Name: 方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解基于荧光偏振的高通量筛选方法，用于识别破坏TRIP8b与HCN1通道相互作用的小分子抑制剂。该技术为开发抑郁症和慢性疼痛的新疗法提供了重要工具。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助 R21MH104471 和 R01MH106511（D.M.C.）、脑科学研究基金会 SG 2012-01（D.M.C.）、西北大学临床与转化科学研究所 8UL1TR000150（Y.H.）、芝加哥生物医学联盟 HTS-004（Y.H. 和 D.M.C.）以及美国国立卫生研究院资助 2T32MH067564（K.L.）的支持。本研究的部分工作由西北大学药物与合成化学核心实验室（ChemCore）在分子创新与药物发现中心（CMIDD）完成，该中心由芝加哥生物医学联盟资助，并获得芝加哥社区信托基金的 Searle 基金以及美国国家癌症研究所授予的癌症中心支持基金 P30 CA060553（授予罗伯特·H·卢里综合癌症中心）的支持。高通量筛选工作在高通量分析实验室完成，该实验室也是罗伯特·H·卢里综合癌症中心的核心设施之一。

1. TRIP8b (241-602) 蛋白的纯化
<ol>
	<li>根据制造商说明，将含有TRIP8b（241-602）的质粒转入表达载体pGS213中，并转化至感受态E. coli细胞以进行蛋白表达。取300 µl菌液涂布于含5 µg/ml氯霉素和氨苄青霉素的Luria Broth（LB）琼脂平板上，37 °C培养16小时。</li>
	<li>次日，挑取单菌落接种于50 ml含50 µg/ml氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养16小时。</li>
	<li>将50 ml种子培养物加入1 L含50 µg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养。</li>
	<li>当菌液OD600值达到0.8–1.2时，将培养温度调至18 °C，并加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度1 mM，继续诱导蛋白表达16小时。</li>
	<li>在4 °C条件下以6,000 × g离心15分钟收集E. coli菌体。离心结束后立即将离心管置于冰上，后续操作均需保持低温&#160;。用36 ml Buffer A缓冲液（含0.25 mM苯甲基磺酰氟PMSF）重悬菌体沉淀。</li>
	<li>将重悬的菌液置于冰上，使用平头探头进行超声破碎，总时长5–10分钟，高功率下交替进行30秒“开启”与30秒“关闭”。</li>
	<li>在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。若上清液仍不澄清，需&#160;再离心15分钟。</li>
	<li>将上清液上样至2 ml Ni-NTA亲和层析柱，4 °C轻柔振荡孵育60分钟。</li>
	<li>让未结合物质流穿层析柱，并用500 ml Buffer A缓冲液洗涤。</li>
	<li>用250 ml Buffer B缓冲液洗涤层析柱。</li>
	<li>用125 ml含5 mM咪唑的Buffer A缓冲液洗涤层析柱。</li>
	<li>用20 ml洗脱缓冲液（Elution Buffer）从层析柱中洗脱目标蛋白。</li>
	<li>使用注射器将洗脱所得蛋白样品加入透析盒（分子量截留值–10 kDa）中，在4 °C条件下用4 L冷磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）透析60分钟。</li>
	<li>将透析盒转移至另一份4 L新鲜冷PBS中，继续在4 oC透析16小时。</li>
	<li>次日早晨，按照制造商说明使用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。若蛋白浓度低于40 μM，根据说明书使用蛋白浓缩装置进行浓缩。分装后于-80 °C保存。</li>
</ol>
2. 小规模荧光偏振分析法表征两个蛋白质片段的相互作用
<ol>
	<li>解冻200 μl的40 μM TRIP8b (241-602)，并将其加入一个1.5 ml离心管中。向另外11个1.5 ml离心管中各加入100 μl PBS。</li>
	<li>通过将100 μl TRIP8b (241-602)从原始管转移至系列中的下一个管，吹打混匀，并重复此过程进行连续稀释。这将产生一个包含12个浓度点的2倍系列稀释液，TRIP8b (241-602)浓度范围为0.01–40 μM。</li>
	<li>配制650 μl主混合液，其中包含0.1 μM HCN1FITC （取10 μM储备液6.5 μl）和2 mM二硫苏糖醇（DTT），溶剂为PBS。 
	注意：该主混合液为2倍浓度。</li>
	<li>准备12个新的1.5 ml离心管。向每管中加入50 μl含HCN1FITC 的主混合液，然后分别加入12个连续稀释液中的各50 μl。 
	注意：这将得到12个反应管，&#160;每管最终含有0.05 μM HCN1FITC，以及原始连续稀释液中TRIP8b (241-602)浓度的一半。</li>
	<li>将稀释系列以每孔30 μl的体积加入检测板中，每个样品设三个重复孔。使用低吸附、实底黑色384孔板。</li>
	<li>在室温下以900 × g离心2分钟。</li>
	<li>按照仪器制造商的操作说明，使用酶标仪读取数据。采用以下参数测量荧光偏振值：激发波长485 nm，发射波长530 nm，二向色镜505 nm，积分时间100毫秒。</li>
	<li>以TRIP8b (241-602)浓度的对数为横坐标，荧光偏振值（mP）为纵坐标作图。使用Hill方程拟合数据，计算TRIP8b (241-602)与标记的HCN1肽段之间的亲和力（Kd）。 
	&#8203;注意：在进行连续稀释时，也可使用多孔板代替离心管。</li>
</ol>
3. 使用阳性对照检测蛋白质-蛋白质相互作用
<ol>
	<li>取200 μl未标记的HCN1肽（200 μM）加入一个1.5 ml离心管中。向另外11个1.5 ml离心管中各加入100 μl PBS。通过将含有200 μl肽的管中取出100 μl转移至第一个含100 μl PBS的管中进行连续稀释。重复此操作，制备出12个含有2倍系列稀释的未标记HCN1肽的离心管。</li>
	<li>配制650 μl的预混液，其中含0.2 μM HCN1FITC 和4 μM TRIP8b(241-602)。 
	注意：此为2倍浓度溶液。</li>
	<li>向12个新的1.5 ml离心管中各加入50 μl预混液。</li>
	<li>将每种系列稀释液各取50 μl加入至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>将黑色384孔微孔板设置三个重复孔，每孔加入30 μl反应液。</li>
	<li>在室温下以900 × g离心2分钟。</li>
	<li>使用具备荧光偏振（FP）检测功能的酶标仪读板。检测参数设置同步骤2.7所述。</li>
	<li>利用Cheng-Prusoff方程计算未标记肽与TRIP8b(241-602)的亲和力：Kd1 = IC50 / (1 + [L]/Kd2)，其中Kd1 表示未标记肽与TRIP8b(241-602)的亲和力，IC50 由前一步骤测定，代表未标记配体置换标记配体的能力，[L]为步骤3.2中标记配体的浓度，Kd2 为TRIP8b(241-602)与标记配体的亲和力。</li>
</ol>
4. 评估检测性能（计算Z因子）
<ol>
	<li>通过配制含有2 μM TRIP8b (241-602)、50 nM HCN1FITC 和1 mM DTT的FP缓冲液，制备12 ml的主混合液。 
	注意：此步骤需要60 μl的40 μM TRIP8b (241-602)、60 μl的10 μM HCN1FITC 以及1,080 μl的FP缓冲液。</li>
	<li>向黑色384孔微孔板的每孔中加入30 μl主混合液。</li>
	<li>向192个孔中各加入1 μl的1 mM未标记HCN1肽，作为阳性对照。</li>
	<li>向另外192个孔中各加入1 μl FP缓冲液，作为阴性对照。</li>
	<li>在室温下以900 × g离心2分钟。</li>
	<li>使用微孔板读板仪读取数据。</li>
	<li>使用以下公式计算实验的Z因子：Z = 1 - 3*(σpos-σneg)/(μneg-μpos)，其中σpos和σneg分别为阳性对照孔和阴性对照孔的标准差，μpos和μneg分别代表阳性对照孔和阴性对照孔的平均信号值。</li>
</ol>
5. 高通量筛选
<ol>
	<li>将TRIP8b (241-602) 和 HCN1FITC 的分装样品解冻，并置于冰上保存。</li>
	<li>在FP缓冲液中配制10 ml的TRIP8b（2 μM）和HCN1FITC（50 nM）混合溶液。</li>
	<li>使用移液器将25 μl该混合液加入低吸附性黑色384孔微孔板的每个孔中。</li>
	<li>进行文库筛选时，使用声波液体处理系统将化合物加入每块板的第3至第22列各孔中（每种化合物终浓度为40 µM）。 
	注意：由于该检测方法的阳性率相对较低，因此将两种不同的化合物混合加入同一个孔中。后续对每个活性孔中的两种化合物分别进行单独测试，以确定产生活性的化合物。</li>
	<li>向每块板的第1列和第23列各孔中加入100 nl二甲基亚砜（DMSO），作为阴性对照。</li>
	<li>向每块板的第2列和第24列各孔中加入未标记的HCN1肽，作为阳性对照。</li>
	<li>在室温下孵育2小时。孵育后立即读板，或在4 °C下继续孵育16小时后再读板。</li>
	<li>使用酶标仪测定荧光偏振值。检测参数设置与步骤2.7中所述相同。</li>
	<li>使用每块板的阳性和阴性对照平均值作为100%，对信号进行归一化处理，计算抑制率。使用公式 XN =100% * ((Xneg - X)/(Xneg – Xpos))，其中XN为对应信号X的归一化抑制百分比，Xpos为阳性对照孔的平均信号值，Xneg为阴性对照孔的信号值。</li>
</ol>
6. 使用 TAMRA 标记的 HCN 肽验证命中结果
<ol>
	<li>使用 TAMRA 标记的 HCN1 肽（HCN1TAMRA）验证抑制率超过 50% 的候选化合物。
	<ol>
		<li>在 FP 缓冲液中配制 12 ml 主混合液，其中含 2 μM TRIP8b (241-602) 和 50 nM HCN1TAMRA。</li>
		<li>将 25 μl 主混合液加入黑色 384 孔微孔板的每个孔中。</li>
		<li>将各活性化合物的系列稀释液转移至相应孔中。进行两倍系列稀释，使每个候选化合物的浓度范围为 0.2 µM 至 200 µM。</li>
		<li>对于阴性对照反应，向每孔加入 100 nl DMSO；对于阳性对照，向每孔加入 100 nl 未标记 HCN1 肽的系列稀释液，终浓度范围为 200 µM 至 0.1 µM。</li>
		<li>在室温下孵育 2 小时。孵育结束后立即读板，或在 4 °C 下继续孵育 16 小时后再读板&#160;。</li>
		<li>使用以下检测参数测量荧光偏振值（mP）：激发波长 535 nm；发射波长 580 nm；二向色镜 535 nm；积分时间 20 毫秒。</li>
		<li>采用四参数非线性回归模型23拟合每种化合物的浓度依赖性荧光偏振数据，计算其 IC50 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 基于微珠的邻近检测法的剂量-反应验证
<ol>
	<li>解冻一份带有 His 标签的 TRIP8b（241-602）（His-TRIP8b）和带有 GST 标签的 HCN1（GST-HCN1）C40融合蛋白置于冰上保存。</li>
	<li>将His-TRIP8b与GST-HCN1混合C40 在含有400 nM His-TRIP8b和40 nM GST-HCN1的测定缓冲液中C40为每种待测化合物准备 300 µl 的混合液。 
	注意：化合物在11个不同浓度下均设三个重复，并设DMSO对照组（不含化合物）。</li>
	<li>对照孔中，用检测缓冲液分别制备不含 GST-HCN1C40 的 30 µl His-TRIP8b（200 nM）溶液，以及不含 His-TRIP8b 的 30 µl GST-HCN1C40（20 nM）溶液。</li>
	<li>对于每种待测化合物，加入 7 μl 的 His-TRIP8b:GST-HCN1C40 将步骤7.2中制备的混合液使用16通道移液器加入至96孔板的36个孔中。若检测单一化合物，将12个不同浓度设置在A至L行，三个重复设置在1至3列。向第M行的1–3列各加入7 µl His-TRIP8b溶液（按步骤7.3制备），并向第M行的4–6列各加入7 µl GST-HCN1C40 将7.3步骤中配制的溶液加入第N行第1至第3列的孔中。短暂离心板以确保液体位于各孔底部，并去除任何气泡。</li>
	<li>将待测的命中化合物分配至孔板中，使每种化合物的浓度从第A行的200 µM逐步稀释至第K行的0.1 µM。在第L至N行加入与第A至K行化合物溶液等体积的DMSO。</li>
	<li>振荡培养板2分钟，孵育2.5小时&#160;室温下</li>
	<li>用检测缓冲液将抗GST受体珠按1:50稀释。</li>
	<li>使用16通道移液器将3.5 µl稀释后的受体珠加入板的每孔中，通过轻柔吹打混匀以避免产生气泡。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育平板1小时。</li>
	<li>用检测缓冲液将镍螯合供体珠按1:50稀释。避免将混合物暴露于光线下。</li>
	<li>使用16通道移液器将3.5 µl稀释后的供体珠加入到板的每孔中，并通过轻柔吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育平板1.5小时。</li>
	<li>使用酶标仪读数。采用以下检测参数：激发时间40毫秒，发射时间100毫秒，检测高度0.1毫米。</li>
	<li>计算IC50 使用四参数非线性回归模型拟合每种化合物的数据以获得数值23.</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

由于HCN通道在重度抑郁症（MDD）中具有作为治疗靶点的潜力24，针对中枢神经系统中HCN通道功能的拮抗性药物研究引起了广泛关注4。然而，由于HCN通道在心脏起搏中的重要作用以及引发心律失常的风险，相关研究进展受到阻碍25。我们推测，破坏HCN通道与其脑特异性辅助亚基TRIP8b之间的相互作用8，可能足以产生类似抗抑郁的效果，同时不影响心脏中的HCN通道功能3。这一假说得到了以下观察结果的支持：缺乏TRIP8b的小鼠表现出类似抗抑郁的行为7。因此，靶向该相互作用可能成为治疗MDD的一种新范式。
上述内容详细介绍了鉴定TRIP8b的TPR结构域与HCN1的C端三肽之间相互作用的小分子抑制剂的实验方案。为了促进该方法的广泛应用，本文进一步阐述了我们开发此检测方法背后的科学依据。尽管TRIP8b在两个位点与HCN亚基结合，我们的研究重点集中在TRIP8b的TPR结构域与HCN的C端尾部之间的相互作用。通过X射线晶体学对该相互作用的结构解析发现，TRIP8b的...

超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在心脏和中枢神经系统中表达，在调节膜兴奋性方面发挥重要作用1。研究表明HCN通道参与重度抑郁症（MDD）的发病机制2，因此多个研究团队提出，通过药物手段限制HCN通道功能可能成为治疗MDD的一种新策略3。然而，由于HCN通道在心脏动作电位中具有重要功能，直接靶向HCN通道并不可行4。伊伐布雷定是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的HCN通道拮抗剂，用于治疗心力衰竭，通过产生减慢心率的作用发挥疗效5。因此，亟需开发能够选择性在中枢神经系统中抑制HCN通道功能的药理学试剂。
含四肽重复序列的Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b）是HCN通道的一种脑特异性辅助亚基，可调控HCN通道的表面表达与定位6,7。TRIP8b基因敲除会导致脑内HCN通道减少7，但不影响心脏中HCN的表达8。有趣的是，TRIP8b基因敲除小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中静止时间更短7，而这两种实验是常用于评估抗抑郁药效的筛选方法9-11。这些结果提示，与其直接使用小分子拮抗剂靶向HCN通道功能，不如干扰TRIP8b与HCN之间的相互作用，可能就足以产生类似抗抑郁的行为效应。
TRIP8b 在两个不同的结合位点与 HCN 结合。HCN 的环核苷酸结合结构域（CNBD）与 TRIP8b 中位于其 TPR 结构域上游的一个保守结构域相互作用12,13。尽管参与该相互作用的 CNBD 残基已被定位14，但 TRIP8b 上参与该作用的区域尚未进一步缩小，仅确定位于一段 80 个氨基酸的片段内13。第二个相互作用发生在 TRIP8b 的四肽重复结构域（TPR）与 HCN 的 C 末端三肽之间（在 HCN1、HCN2 和 HCN4 中为“SNL”，而在 HCN3 中为“ANM”）3,12。最近解析的该 C 末端相互作用的晶体结构15显示，其结构与过氧化物酶体输入受体 PEX5（peroxin 5）与其含有 1 型过氧化物酶体靶向信号（PTS1）的相互作用蛋白之间的结合具有显著的结构相似性16。
尽管HCN通道功能需要两个相互作用位点，但TRIP8b的TPR结构域与HCN1的C端三肽之间的相互作用是主要的结合位点，并调控HCN在细胞表面的表达。因此，本研究选择该相互作用位点作为靶向位点。在本文后续部分中，凡提及TRIP8b与HCN之间的相互作用，均指这一特定相互作用。该相互作用可通过TRIP8b的一个高度可溶性片段重现，该片段对应于其保守的C端&#160;，包含与HCN的C端尾部结合所必需的TPR结构域（TRIP8b的1a-4亚型中第241-602位残基）3。
为了建立一种高通量筛选方法以鉴定能够破坏该相互作用的小分子，采用了一种基于荧光偏振（FP）的检测技术17。荧光偏振的原理是利用偏振光激发带有荧光标记的配体，并测量所发射荧光的偏振程度18。当存在结合伴侣时，荧光配体的旋转运动受到限制，从而发射出偏振光19；而在缺乏结合伴侣的情况下，配体的自由旋转导致去偏振光的发射。
在本方案中，介绍了使用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）树脂纯化N端带标签（6xHis）的TRIP8b（241-602）蛋白的方法。类似的方法也被用于纯化在步骤7中使用的带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的HCN1蛋白C端40个氨基酸（HCN1c40）。由于篇幅限制，该过程的详细描述已被省略。
在方案的第2至第7步中，展示了一种高通量筛选工作流程（见图1）。蛋白质-蛋白质相互作用是高通量筛选中众所周知的难点，建议读者查阅有关该主题的更多参考资料20。
步骤2和步骤3用于表征该程序的 体外 纯化的TRIP8b（241-602）构建体与荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的、对应于HCN1 C末端尾部的十一氨基酸肽段（HCN1FITC）。根据TRIP8b-HCN复合物的晶体结构15，该十一氨基酸片段足以与TRIP8b（241-602）结合。在步骤2中，Kd 通过将TRIP8b（241-602）滴定至固定浓度的HCN1中，测量二者相互作用的程度FITC在第3步中，将未标记的HCN肽（在第2步中使用）滴定至固定浓度的TRIP8b（241-602）和HCN1中FITC 以检测FITC标记是否干扰结合。这些实验对于选择合适的TRIP8b (241-602)和HCN1浓度至关重要FITC 用于高通量筛选。
高通量筛选的基本原理是：能够破坏TRIP8b（241-602）与HCN1FITC之间相互作用的小分子将导致偏振光信号降低。在步骤4中，针对特定浓度的TRIP8b（241-602）和HCN1FITC计算该检测方法的Z因子21，以确保其适用于高通量筛选（步骤5）。步骤6和步骤7为验证性检测，用于确认在初筛中发现的阳性化合物确实是通过破坏TRIP8b（241-602）与HCN1FITC之间的相互作用而起效，而非通过非特异性机制。在步骤6中，&#160;使用羧基四甲基罗丹明（TAMRA）标记的HCN1肽段（HCN1TAMRA）进行一个完全相同的荧光偏振检测，以排除那些干扰FITC标记FP检测的荧光化合物。步骤7则采用一个更大的HCN1 C端片段（HCN1C40），并使用基于微珠的邻近检测法，该方法依赖于相互作用蛋白将供体微珠与受体微珠拉近后，单线态氧从供体微珠“隧穿”至受体微珠的原理22。

<table><tbody><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>透析盒&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>66456</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502 - 1 gr</td><td></td></tr><tr><td>384孔黑色板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3820</td><td></td></tr><tr><td>Proxiplate&amp;nbsp;</td><td>Perkin-Elmer&amp;nbsp;</td><td>6008289</td><td></td></tr><tr><td>抗GST受体珠&amp;nbsp;</td><td>Perkin-Elmer&amp;nbsp;</td><td>6760603C</td><td></td></tr><tr><td>NiChelate</td><td>Perkin-Elmer&amp;nbsp;</td><td>AS101D</td><td></td></tr><tr><td>pGS21-a</td><td>Genscript</td><td>SD0121</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质浓缩器</td><td>ThermoFisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Enspire 多功能酶标仪</td><td>Perkin-Elmer&amp;nbsp;</td><td>#2300-001M</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 感受态细胞</td><td>Agilent</td><td>200131</td><td></td></tr></tbody></table>

识别hcn1与trip8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在脑内广泛表达，其功能是调节神经元的兴奋性。在海马CA1区锥体神经元中，这些通道的亚细胞分布受到含四肽重复序列的Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b）的调控，TRIP8b是一种辅助亚基。遗传学敲除HCN通道孔形成亚基或TRIP8b均会导致抗抑郁样行为增加，提示限制HCN通道功能可能对治疗重度抑郁症（MDD）具有潜在疗效。尽管HCN通道具有重要的治疗价值，但它们也在心脏中表达，并参与节律调节。为避免阻断心脏HCN通道带来的脱靶效应，本实验室近期提出可通过靶向HCN与TRIP8b之间的蛋白-蛋白相互作用，特异性地干扰HCN通道在脑内的功能。TRIP8b通过两个不同的结合位点与HCN孔形成亚基结合，本文重点关注TRIP8b的四肽重复序列（TPR）结构域与HCN1 C末端尾部之间的相互作用。本实验方案详细描述了一种纯化TRIP8b蛋白并开展高通量筛选以鉴定HCN与TRIP8b相互作用小分子抑制剂的方法。该高通量筛选方法基于荧光偏振（FP）检测技术，用于监测一个较大的TRIP8b片段与一段标记荧光基团的十一氨基酸肽（对应于HCN1 C末端尾部）之间的结合情况。该方法通过检测发射光偏振值的变化来识别“命中”化合物。随后进行验证实验，以确保这些“命中”化合物并非假阳性结果。

为避免与我们之前发表的文章产生版权问题，使用了 TAMRA 标记的探针 HCN1TAMRA 生成图 2和图 3。需要注意的是，这种替换对实验结果没有明显影响，且实验方案与上述使用 HCN1FITC 的方案完全相同。为评估与 HCN1TAMRA 的相互作用，按照步骤 2 中所述方案，将 TRIP8b (241-602) 逐步滴加至固定浓度的 HCN1TAMRA 中（图 2）。接着，进行步骤 3 中所述实验，将未标记的 HCN1 肽段逐步滴加至固定浓度的 TRIP8b (241-602) 和 HCN1TAMRA 混合物中（图 3）。
为验证该检测方法是否适用于高通量筛选，随后按照步骤4中的方案对其性能进行了考察，得...

HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在脑内广泛表达，其功能是调控……

本实验的总体目标是鉴定能够破坏TRIP8b与HCN通道之间相互作用的小分子。该方法所鉴定出的候选分子有望被开发为治疗抑郁症的新疗法。该技术的主要优势在于能够以高通量的方式完成筛选。该技术对开发治疗重度抑郁症的新疗法具有重要意义，因为本实验室已证实，阻断TRIP8b与HCN的结合可能具有治疗作用。尽管该方法最初是针对抑郁症而开发的，但阻断TRIP8b与HCN之间的相互作用在其他疾病（如慢性疼痛）中也可能具有治疗价值。本方案的可视化演示至关重要，因为它展示了在西北大学高通量分析实验室等开放设施中，利用自动化高通量仪器推动基础与转化研究的优势。在纯化TRIP8b 241-602蛋白片段并根据文本方案检测蛋白-蛋白相互作用的阳性对照后，将TRIP8b和HCN1-FITC的分装样品解冻，并置于冰上保存。使用FP缓冲液配制20毫升含2 µM TRIP8b和50 nM HCN1-FITC的溶液。然后将25 µL该混合液分装至低吸附黑色384孔微孔板的每个孔中。进行文库筛选时，使用声波液体处理仪将每种化合物各100纳升加入第3至22列的每孔中，使终浓度为40微摩尔。将100纳升DMSO加入第1列和第23列的每孔中作为阴性对照。将100纳升未标记的HCN1肽加入第2列和第24列的每孔中作为阳性对照，终浓度为10微摩尔。将培养板在室温下孵育两小时。使用酶标仪测量荧光偏振。或者，在读数前可将培养板在 4 摄氏度保存 16 小时。使用以下公式计算抑制率，其中 XN 是对应于信号 X 的归一化抑制百分比，X positive 是阳性对照孔的平均信号值，X negative 是阴性对照孔的平均信号值。对于抑制率超过 50% 的候选化合物，配制 20 毫升含有 2 微摩尔 TRIP8b 和 50 纳摩尔 HCN1 TAMRA 的 FP 缓冲液主混合液。将 25 微升主混合液加入黑色 384 孔微孔板的每个孔中。然后，从含有各活性化合物两倍系列稀释液的孔板中，向相应的孔中加入 100 纳升化合物。对于阴性对照孔，加入 100 纳升 DMSO。对于阳性对照，加入 100 纳升系列稀释的未标记 HCN1 肽，其终浓度范围为 200 微摩尔至 0.1 微摩尔。将酶标板在室温下孵育两小时，或在 4 摄氏度下孵育 16 小时。使用酶标仪测定荧光偏振值。采用四参数非线性回归模型拟合每种化合物的浓度依赖性荧光偏振数据，计算 IC50 值。将一份带有 HIS 标签的 TRIP8b 和一份带有 GST 标签的 HCN1 融合蛋白解冻，并置于冰上保存。为每种待测化合物在检测缓冲液中分别准备 1 毫升浓度为 200 纳摩尔的 HIS-TRIP8b 和 20 纳摩尔的 GST-HCN1C40。使用 16 通道移液器将 7 微升 HIS-TRIP8b 与 GST-HCN1C40 的混合液加入 A 至 N 行中每行的三个孔中，以对每种化合物进行三复孔检测。短暂离心微孔板，确保液体位于每个孔的底部，并去除任何气泡。接下来，将待测试的命中化合物加入微孔板中，使A行终浓度为200微摩尔，至L行终浓度为0.1微摩尔。向M行加入等体积的DMSO。然后向N行加入未标记的HCN1肽，使其终浓度为10微摩尔。振荡微孔板2分钟，并在室温下孵育2.5小时。使用检测缓冲液将Anti-GST受体珠按1:50稀释。使用16通道移液器，向板的每个孔中加入3.5 µL稀释后的受体珠，并通过轻柔移液混匀以避免产生气泡。将板在避光条件下室温孵育1小时。用检测缓冲液将镍螯合供体珠按1:50比例稀释，同时避免暴露于光照下。向板的每个孔中加入3.5微升稀释后的供体珠，轻轻混匀，避免产生气泡。密封反应板，在室温避光条件下孵育1.5小时。随后使用酶标仪，按照此处列出的检测参数读板。最后，使用四参数非线性回归模型拟合每种化合物的数据，计算IC50值。为评估与HCN1 TAMRA的相互作用，将TRIP8b滴定至固定浓度的HCN1 TAMRA中。该图显示，随着TRIP8b浓度的增加，结合的HCN1 TAMRA分子增多，偏振值上升。在本实验中，随着未标记的HCN1被滴定到固定浓度的TRIP8b和HCN1 TAMRA中，标记的肽被置换，信号随之降低。高通量筛选结果显示在图中，每个化合物的抑制百分比以单个数据点表示。该筛选结果以阳性和阴性对照以及每个化合物在两次重复实验中的平均抑制百分比进行绘图。在本实验中，对抑制率超过 50% 的化合物进行验证。X 和 Y 坐标由两次实验运行中的抑制百分比确定。本实验中，HCN1C40 含有一个末端 GST 标签，可结合受体珠。TRIP8b 的 TPR 结构域与 HCN1 的 C 末端三肽之间的相互作用通过 680 纳米波长的光激发供体微珠，产生单线态氧。最后，如本图所示，将命中化合物 NUCC-5953 以递增浓度滴定至固定浓度的 TRIP8b 和 HCN1C40 中，增强了对 TRIP8b 与 HCN1 相互作用的抑制。在开始高通量筛选之前，需验证蛋白质制备以及基于微珠邻近检测中的荧光偏振信号。确保蛋白具有高纯度。将蛋白分装保存，以避免多次冻融循环。应使用高质量的试剂，包括新鲜的DMSO和Triton。请注意，使用DMSO可能存在危险，因此在进行本实验操作时，应始终采取适当的预防措施，例如佩戴合适的个人防护装备。完成本实验步骤后，可进一步采用电生理学和流式细胞术等方法，以确定筛选出的化合物是否在细胞中具有活性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用基于荧光偏振的检测方法进行高通量筛选。

method-for-identifying-small-molecule-inhibitors-protein-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

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使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

本实验采用分子对接结合细胞热迁移实验的方法，用于预测并验证小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。...

小分子化合物的靶蛋白预测与验证

了解基于荧光偏振的高通量筛选方法，用于识别破坏TRIP8b与HCN1通道相互作用的小分子抑制剂。该技术为开发抑郁症和慢性疼痛的新疗法提供了重要工具。

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

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