Name: 鞘毛细管电泳 - 质谱联用生物样品的代谢谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习使用无鞘多孔尖端毛细管电泳-质谱联用技术进行生物样品代谢谱分析。该方法可高效分离高极性带电代谢物，适用于阴离子和阳离子代谢物的同时检测，为生物医学和生物分析化学研究提供可靠手段。

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Rawi Ramautar 博士希望感谢荷兰科学研究组织（NWO Veni 722.013.008）的维尼资助计划提供的经费支持。

注意：此处所述使用无鞘流毛细管电泳-质谱联用技术（sheathless CE-MS）进行代谢谱分析的实验方案仅限于实验室使用。下述操作步骤基于近期发表的研究工作4,5，更多实验细节可参见这些文献。在使用本方案前，请查阅所有相关化学品的安全数据表（MSDS）。在实施本方案所述实验时，请务必遵循所有适当的实验室安全规程，包括佩戴护目镜、实验服和手套。
1. 试剂溶液和样品的制备
<ol>
	<li>背景电解质（BGE）的制备
	<ol>
		<li>每天配制新的BGE溶液（10% (v/v) 乙酸，pH 2.2）。</li>
		<li>在通风橱中，向一个10 ml玻璃小瓶中加入9.0 ml水，再加入1.0 ml乙酸，并使用涡旋振荡器充分混匀溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代谢物标准混合液的制备
	<ol>
		<li>将50 µl含60种阳离子代谢物的50 µM阳离子标准混合液溶解于50 µl水中，并充分混匀。不使用时储存于-80 °C。</li>
		<li>将50 µl含30种阴离子代谢物的50 µM阴离子标准混合液溶解于50 µl水中，并充分混匀。为避免同一标准混合液反复冻融，应分装储存，不使用时保存于-80 °C。 
		注意：代谢物标准混合液在-80 °C妥善保存条件下可稳定保存3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶质母细胞瘤细胞系提取物的制备
	<ol>
		<li>用1 ml冰浴的0.9%氯化钠溶液将贴壁的人胶质母细胞瘤U-87 MG细胞清洗三次21。</li>
		<li>向贴壁细胞中加入2 ml冰浴的甲醇/水溶液（8/2, v/v），并用带橡胶头的细胞刮刀刮取细胞21。</li>
		<li>将甲醇/水溶液收集至离心管中，超声处理2分钟。</li>
		<li>向甲醇/水相中加入氯仿（最终比例为8/8/2, v/v/v），并在4 °C下以16,100 × g离心10分钟。</li>
		<li>收集甲醇/水层，使用真空浓缩仪将该组分蒸发至干。将干燥物重新溶解于50 µl水中，用于无鞘液毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析。不使用时，样品应储存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 建立无鞘流毛细管电泳-质谱联用系统
<ol>
	<li>安装带多孔尖端喷雾器的裸熔融石英色谱柱
	<ol>
		<li>将一根新的带多孔尖端喷雾器的裸熔融石英色谱柱（内径 30 µm × 总长度 90 cm）安装至毛细管电泳（CE）仪器中。</li>
		<li>使用控制 CE 仪器的软件，以 100% 甲醇在 50 psi 压力下进行 15 分钟正向冲洗，并目视检查冲洗过程中是否有液体从毛细管出口流出。随后使用背景电解质（BGE）溶液在 50 psi 压力下反向冲洗 5 分钟，以目视检查是否有液体从导电毛细管中流出。</li>
		<li>若在毛细管出口未观察到液滴形成，则在 100 psi 压力下重复步骤 2.1.2。若在此步骤中仍未观察到液滴形成，则更换一根新的裸熔融石英色谱柱。</li>
		<li>以 50 psi 压力用去离子水冲洗分离毛细管 10 分钟，接着以 50 psi 压力用 0.1 M NaOH 冲洗 10 分钟，再以 50 psi 压力用水冲洗 10 分钟，最后以 50 psi 压力用 BGE 冲洗 10 分钟。 
		注：步骤 2.1.1 至 2.1.4 仅在安装新的毛细管色谱柱时需要执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将毛细管多孔尖端喷雾器与电喷雾电离质谱（ESI-MS）联用 
	注：在将 CE 毛细管与质谱（MS）联用前，确保 MS 仪器已完成校准并与 CE 系统连接。将 ESI 电压设为 0。为 MS 仪器配备纳米电喷雾离子源。由于在极低流速下仅通过施加 1500 V 的离子喷雾电压即可实现电喷雾，因此不启用 Gas 1、Gas 2 及接口加热器温度。将帘气压力设为 5 psi。
	<ol>
		<li>将熔融石英色谱柱的喷雾尖端从水管中取出，并安装至纳米电喷雾源适配器中，以实现与 MS 仪器的联用。确保 CE 仪器中 BGE 样品瓶的高度与喷雾尖端的高度一致。</li>
		<li>以 50 psi 压力用 BGE 冲洗 5 分钟，检查导电毛细管中是否有液体流动。在此冲洗过程中，应在 ESI 喷雾针底部观察到液滴形成。</li>
		<li>以 50 psi 压力在正向方向用 BGE 冲洗分离毛细管 10 分钟。在此步骤中，应在多孔尖端喷雾器（喷雾尖端）末端观察到液滴形成。</li>
		<li>将多孔尖端喷雾器定位至 MS 进样口入口处，距离约为 2 至 3 mm。</li>
		<li>使用 1 分钟的电压 ramp 时间施加 30 kV 电压，并开始在 m/z 65 至 1,000 m/z 范围内采集 MS 数据，用于代谢谱分析，初始 ESI 电压设为 0。 
		注：由于不应产生电喷雾，质谱图中应无信号。</li>
		<li>在持续采集数据的同时，将 ESI 电压设为 1,000 V，并以每次 200 V 的增量逐步提高 ESI 电压，直至在至少 15 分钟内观察到稳定的背景信号。</li>
		<li>通过在 x、y 或 z 方向上移动多孔尖端喷雾器，优化其相对于 MS 进样口中心的位置，以确定可获得最强且最稳定 MS 信号（总离子电泳图）的位置。</li>
		<li>在优化多孔尖端喷雾器位置并确定最佳 ESI 电压后，将 ESI 电压设为 0 V，并使用 5 分钟的 ramp 时间将 CE 电压从 30 kV 降至 1 kV。</li>
		<li>使用确定的最佳 ESI 电压创建 MS 方法，并在 CE 仪器上建立 CE 方法，用于代谢物标准品和生物样品的分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 代谢物标准品与生物样品的分析
<ol>
	<li>无鞘液毛细管电泳-质谱系统性能评估
	<ol>
		<li>将20 µl阴离子代谢物标准混合液转移至一个空的100 µl微量离心管（PCR管）中，该管需可插入毛细管电泳（CE）样品瓶，然后将此管放入进样样品盘。 
		注意：微型瓶中可靠进样的最小体积为 2 µl。
		<ol>
			<li>启动在步骤2.2.9中创建的质谱负离子模式采集方法，随后使用控制毛细管电泳仪器的软件启动碰撞能量序列。</li>
			<li>用BGE在50 psi压力下冲洗分离毛细管3分钟，随后在2.0 psi压力下进样60秒（20 nl，相当于毛细管体积的3%），再在1.0 psi压力下注入BGE 10秒。 
			注意：随后将触发质谱数据采集。</li>
			<li>在入口端施加 -30 kV 电压，电压爬升时间为 1.0 min，压力为 0.5 psi，持续 30 min。电泳分离 30 min 后，停止质谱数据采集，并在 5 min 内以梯度方式将毛细管电泳电压降至 -1 kV（电泳分离后逐步降低毛细管电泳电压可提高多孔尖端毛细管喷雾头的耐用性）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在样品进样之间，依次以30 psi压力分别用纯水、0.1 M氢氧化钠、纯水和BGE冲洗毛细管，每次3分钟。</li>
		<li>通过确定所分析的阴离子代谢物混合物的迁移时间和信号强度来分析记录的数据。</li>
		<li>评估阴离子代谢物标准品是否出现在10至28分钟的区间内。</li>
		<li>检测三种结构相关的异构体， 即D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸部分分离 即，前两个峰之间的分离度约为0.75，后两个峰之间的分离度约为0.50（参见 图1). 
		注意：1.5 的分辨率表示相邻两个峰达到基线分离。</li>
		<li>对阳离子代谢物混合物重复步骤 3.1.1 和 3.1.2。确保质谱检测现处于正离子模式，毛细管电泳电压为 +30 kV。</li>
		<li>通过确定所分析的阳离子代谢物混合物的迁移时间和信号强度来分析记录的数据。</li>
		<li>评估阳离子代谢物标准品是否出现在8至22分钟区间内。检查异亮氨酸和亮氨酸是否在15至15.5分钟之间出峰，并确定其分离度是否约为0.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物样本分析
	<ol>
		<li>对中国胶质母细胞瘤细胞系提取物进行阴离子代谢谱分析时，重复步骤 3.1.1 和 3.1.2。 
		注意：样品预处理后获得的代谢物含量相当于细胞密度约为20个细胞/纳升，因此，每次进样20纳升相当于每项分析含有400个细胞。</li>
		<li>为代谢物乳酸创建提取离子电泳图（m/z 89.0243），质谱精度为5 mDa，并检查信号强度是否超过100,000计数。</li>
		<li>对中国台湾胶质母细胞瘤细胞系提取物进行阳离子代谢谱分析，重复步骤3.1.1和3.1.2。 
		注意：在此模式下，20 nl 进样应观察到信息丰富的总离子电泳图。</li>
		<li>分析结束后或不使用时，用50 psi的水冲洗毛细管15分钟，并将毛细管的入口端置于盛有水的样品瓶中，多孔部分（出口端）置于另一盛有水的试管中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+metabolomics%3A+strategies+to+understand+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li>
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<li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li>
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<li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces%3A+fundamental+concepts+and+technical+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li>
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<li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li>
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</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍了一种采用多孔尖端喷雾器的无鞘液毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法，用于分析高极性和带电代谢物。该方法的一个独特之处在于，仅需切换质谱检测极性和毛细管电泳电压极性，即可实现对阴离子或阳离子代谢物的分析。该方法可高效分离多种生物样品中的高极性、带电代谢物，分离效率高，对结构相似的代谢物尤为重要，检测限可达（低）纳摩尔浓度范围。本实验方案重点阐述了无鞘液CE-MS技术在细胞提取物代谢谱分析中的应用，以示例说明该方法在生物样品代谢谱分析中的实用性。只要采用适当的样品前处理步骤，该方法也可用于其他类型生物样品（如人尿液5）的代谢谱分析。
无鞘液CE-MS方法基于一种多孔尖端发射器，可利用毛细管电泳固有的低流速特性。在此背景下，稳定的电喷雾电离（ESI）信号是实现可重复代谢谱分析的前提条件。因此，喷雾尖端必须准确定位于质谱入口前方。在此配置中，ESI过程主要依赖于背景电解质（BGE）的性质，因此BGE的优化至关重要。与可添加各种鞘液成分以提高离子化效率的鞘液型CE-MS系统相比，无鞘液配置的灵活性较低。无鞘液ESI喷雾针必须完全充满导电液体（即，BGE溶液）。不稳定的ESI信号可能由毛细管部分或完全堵塞引起。通过高压用BGE冲洗可能解决此问题；否则需要更换分离毛细管。在评估分析性能之前，应首先获得稳定且每日一致的ESI背景信号。
无鞘液毛细管电泳-质谱联用法用于代谢谱分析时，需每日使用代谢物标准混合物检测其分析性能。在相同实验条件下，迁移时间应保持一致， 即， 日内（n=10）和日间（n=5）变异应低于3%，采用20 nl进样量注入代谢物标准品混合溶液（12.5 µM）时，应获得峰高/峰面积变异低于15%、理论塔板数在60,000至400,000之间的结果。大多数代谢物标准品的检测限应达到纳摩尔（nM）水平。只有在满足上述条件时，该方法方可用于生物样本的代谢谱分析。若未满足，则需对质谱仪进行调谐和重新校准，或更换多孔尖端毛细管喷雾头。
在毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析之间，有效的冲洗步骤至关重要，不仅可防止潜在的样品残留，还能保持分离性能。潜在的样品残留可能由被样品污染的背景电解质（BGE）瓶引起，可通过更换新的BGE瓶来解决。当不使用无鞘液CE-MS方法时，必须断开分离毛细管，并将毛细管的进样端置于水中，外侧则套上保护套并浸入装有水的试管中，以延长毛细管的使用寿命。
总之，按照本方案所述步骤使用时，所提出的无鞘流毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法在生物样本的代谢谱分析中展现出强大的应用潜力。目前阶段，无鞘流CE-MS技术亟需开展实验室间比对研究，以评估该方法在代谢组学应用中的（长期）重现性与稳健性。本方案可能促进此类研究的开展。仍有一些分析挑战需要考虑。为获得最佳性能，毛细管电泳电流应尽量保持在5 µA以下；此外，目前多孔尖端毛细管喷雾头仅提供91 cm长度，这可能限制高通量分析方法的开发。同时，本研究中采用低pH分离缓冲液进行阴离子代谢物分析，但该条件可能并非实现结构相似的糖磷酸酯类物质基线分离的最优选择。还需注意的是，该方法仅适用于分析在所用分离条件下带（部分）负电荷的阴离子代谢物。下一步是评估无鞘流CE-MS方法在临床代谢谱分析研究中的实用性，因为目前单根多孔尖端毛细管喷雾头仅可用于最多100个生物样本的分析。
总体而言，无鞘流毛细管电泳-质谱联用技术的进一步发展将为代谢组学领域开辟新的方向。 即， 在样本受限的情况下，深入理解生物功能。

在现代代谢组学中，采用高端的分析分离技术来分析多种代谢物类别，以获得能够代表生物体生理状态的检测结果1。代谢组学研究的最终目标是回答特定的生物学或临床问题。目前，人类代谢组数据库已包含超过40,000种代谢物条目，涵盖内源性和外源性化合物（后者来源于营养物质、微生物群、药物及其他来源）2。鉴于这些代谢物在理化性质和浓度范围上的巨大差异，必须联合使用多种具有不同分离机制的分析技术，才能在给定的生物样本中尽可能全面地进行代谢物谱型分析。例如，Psychogios et al. 结合五种分析分离技术对人血清进行代谢谱分析，成功检测出超过4,000种化学性质各异的代谢物3。
本文将重点关注近年来发展的用于生物样品代谢谱分析的毛细管电泳-质谱（CE-MS）策略4,5。在毛细管电泳（CE）中，更具体地说是毛细管区带电泳（CZE；通常简称为CE），化合物根据其电荷与尺寸的比值进行分离，因此该分析技术非常适用于极性和带电代谢物的分析。CE的分离机制与基于色谱的技术有本质不同，从而为生物样品的代谢组成提供了互补的视角6-8。Soga及其同事首次展示了CE-MS在生物样品中代谢物全局谱分析中的应用价值9,10。迄今为止，CE-MS在代谢组学中的可行性与实用性已得到广泛验证11-15。CE通常通过鞘液接口技术与MS联用16,17；然而，由于毛细管流出液被鞘液稀释，检测灵敏度本质上受到限制。
最近的研究表明，与采用经典鞘液接口的毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）相比，无鞘液接口的使用显著提高了对多种生物样品中代谢物的检测覆盖范围5,18,19。例如，在人尿液样品中，通过无鞘液CE-MS检测到约900个分子特征，而使用鞘液CE-MS仅观察到约300个分子特征5。所采用的无鞘液接口基于一种由Moini发明的多孔尖端喷雾器20，该设计可有效利用毛细管电泳本身极低的流速特性，并与纳米电喷雾离子源质谱（nano-ESI-MS）良好结合。
为了促进无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术（sheathless CE-MS）在代谢组学领域的应用，本文提供了一种实验方案，详细描述了该方法如何用于生物样品中高极性代谢物的分析，并以胶质母细胞瘤细胞系提取物的分析为例进行了说明。结果表明，用于阳离子代谢物谱分析的无鞘液CE-MS方法，同样可在完全相同的毛细管和分离条件下用于阴离子代谢物的谱分析，从而缩短分析时间，并为带电代谢物的全局谱分析提供统一的分析平台。本方案还介绍了一种有效对准无鞘液多孔尖端喷雾器与质谱仪器的策略。

<table><tbody><tr><td>CESI 8000 仪器</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td>将 CESI 与质谱联用所需的 OptiMS 适配器</td></tr><tr><td>OptiMS 熔融石英色谱柱，30&amp;nbsp;&amp;mu;m 内径 × 90&amp;nbsp;cm 总长度</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>适用于 Sciex Nanospray III 源的 OptiMS 适配器</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>CESI 样品瓶</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>微量样品瓶</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>在通风橱中使用</td></tr><tr><td>阳离子代谢物混合物</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>阴离子代谢物混合物</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS 超纯级 Chromasolv）</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>在通风橱中使用</td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液</td><td>Sigma</td><td>72079</td><td>0.1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG 胶质母细胞瘤细胞系</td><td>Sigma</td><td>89081402</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>有毒；在通风橱中使用</td></tr></tbody></table>

无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术用于生物样本的代谢谱分析

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

在代谢组学中，为实现对复杂样品中（内源性）代谢物的全局分析，需采用多种分析技术。本文介绍了一种利用毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）分析生物样品中阴离子和阳离子代谢物的实验方案。毛细管电泳特别适用于高极性和带电代谢物的分析，因其分离机制基于化合物的电荷与尺寸比。一种近期开发的无鞘液接口设计， 即， 一种多孔尖端接口被用于将毛细管电泳（CE）与电喷雾电离（ESI）质谱（MS）联用。该接口技术可有效利用CE固有的低流速特性与MS联用，从而实现对多种极性代谢物类别达到纳摩尔级的检测限。本文所述方案基于在低pH分离条件下，采用带有 porous tip 发射器的未涂覆熔融石英毛细管，用于生物样品中多种代谢物类别的分析。结果表明，仅通过切换质谱检测极性和分离电压极性，即可利用相同的无鞘液CE-MS方法对阳离子型代谢物（包括氨基酸、核苷和小分子肽）或阴离子型代谢物（包括糖磷酸、核苷酸和有机酸）进行分析。该方案可在不到1小时的CE-MS分析时间内，获得尿液、脑脊液以及胶质母细胞瘤细胞系提取物等多种生物样品中高度信息丰富的代谢谱。

所提出的无鞘流CE-MS方法能够提供高效、 即， 板数范围为 60,000 至 400,000，在使用 10% 乙酸（pH 2.2）作为背景电解质时，可实现纳摩尔级检测限下的阴离子和阳离子代谢物谱图分析。该方法对高极性阴离子代谢物的分离性能通过三种结构相关的糖磷酸异构体进行验证（图1）。尽管这三种分析物未能实现基线分离，但部分分离已足以通过质谱（MS）实现选择性检测，因为这些分析物具有相同的精确质量。该无鞘液毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法在少量细胞代谢谱分析中的潜力， 即，20 nl的注射量相当于400个细胞（细胞密度约为20个细胞/nl），用于分析胶质母细胞瘤细胞系提取物中的阳离子代谢物图2），其中检测到300多个分子特征的信噪比（S/N）≥ 5。
<img alt="提取离子电泳图、色谱图、葡萄糖-磷酸峰、强度随时间变化。" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 采用无鞘液毛细管电泳-质谱法分析糖磷酸异构体。 通过无鞘液CE-MS在负离子模式下获得的三种糖磷酸异构体（25 µM）的提取离子电泳图。实验条件：背景电解质（BGE），10% 乙酸（pH 2.2）；分离电压，-30 kV（在毛细管入口施加+0.5 psi）；样品进样，2.0 psi 持续 60 秒。经许可转载4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电泳图谱、氨基酸分离、离子分析、峰强度、色谱结果。" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用无鞘层毛细管电泳-质谱联用技术对异亮氨酸和亮氨酸的分析。 通过无鞘层CE-MS在正离子模式下获得的两种氨基酸异构体（25 µM）的提取离子电泳图。实验条件：背景电解质（BGE），10% 乙酸（pH 2.2）；分离电压，+30 kV；样品进样，2.0 psi 持续 60 秒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="总离子电泳图，胶质母细胞瘤细胞提取物分析，m/z 65-1000，正离子模式。" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术用于分析细胞系提取物中阳离子代谢物的潜力。 在胶质母细胞瘤细胞系提取物中，通过无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术在正离子模式下检测到的代谢谱（总离子电泳图）。实验条件：背景电解质溶液（BGE），10% 乙酸（pH 2.2）；分离电压，+30 kV；样品进样，2.0 psi，持续60秒。经许可转载4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种采用无鞘流多孔尖端接口设计的毛细管电泳-质谱联用技术对生物样品进行代谢谱分析的实验方案。

在代谢组学中，为对复杂样品中的（内源性）代谢物进行全局分析，需采用多种分析技术。本文介绍了一种……

本实验的总体目标是展示如何利用无鞘流、多孔尖端接口的毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）来分析高度极性和带电的代谢物。由于大多数代谢物通常带有电荷，可能呈阳离子或阴离子状态，因此采用毛细管电泳等电泳分离方法是最适合的分离手段。然而，近年来该技术的灵敏度尚不够理想。这是由于接口问题，且原有方法也不够稳健。但我们通过采用无鞘层的自由界面以及新方案，很好地解决了这两个问题。利用新型无鞘层多孔尖端接口的毛细管电泳-质谱联用技术可用于解决代谢组学领域中的关键临床问题。例如，利用该技术可轻松实现对高极性带电代谢物的分析。S 复合物根据电荷与尺寸的比值进行分离。该技术更常用于对这类化合物在标记生物样本中的体积分析。所提出的无鞘液毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法的一个独特之处在于，仅通过切换CE电压极性和MS检测极性，即可实现对阴离子和阳离子代谢物的分析。通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为CE-MS被认为是一种相对较新且复杂的技术。开始该操作时，将一根带有微孔尖端发射器的新裸熔融石英色谱柱安装至毛细管区带电泳（CE）仪器中。使用控制毛细管电泳仪器的软件，以50 psi的压力向前冲洗甲醇15分钟，并目视检查液体是否从毛细管出口流出。然后，使用背景电解质（BGE）溶液以50 psi的压力反向冲洗5分钟，目视检查液体是否从导电毛细管中流出。如果未观察到液体从毛细管出口流出，则在100 psi的压力下重复上一步骤。接下来，依次以50 psi的压力用去离子水冲洗分离毛细管10分钟，再用0.1摩尔的氢氧化钠溶液以50 psi压力冲洗10分钟，随后再次用去离子水以50 psi压力冲洗10分钟，最后用BGE溶液以50 psi压力冲洗10分钟。完成冲洗后，将熔融石英色谱柱的喷雾头从水管中取出，并安装至纳喷雾电离源适配器中，以连接质谱仪。确保毛细管电泳仪中背景电解质（BGE）溶液样品瓶的高度与喷雾针尖的高度一致。通过以50 psi压力用BGE溶液冲洗5分钟，检查导电毛细管中液体的流动情况。在此冲洗步骤中，应在电喷雾电离（ESI）喷雾针尖底部观察到液滴形成。冲洗后，以50 psi的压力在正向用BGE溶液冲洗分离毛细管10分钟。在此步骤中，应在多孔尖端喷雾器的尖端观察到液滴。现在，将多孔尖端喷雾器置于质谱入口处，距离约为两到三毫米。使用1分钟的电压爬升时间，施加30 kV电压，以进行代谢谱分析研究，初始电喷雾电离（ESI）电压设为0，开始采集质荷比65至1000范围内的质谱数据。在数据采集过程中，将ESI电压设为1000 V。随后以200 V为增量逐步提高ESI电压，直至背景信号在至少15分钟内保持恒定。将20微升预先配制的阴离子代谢物标准混合液转移至一个空的100微升微量小瓶中。将微量小瓶放入毛细管电泳（CE）样品瓶中，并将CE样品瓶置于进样样品盘中。启动先前建立的质谱采集负离子模式方法，随后使用控制CE仪器的软件启动CE序列。随后，用BGE溶液以50 psi压力冲洗分离毛细管3分钟，接着以2 psi压力进样60秒，再以1 psi压力进样10秒。在进样端施加30 kV电压，电压梯度时间为1分钟，同时施加0.5 psi压力，持续30分钟。在30分钟电泳分离结束后，停止质谱数据采集，并以5分钟的电压梯度时间将毛细管电泳电压降至1 kV。在每次进样之间，依次用去离子水、0.1 摩尔氢氧化钠、去离子水和 BGE 溶液在 30 psi 压力下冲洗分离毛细管，每种冲洗液冲洗 3 分钟。运行完成后，通过确定被分析阴离子代谢物混合物的迁移时间和信号强度来分析记录的数据。评估阴离子代谢物标准品是否出现在 10 至 28 分钟的时间区间内。然后，检查三种结构相关的同分异构体——D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸——是否实现了部分分离。本研究展示了无鞘流毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法在分析高极性阴离子代谢物方面的分离性能，以这三种结构相关的磷酸糖同分异构体为例。尽管这三种分析物未实现基线分离，但部分分离已足以通过质谱（MS）实现它们的选择性检测，因为这些分析物具有相同的精确质量。在分析生物样品时，使用这种无鞘液毛细管电泳-质谱（CE-MS）方法，定期利用学术标准物质检测分析性能随时间的变化至关重要。总体而言，无鞘液方法能够对超微量生物样品中的此类化合物进行谱型分析，从而为生物医学科学、生物分析化学及其他研究领域的这类样品分析开辟了大量可能性。观看本视频后，您应能充分理解如何通过无鞘液多孔接口将毛细管电泳与质谱联用，以实现对高极性和带电代谢物的谱型分析。

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无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术用于生物样本的代谢谱分析

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