识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

本实验的总体目标是鉴定能够破坏TRIP8b与HCN通道之间相互作用的小分子。该方法可识别出有望开发为抑郁症新疗法的候选分子。该技术的主要优势在于能够以高通量的方式完成。

该技术对重度抑郁症的新型疗法开发具有重要意义，因为本实验室已证实，阻断TRIP8b与HCN的结合可能具有治疗潜力。尽管该方法最初是针对抑郁症而开发的，但破坏TRIP8b与HCN之间的相互作用在其他疾病（如慢性疼痛）中也可能具有治疗价值。本方案的可视化演示至关重要，因为它展示了在西北大学高通量分析实验室等开放性设施中，利用自动化高通量仪器推动基础与转化研究的优势。

根据实验方案，在纯化TRIP8b 241-602蛋白片段并检测其与阳性对照的蛋白-蛋白相互作用之前，先将TRIP8b和HCN1-FITC的分装样品解冻，并置于冰上保存。使用FP缓冲液配制20毫升含2 µM TRIP8b和50 nM HCN1-FITC的溶液。随后，将25 µL该混合液加入低吸附384孔黑色微孔板的每个孔中。

进行文库筛选时，使用声波液体处理仪将每种化合物以100纳升的体积加入第3至22列的每个孔中，终浓度为40微摩尔。将100纳升的DMSO加入第1列和第23列的每个孔中作为阴性对照。将100纳升未标记的HCN1肽加入第2列和第24列的每个孔中作为阳性对照，终浓度为10微摩尔。

将培养板在室温下孵育两小时。使用酶标仪测定荧光偏振。或者，培养板可在读数前于 4 摄氏度保存 16 小时。

使用以下公式计算抑制率，其中 XN 是对应于信号 X 的归一化抑制百分比，X positive 是阳性对照孔的平均信号，X negative 是阴性对照孔的平均信号。对于抑制率超过 50% 的候选化合物，配制 20 毫升含有 2 微摩尔 TRIP8b 和 50 纳摩尔 HCN1 TAMRA 的 FP 缓冲液主混合液。将 25 微升主混合液加入黑色 384 孔微孔板的每个孔中。

然后，从含有各活性化合物两倍系列稀释液的孔板中，向相应的孔中加入 100 纳升化合物。对于阴性对照孔，加入 100 纳升 DMSO。对于阳性对照，加入 100 纳升系列稀释的未标记 HCN1 肽段，其终浓度范围为 200 微摩尔至 0.1 微摩尔。

将平板在室温下孵育两小时，或在 4 摄氏度下孵育 16 小时。使用酶标仪测量荧光偏振。通过采用四参数非线性回归模型拟合每种化合物的浓度依赖性荧光偏振数据，计算 IC50 值。

将一份带 HIS 标签的 TRIP8b 和一份带 GST 标签的 HCN1 融合蛋白解冻，并置于冰上保存。为每种待测化合物在检测缓冲液中分别准备 1 毫升浓度为 200 纳摩尔的 HIS-TRIP8b 和 20 纳摩尔的 GST-HCN1C40。使用 16 通道移液器将 7 微升 HIS-TRIP8b 与 GST-HCN1C40 的混合液加入 A 至 N 行中每行的三个孔中，以对每种化合物进行三复孔检测。

短暂离心微孔板，确保液体位于每个孔的底部，并去除任何气泡。接下来，将待测试的命中化合物加入微孔板中，使A行终浓度为200微摩尔，L行终浓度为0.1微摩尔。向M行加入等体积的DMSO。然后向N行加入未标记的HCN1肽，使其终浓度为10微摩尔。振荡微孔板2分钟，并在室温下孵育2.5小时。使用检测缓冲液将Anti-GST受体珠按1:50稀释。

使用16通道移液器，向板的每个孔中加入3.5 µL稀释后的受体珠，并通过轻柔吹打混匀以避免产生气泡。将板在避光条件下室温孵育1小时。用检测缓冲液将镍螯合供体珠按1:50比例稀释，同时避免暴露于光照下。

向板的每个孔中加入 3.5 µL 稀释后的供体珠，轻轻混匀，避免产生气泡。密封反应板，在室温避光条件下孵育 1.5 小时。然后使用酶标仪，按照此处列出的检测参数读取数据。

最后，使用四参数非线性回归模型拟合每种化合物的数据，计算其IC50值。为评估与HCN1 TAMRA的相互作用，将TRIP8b滴加至固定浓度的HCN1 TAMRA中。该图显示，随着TRIP8b浓度的增加，结合的HCN1 TAMRA分子增多，偏振值也随之升高。

在本实验中，随着未标记的HCN1被滴定到固定浓度的TRIP8b和HCN1 TAMRA中，标记的肽被置换，信号随之降低。高通量筛选结果显示在图中，每个化合物的抑制百分比以单个数据点表示。该筛选结果以阳性和阴性对照以及每个化合物在两次重复实验中的平均抑制百分比进行绘图。

在本实验中，对抑制率超过 50% 的化合物进行验证。X 和 Y 坐标由两次实验运行中的抑制百分比确定。本实验中，HCN1C40 含有一个末端 GST 标签，可结合受体珠。

TRIP8b 的 TPR 结构域与 HCN1 的 C 末端三肽之间的相互作用通过 680 纳米波长的光激发供体微珠，产生单线态氧。最后，如本图所示，将命中化合物 NUCC-5953 以逐渐增加的浓度滴定到固定浓度的 TRIP8b 和 HCN1C40 中，增强了对 TRIP8b 与 HCN1 相互作用的抑制。在开始高通量筛选之前，需验证蛋白质制备的质量以及基于微珠邻近检测中的荧光偏振信号。

确保蛋白质具有高纯度。将蛋白质分装保存，以避免多次冻融循环。务必使用高质量的试剂，包括新鲜的DMSO和Triton。

请注意，使用DMSO可能存在危险，因此在进行本实验操作时，必须始终采取适当的预防措施，例如佩戴合适的个人防护装备。完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法（如电生理学和流式细胞术）来检测筛选出的化合物是否在细胞中具有活性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用基于荧光偏振的检测方法进行高通量筛选。