方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

该程序的总体目标是识别能够破坏 TRIP8b 和 HCN 通道之间相互作用的小分子。这种方法确定了可以开发成抑郁症新疗法的候选分子。这种技术的主要优点是它可以以高通量方式完成。

这项技术对重度抑郁症新疗法的开发具有意义，因为我们的实验室已经表明，破坏 TRIP8b 与 HCN 的结合可能具有治疗益处。尽管这种方法是在考虑到抑郁症的情况下开发的，但破坏 TRIP8b 和 HCN 之间的相互作用可能对其他疾病（如慢性疼痛）具有治疗益处。该方案的可视化演示非常重要，因为它说明了使用自动化高通量仪器在西北大学高通量分析实验室等开放设施中推进基础和转化研究的好处。

纯化 TRIP8b 241-602 蛋白片段并检查蛋白质蛋白质与阳性对照的相互作用后，根据文本方案解冻 TRIP8b 和 HCN1-FITC 的等分试样并将它们保存在冰上。使用 FP 缓冲液制备 20 毫升 2 微摩尔 TRIP8b 和 50 纳摩尔 HCN1-FITC。然后将 25 μL 混合物分配到低结合力 384 孔黑色微量滴定板的每个孔中。

对于文库筛选，使用声波液体处理器将 100 纳升化合物分配到第 3 至 22 列的每个孔中，最终浓度为 40 μmol。将 100 纳升 DMSO 分配到第 1 列和第 23 列的每个孔中作为阴性对照。将 100 纳升未标记的 HCN1 肽分配到第 2 列和第 24 列的每个孔中作为阳性对照，终浓度为 10 微摩尔。

将板在室温下孵育 2 小时。使用读板器测量荧光偏振。或者，板可以在 4 摄氏度下存放 16 小时后再读取。

使用以下公式计算抑制百分比，其中 XN 是对应于信号的标准化抑制百分比，X.X 阳性是来自阳性对照孔的平均信号，X 阴性是来自阴性对照孔的平均信号。为了验证抑制率超过 50% 的 Hits，在 FP 缓冲液中制备 20 毫升 2 微摩尔 TRIP8b 和 50 纳摩尔 HCN1 TAMRA 的预混液。将 25 μL 预混液分配到黑色 384 孔微量滴定板的每个孔中。

然后从含有每种活性化合物的两倍连续稀释液的板中加入 100 纳升化合物到相应的孔中。对于阴性对照孔，加入 100 纳升 DMSO。对于阳性对照，加入 100 纳升连续稀释的未标记 HCN1 肽，终浓度范围为 200 μmol 至 0.1 μmol。

将板在室温下孵育 2 小时，或在 4 摄氏度下孵育 16 小时。使用读板器测量荧光偏振。通过使用 4 参数非线性回归模型拟合每种化合物的浓度依赖性 FP 数据来计算 IC 50 值。

解冻 HIS 标记的 TRIP8b 和 GST 标记的 HCN1 融合蛋白各一份，并将它们保存在冰上。在测定缓冲液中为每种待测化合物准备 1 毫升 200 纳摩尔 HIS TRIP8b 和 20 纳摩尔 GST-HCN1C40。使用 16 通道移液器将 7 微升 HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 混合物添加到每行 A 到 N 行的三个孔中，以一式三份测试每种化合物。

短暂离心板以确保液体位于每个孔的底部，并去除任何气泡。接下来，将待测化合物分配到板中，在 A 行达到 200 μmol 的最终浓度，并在 L 行中以 0.1 μmol 结束。将相同体积的 DMSO 添加到第 M 行中，然后将未标记的 HCN1 肽分配到 N 行中，最终浓度为 10 μmol。摇动板 2 分钟，并在室温下孵育 2.5 小时。使用检测缓冲液稀释抗 GST 受体微珠 1 至 50。

使用 16 通道移液器，将 3.5 微升稀释的受体珠添加到板的每个孔中，然后轻轻移液混合，以避免产生气泡。将板在室温下避光孵育 1 小时。用检测缓冲液将镍螯合供体珠子稀释 1 至 50，同时不要将混合物暴露在光线下。

将 3.5 微升稀释的供体珠子添加到板的每个孔中，轻轻混合，避免气泡。密封板并在室温下避光孵育 1.5 小时。然后使用读板器读取带有此处列出的测量参数的板。

最后，通过使用 4 参数非线性回归模型拟合每种化合物的数据来计算 IC 50 值。为了评估与 HCN1 TAMRA 的相互作用，将 TRIP8b 滴定为固定浓度的 HCN1 TAMRA。该图显示，随着 TRIP8b 浓度的增加，更多的 HCN1 TAMRA 分子被结合并且极化增加。

在本实验中，将未标记的 HCN1 滴定成固定浓度的 TRIP8b 和 HCN1 TAMRA，标记的肽被置换，信号减弱。高通量筛选显示每种化合物的抑制百分比，由图表上的单点表示。该筛选的结果与阳性和阴性对照一起绘制，每种化合物在两次检测运行中的平均抑制百分比。

然后在本实验中验证显示大于 50% 抑制的化合物。X 和 Y 坐标由两次试验中的抑制百分比确定。在本实验中，HCN1C40 包含一个结合受体珠的末端 GST 标签。

TRIP8b 的 TPR 结构域和 HCN1 的 C 末端三肽的相互作用用 680 纳米波长的光激发供体珠以产生单线态氧。最后，如图所示，将浓度递增的命中化合物 NUCC-5953 滴定为固定浓度的 TRIP8b 和 HCN1C40增加了对 TRIP8b HCN1 相互作用的抑制。在开始高通量筛选之前，在基于微珠的邻近检测中验证蛋白质制备和荧光偏振。

确保蛋白质纯度高。分装蛋白质以避免多次冻融循环。使用高质量的试剂很重要，包括新鲜的 DMSO 和 Triton。

不要忘记使用 DMSO 可能很危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备。按照此程序，可以执行其他方法，如电生理学和流式细胞术，以确定命中化合物在细胞中是否具有活性。观看此视频后，您应该对如何使用基于荧光偏振的分析进行高通量筛选有很好的了解。