孔加入 70 微升 Griess 二试剂至第三行。准备四种样品，每种含 4.8 微升化学换能器。向样品一中加入 155.2 微升检测缓冲液。对于样品二，加入 3.2 微升 GST M1-1 和 152 微升检测缓冲液。对于样品三，加入 9.6 微升 PDGF 和 145.6 微升检测缓冲液。对于样品四，加入 3.2 微升 GST M1-1、9.6 微升 PDGF 和 142.4 微升检测缓冲液。将样品在室温下孵育10分钟。使用384孔透明板，每孔加入50 µL样品，每个样本设三个重复孔。在同一行中仅向奇数孔或偶数孔加样，以便使用多通道移液器添加底物。向每个样品中加入 0.54 微升 JS-K 前药。迅速向每个样品中加入 10 微升谷胱甘肽溶液，并轻轻快速混匀，避免产生气泡。将培养板插入读板仪，开始动力学检测。动力学测定结束后，立即向96孔板第一行的每个孔中加入50 µL各待测样品，并用测定缓冲液补足体积。然后，从该板第二行的每个孔中各取50 µL转移至第一行对应孔中。再从该板第三行的每个孔中各取50 µL加入至第一行对应孔中。室温下避光孵育10分钟。在测定550纳米处吸光度之前。不加化学换能剂与加入化学换能剂测定GST活性的结果表明，该化学换能剂可抑制GST活性。通过向GST-化学换能器复合物中添加浓度递增的PDGF，可重新激活GST。连续向GST-化学换能器复合物中加入PDGF以及未修饰的PDGF适配体表明，PDGF与GST之间的相互作用是可逆的。在向GST-换能器复合物中加入PDGF后，3.5分钟内加入底物即可观察到GST活性迅速升高。尽管在含有GST、PDGF和化学转导剂的混合物中加入PDGF适配体后，GST活性降低。这些结果表明，该系统能够实时响应其环境的变化。随后，利用JS-K（一种由GST激活以释放有毒一氧化氮的抗癌前药）研究了该系统控制前药活化的能力。通过向化学换能器中添加 JS-K 以及不同组合的 GST 与 PDGF 后对释放的一氧化氮量进行测定，结果证实只有当 GST 与 PDGF 同时存在时才能激活 JS-K。这些结果表明，一种合成试剂能够使生长因子触发谷胱甘肽 S-转移酶的催化活性，而该酶并非其天然的酶伴侣。因此，未来此类仿生分子可用于改变细胞对环境信号的响应，或赋予细胞新的特性。

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模拟信号蛋白的功能：走向人工信号转导疗法

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。...

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。...

应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本文介绍了一种利用抗体芯片检测多种细胞模型中信号通路变化的实验方案。这些变化可由药物、缺氧、紫外光、辐射，或基因过表达、表达下调、基因敲除等因素引起，在多种疾病模型中具有重要意义，有助于判断某种疗法是否有效，或揭示药物耐药的潜在机制。...

利用抗体芯片检测信号转导通路评估对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性

本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。...

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

利用光遗传学手段调控信号通路，是研究发育、再生、稳态及疾病过程中信号如何被解码的一种强有力策略。本方案提供了在早期斑马鱼胚胎中使用基于光-氧-电压感应结构域的 Nodal...

斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus...

从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

由于人类二尖瓣的细胞含量较低，因而蛋白质合成水平较低，这使得其分析变得复杂，目前人类二尖瓣的蛋白质组成仍部分未知。本研究提供了一种高效提取蛋白质的方案，可用于二尖瓣蛋白质组的分析。...

优化的人类二尖瓣蛋白质提取方案

本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。...

结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

了解如何利用合成化学转导器实现蛋白质之间的非自然通讯，通过PDGF适配体与GST抑制剂的组合调控酶活性。该方法为人工信号转导疗法的开发提供了新思路。

模拟信号蛋白的功能：迈向人工信号转导治疗

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