高密度脂蛋白的分离用于非编码小RNA定量

本实验方案的总体目标是对纯化的脂蛋白上的小非编码RNA进行定量分析。该方案有助于解答脂蛋白研究领域中的关键问题，例如界定健康与疾病状态下脂蛋白小RNA的特征谱型，并推动将脂蛋白小RNA发展为疾病生物标志物或细胞间通讯信号。该技术的主要优势在于，可对高度纯化的脂蛋白在疾病状态或实验条件下发生的小RNA变化进行分析。

该技术对于心脑血管代谢性疾病的治疗具有重要意义，因为细胞外RNA是一类新型疾病生物标志物，而脂蛋白小RNA在未来研究中作为药物靶点具有广阔前景。尽管该方法主要用于高密度脂蛋白（HDL）小RNA的分离，但也可经调整后适用于极低密度和低密度脂蛋白的小RNA研究。通常，初次使用该方法的研究人员可能因缺乏密度梯度超速离心所需的适当设备和操作经验而面临困难。

本方案结合了多种成熟方法，用于对高纯度高密度脂蛋白（HDL）上的小RNA进行定量分析，可采用高通量测序或实时PCR技术。本视频将介绍HDL的纯化过程。该方案将由我的助手Evan Shadari进行演示。

首先，将90微升100倍抗氧化剂加入9毫升血浆中。然后，通过向每9毫升血浆中加入0.251克溴化钾，将血浆密度调节至1.025克/毫升。室温下轻轻摇动血浆，直至所有盐完全溶解。

然后，将血浆转移至超速离心管中，并确保顶部有一层气泡。血浆下方不应有 trapped 的空气。接下来，取一根18号针头，在距尖端1厘米处弯成90度角，斜面朝上。

然后，使用注射器和弯针，小心地将3 mL覆盖液一号加至血浆上层。去除表面大部分气泡，使弯月面与管壁边缘之间保留2至3 mm的距离。随后，小心将试管放入SW 40 Ti离心桶中。

称量每个带盖的离心管，精确平衡将置于离心机相对位置的离心管。接着，将转子放入超速离心机中，在4°C条件下以274,400 ×g离心24小时，制动设置为中间值4。第二天，小心地从转子中取出离心管桶，并将离心管从桶中取出。

然后，使用注射器和弯针缓慢吸取上层覆盖液顶部的 2 毫升液体，此为 VLDL IDL 组分。接着，收集剩余的 7 毫升血浆，并转移至 15 毫升锥形管中。

加入二号覆盖溶液，将血浆体积补足至九毫升。然后，加入0.746克溴化钾，调节密度至1.080克/毫升。接着轻轻摇动样品，使盐溶解，约需20分钟。

然后，将样品转移至超速离心管中，注意不要混入任何气泡。确保管顶部形成一层气泡。使用弯针，小心地在上方覆盖3毫升的覆盖溶液三号。

然后，去除大部分气泡，小心将离心管装入 SW 40 Ti 桶中。平衡后，按照之前所述条件离心 24 小时。次日，使用弯头针小心从覆盖层的上层吸取两毫升液体。

这是低密度脂蛋白（LDL）组分。然后，将剩余样品转移至一个新的15毫升锥形管中，并加入溶液4，使总体积达到9毫升。接着，通过加入约3.33克溴化钾并将样品轻轻摇动至盐完全溶解，调节密度至1.30克/毫升。

然后，将样品转移至超速离心管中，并小心地加入三毫升溶液五。接着，将样品按之前条件进行超速离心，但离心时间为48小时。两天后，使用注射器和弯针收集上层两毫升的覆盖液。

此部分即为高密度脂蛋白（HDL）组分。为去除高盐溶液，将HDL组分转移至湿润的透析袋中，透析袋的分子量截留值为10,000。然后在1升1×PBS缓冲液中，于4°C、温和搅拌条件下透析24小时。

在24小时内更换PBS溶液三次。随后，采用BCA法测定HDL组分的蛋白浓度。细胞外囊泡（即外泌体）的密度与小HDL相似，因此可能存在于与HDL相同的密度组分中。

因此，HDL 组分需要通过 FPLC 进一步纯化。在使用 FPLC 前，立即取 500 微升溶液中含 1.2 毫克的 DGUC HDL 组分，通过 0.22 微米离心滤器过滤。将滤过的样品收集至 FDLC 进样注射器中，确保无气泡残留。

接下来，将FPLC流速设置为0.3毫升/分钟，压力限制为2.6兆帕。然后用0.2柱体积的缓冲液平衡色谱柱。现在将三毫升缓冲液中的样品注入FPLC仪器，并开始运行。

收集1.5毫升组分，共72个组分。使用比色法试剂盒，按照制造商说明书测定总胆固醇水平，以确定对应于DGUC HDL的FPLC组分。预期可获得6至7个含有DGUC HDL的FPLC组分。

合并所有含高密度脂蛋白（HDL）的组分，并使用10千道尔顿截留分子量的离心滤膜，在4°C、4,000 × g条件下离心1小时，或直至HDL浓缩至约100微升。随后收集HDL浓缩液，并采用BCA法测定蛋白质含量。之后，使用等量的HDL总蛋白进行RNA提取。

采用FPLC对人血浆进行分级分离，无需密度梯度离心。其中六个组分对应高密度脂蛋白（HDL），另六个组分对应极低密度脂蛋白。脂质（黑色）、胆固醇（红色）和蛋白质（蓝色）均通过比色试剂盒进行测定。

相比之下，在FPLC之前使用密度梯度超速离心法，结果发现脂蛋白和胆固醇几乎仅存在于HDL组分中。从四位健康血浆供体的HDL中提取总RNA，并采用单端50个碱基对的测序方案进行测序。标准化测序读段的分布显示，在约21和34个核苷酸处富集了小RNA。

文库分析显示，38%的读段为微小RNA（micro RNA），37%来源于转运RNA（tRNA）。此外还存在其他各类RNA，包括杂类RNA、核糖体RNA（rRNA）、小RNA、小核仁RNA（snoRNA）以及长链非编码RNA（lncRNA）。该技术一旦掌握，操作得当的情况下可在十天内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，需使用其他方法（如PCR或Northern印迹）对高通量测序所观察到的HDL小RNA变化进行验证。在完成该操作后，可在RNA提取及测序准备步骤期间，同时开展其他实验方法，例如HDL胆固醇流出能力检测和HDL抗炎功能检测，以回答更多科学问题，例如探究HDL小RNA变化与HDL功能之间的相关性。该技术建立后，为脂质与脂蛋白领域的研究人员提供了研究非胆固醇类物质（特别是核酸）及其在代谢性疾病（如高胆固醇血症或糖尿病）中作用的新途径。

并且不要忘记，处理人血浆可能具有极高的危险性，操作人员应接受过血液传播病原体方面的适当培训，并在执行该技术时穿戴合适的一次性防护装备。