Name: 多峰成像和光谱学纤维束显微内窥镜纲要非侵入性，在体内组织分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学习多峰成像与光谱学纤维束显微内窥镜技术，用于非侵入性体内组织分析。该方法结合高分辨率荧光成像与漫反射光谱，可同时获取组织结构图像与血红蛋白、黑色素等生理参数，为癌症生物学研究提供功能表征工具。

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本材料基于美国国立卫生研究院（1R03-CA182052，1R15-CA202662）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（G.G.，DGE-1450079）、阿肯色生物科学研究所以及阿肯色大学博士学院奖学金的支持。本文中表达的观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定反映上述资助机构的官方立场。

本研究的所有方面均已获得阿肯色大学人类受试者研究项目机构审查委员会批准（IRB #15-09-149）。所述方法均按照批准的指南进行，并已从所有参与者处获得知情同意。
1. 高分辨率荧光显微内窥成像系统的组装
注意：高分辨率荧光显微内窥成像模态的组装步骤如图2所示。
<ol>
	<li>将一块470 nm二向色镜放入一个30 mm笼式立方体中。
	<ol>
		<li>取一个30 mm笼式立方体，并取下二向色滤光片支架。</li>
		<li>将一块470 nm二向色镜放入二向色滤光片支架中。</li>
		<li>将二向色滤光片支架重新插入并固定到笼式立方体内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将笼式组件杆连接到30 mm笼式立方体上。
	<ol>
		<li>将四根1.5英寸长的笼式组件杆固定在笼式立方体的前侧。</li>
		<li>将四根3.0英寸长的笼式组件杆固定在笼式立方体的右侧。</li>
		<li>将两根2.0英寸长的笼式组件杆以对角方式固定在笼式立方体的左侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建一个1.0英寸笼式板/透镜管组件。
	<ol>
		<li>取一个带螺纹的1.0英寸30 mm笼式板，并使用提供的螺纹将一个无应力固定环安装到笼式板内部。</li>
		<li>将一根1.0英寸透镜管旋入无应力固定环中。</li>
		<li>将第二个带螺纹的1.0英寸30 mm笼式板连接到1.0英寸透镜管上，并调整标准固定环，使两个笼式板齐平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1.0英寸笼式板/透镜管组件滑入30 mm笼式立方体的左侧。</li>
	<li>构建直角反射镜支架组件。
	<ol>
		<li>取一个直角反射镜支架和一块1.0英寸紫外增强型铝反射镜。</li>
		<li>将1.0英寸紫外增强型铝反射镜放入反射镜支架中并拧紧。</li>
		<li>将四根2.0英寸长的笼式组件杆固定在反射镜支架的前侧。</li>
		<li>将两根2.0英寸长的笼式组件杆以对角方式固定在笼式立方体的右侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将相对的笼式组件杆穿过30 mm笼式板上的相应开口，将直角反射镜支架组件连接到1.0英寸笼式板/透镜管组件的左侧。</li>
	<li>将一个z轴平移支架穿过组件右侧的3.0英寸笼式组件杆。</li>
	<li>将一个10X消色差物镜连接到z轴平移支架上。</li>
	<li>构建一个1.0英寸光纤适配板/xy轴平移透镜支架组件。
	<ol style="margin-left: 40px;">
		<li>取一个xy轴平移支架和一块1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>将1.0英寸光纤适配板牢固地安装到xy轴平移透镜支架中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1.0英寸光纤适配板/xy轴平移透镜支架组件滑动至物镜前方。</li>
	<li>准备两根长度为0.5英寸、直径为1.0英寸的透镜管，一块440/40 nm带通滤光片（激发滤光片）和一块525/36 nm带通滤光片（发射滤光片）。</li>
	<li>将每块滤光片分别放入一根0.5英寸长、1.0英寸直径的透镜管中，确保滤光片外侧的箭头指向透镜管带外螺纹的一侧。</li>
	<li>将滤光片安装到组件上。
	<ol>
		<li>取两个标准固定环。</li>
		<li>使用标准固定环将滤光片固定在0.5英寸长、1.0英寸直径的透镜管内。</li>
		<li>将装有激发滤光片的透镜管旋入30 mm笼式立方体的前端，将装有发射滤光片的透镜管旋入直角反射镜支架。</li>
		<li>将装有发射滤光片的0.5英寸透镜管旋入直角反射镜支架的前端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取两块带螺纹的1.0英寸30 mm笼式板，将其放置在含有滤光片的0.5英寸长、1.0英寸直径透镜管前方。</li>
	<li>使用环氧树脂或强力胶水，将一个455 nm LED固定在与激发滤光片相连的笼式板上。</li>
	<li>准备一根0.5英寸长、1.0英寸直径的透镜管，以及一个焦距为50 mm的1.0英寸消色差双胶合管镜。</li>
	<li>将管镜放入透镜管中，确保镜片外侧的箭头指向透镜管带外螺纹的一侧。</li>
	<li>将管镜旋入组件中。
	<ol>
		<li>取一个标准固定环。</li>
		<li>使用标准固定环将透镜固定在0.5英寸长、1.0英寸直径的透镜管内。</li>
		<li>将装有管镜的透镜管连接到最左侧的笼式板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在装有管镜的0.5英寸长、1.0英寸直径透镜管前方放置一块30 mm笼式板。</li>
	<li>将一个无应力固定环安装到30 mm笼式板内部。</li>
	<li>将一个USB单色相机连接到带有无应力固定环的笼式板上。</li>
	<li>构建光学支柱安装装置。
	<ol>
		<li>取四个0.5英寸支柱固定座、四根0.5英寸光学支柱和四个安装底座。</li>
		<li>将0.5英寸光学支柱牢固地插入0.5英寸支柱固定座中。</li>
		<li>将0.5英寸支柱固定座固定到安装底座上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将四个光学支柱安装装置分别旋入位于30 mm笼式立方体下方、直角反射镜支架下方、与LED相连的笼式板下方以及与相机相连的笼式板下方的螺孔中。</li>
	<li>将四个光学支柱安装装置旋入光学面包板或光学平台，完成高分辨率荧光显微内窥成像系统的构建。</li>
</ol>
<img alt="光学激发装置组装示意图，光子学组件排列，分步指南。" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：高分辨率荧光显微内窥成像系统的组装。 高分辨率荧光显微内窥成像系统可通过构建直径为1.0英寸的组件外壳实现，组装过程中需特别注意二向色镜、物镜、激发/发射滤光片以及管镜的安装。这些组件的玻璃表面必须使用镜头纸小心处理。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54564/54564fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 次扩散反射光谱模式的组装
注意：子漫反射光谱模式的组装步骤可在图3中查看。
<ol>
	<li>获取一个钨卤素光源，并使用环氧树脂或强力粘合剂将一个1.0英寸螺纹30 mm笼式安装板固定在光源前端。</li>
	<li>将四根3.0英寸的笼架组装杆固定到笼板上。</li>
	<li>将Z轴平移调节架连接到笼式系统杆上。</li>
	<li>将20倍消色差物镜旋入Z轴平移支架。</li>
	<li>构建光纤适配板/xy轴平移透镜安装组件。
	<ol>
		<li>获取一个xy轴平移架和一个1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>将光纤适配器板固定到xy轴平移透镜架上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1.0英寸光纤适配器/xy平移调节架组件滑动至物镜前方。</li>
	<li>组装电机臂组件。
	<ol>
		<li>获取定制的铝制电机臂和一个SMA光纤适配板。</li>
		<li>将光纤适配器板（带外螺纹）旋入铝制电机臂（带内螺纹）中。</li>
		<li>使用四个 #4-40 0.5 英寸螺丝将定制的铝制电机臂适配器固定到电机臂上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装电机/电机臂/电机外壳组件。
	<ol>
		<li>获取定制的铝制电机外壳和400步进的步进电机。</li>
		<li>将步进电机和电机外壳上的螺丝孔对齐，然后用四颗#4-40、0.5英寸的螺丝固定。</li>
		<li>将步进电机的旋转电机杆穿过电机臂组件的开口，并拧紧铝制电机臂适配器上的锁紧螺钉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装光学开关组件。
	<ol>
		<li>获取定制的铝制光学开关和三个1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>将适配器板旋入光开关的螺纹孔中。</li>
		<li>使用四颗 #4-40 0.5 英寸螺丝将定制的铝制光学开关面板固定到光学开关上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步进电机的旋转电机杆穿过光电开关的中心孔，把电机/电机臂/电机外壳组件安装到光电开关上。</li>
	<li>获取一块电路板和一个步进电机驱动器，然后将步进电机驱动器跨接在面包板的中央凹槽上。</li>
	<li>观察电路连接示意图（图3，2.12）用于步进电机驱动器、12 V电源和步进电机。</li>
	<li>将步进电机驱动器、12 V电源和步进电机按照电路图中的说明连接图3，2.12）以完成电动光开关的构建。</li>
	<li>将光学开关组件和钨卤素光源拧紧至先前搭建装置附近的光学平台或光学面包板上图21.24）高分辨率荧光显微内窥镜组件。</li>
	<li>将一端连接 550 µm，将0.22 NA的光纤跳线连接至电机臂组件的1.0英寸光纤适配板。</li>
	<li>连接另一端的 550 µm，将0.22 NA的光纤跳线连接到USB光谱仪的光纤接口。</li>
	<li>将五根远端探头电缆拧入仪器上相应的1.0英寸光纤适配板，以完成多模态高分辨率成像与亚扩散反射光谱光纤束微内窥镜的组装。
	<ol>
		<li>将直径为1 mm的中心成像光纤电缆拧入第1.9.2步中提到的1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>拧入最左侧的螺丝 200 µm 将多模光纤电缆连接至步骤2.6中提到的1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>拧入2nd 200 µm 将多模光纤电缆连接至第2.9.2步中提到的钨卤素灯上最左侧的1.0英寸光纤适配器。</li>
		<li>拧入3rd 200 µm 将多模光纤电缆连接至步骤2.9.2中提到的中间1.0英寸光纤适配板。</li>
		<li>拧入4个th 200 µm 将多模光纤电缆连接至步骤2.9.2中提到的最右侧1.0英寸光纤适配板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于光子学实验的激光光学装置及其组件与组装步骤；示意图显示了连接方式。" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：亚扩散反射光谱模组的组装。 亚扩散反射光谱模组可通过一个基本的钨卤素灯与物镜耦合，将光聚焦至200 µm多模传输光纤，并连接光谱仪来构建。此外，可在灯-光纤-光谱仪光路中构建一个定制的电动光学开关，以在各个SDS之间切换。使用多个光谱仪从多个SDS采集数据的研究人员可省略光学开关组件。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54564/54564fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 次扩散反射光谱模式的校准
注意：以下步骤（第3节）必须在光谱数据采集（第4节）之前完成。
<ol>
	<li>开启所有仪器组件，包括 455 nm LED、宽带钨卤素灯、CMOS 相机、USB 光谱仪、步进电机和电机控制板。确保钨卤素灯的快门处于打开状态。</li>
	<li>关闭所有环境光。</li>
	<li>打开自定义数据采集软件。</li>
	<li>让设备持续运行 30 分钟，使光源达到适当的工作温度，并使光谱仪的固有噪声趋于稳定。</li>
	<li>将一个 20% 漫反射标准板放置在自行设计、3D 打印的校准标准装置底部开口处。</li>
	<li>将光纤探头插入自定义的 3D 打印光纤支架最左侧的插槽中，如图 4所示。最左侧插槽可将光纤探头尖端与反射标准板之间的垂直距离固定为 2.1 mm，这是针对第一根源-探测器间距（SDS）为 374 µm 的探头，使到达光谱仪的信号最强的最佳距离。</li>
	<li>将电动光学开关调节至最左侧位置，使光谱仪连接至第一根 SDS 为 374 µm 的光纤通道。</li>
	<li>将积分时间设置为 500 毫秒。该积分时间的选择应确保光谱仪不发生信号饱和，同时保持实际应用中尽可能低的积分时间。</li>
	<li>在软件中点击“采集光谱”以获取光谱 Rmax,374µm。</li>
	<li>关闭钨卤素灯的快门，在软件中点击“采集光谱”以记录背景噪声光谱 Rdark,374µm。采集完成后，再次打开快门。</li>
	<li>将光纤探头插入自定义的 3D 打印光纤支架最右侧的插槽中，如图 4所示。最右侧插槽可将光纤探头尖端与反射标准板之间的垂直距离固定为 3.9 mm，这是针对第二根源-探测器间距（SDS）为 730 µm 的探头，使到达光谱仪的信号最强的最佳距离。</li>
	<li>将电动光学开关调节至中间位置，使光谱仪连接至第二根 SDS 为 730 µm 的光纤通道。</li>
	<li>在软件中点击“采集光谱”以获取光谱 Rmax,730µm。</li>
	<li>关闭钨卤素灯的快门，在软件中点击“采集光谱”以记录背景噪声光谱 Rdark,730µm。</li>
	<li>再次打开快门。</li>
</ol>
<img alt="使用反射输入进行电动光学开关校准，显示光谱学的探头间距。" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：亚扩散反射光谱模式的校准。在实验前校准过程中，光纤探头尖端与20%漫反射标准板之间的垂直距离需根据源-探测器间距（SDS）的不同而调整。为了在所有实验中一致地实现这些垂直距离，设计了一种校准标准装置（装置横截面如图（a）所示），用于将探头精确固定在距离20%漫反射标准板的指定位置。在此特定的光纤探头设置中，来自钨卤素灯的光经光学开关传输，在源-探测器间距分别为（b）374 µm 和（c）730 µm 时显示（为清晰起见，图中移除了电机及电机臂）。校准所需的垂直距离分别为（d）374 µm SDS 对应 2.1 mm，以及（e）730 µm SDS 对应 3.9 mm。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54564/54564fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 体内 人体皮肤数据采集与光学特性提取
本节将演示多模态显微内窥镜技术在 体内 人类皮肤
<ol>
	<li>打开自定义数据采集软件，通过点击“Integration Time”调整光谱仪积分时间，将其设置为与校准期间相同的值，本例中为 500 msec（步骤 3.8）。</li>
	<li>确定采集数据的皮肤区域，该区域可根据研究者的具体应用而有所不同。本示例中，选择前臂的薄皮肤作为演示部位。</li>
	<li>如果皮肤区域有毛发，使用一次性无菌剃刀去除毛发。</li>
	<li>使用一支含有吡喃素墨水的标准黄色荧光笔，轻轻标记选定的皮肤区域。</li>
	<li>打开455 nm LED，关闭卤钨灯的快门。</li>
	<li>将探头轻柔地接触皮肤。</li>
	<li>在组织染色区域移动探头，以在软件的观察窗口中实时查看表皮角质形成细胞结构的高分辨率图像。</li>
	<li>选择合适的曝光时间和增益参数，本例中为150毫秒和10 dB增益，以避免图像饱和。具体操作为：在软件界面中点击“Exposure Time”和“Gain”，输入相应的数值，然后点击“Apply Settings”。</li>
	<li>单击软件界面中的“Acquire Image”按钮以获取图像。</li>
	<li>在保持探头位于同一成像位置的同时，关闭455 nm LED，并打开卤钨灯的快门。</li>
	<li>将电动光开关调节至左侧位置，使光谱仪连接至第二个SDS 374 µm.</li>
	<li>获取光谱， R组织374µm, 通过在软件界面中点击“采集光谱”完成。</li>
	<li>将电动光开关调节至中间位置，使光谱仪连接到第二个SDS 730 µm.</li>
	<li>获取光谱， R组织，730µm，通过在软件界面中点击“采集光谱”.</li>
	<li>打开自定义的后处理软件。</li>
	<li>单击“Run”运行后处理软件，选择高分辨率荧光图像、四条校准光谱以及两条 体内 软件提示时，从保存数据的文件夹中选择光谱。 
	注意：该定制软件可获得真实的绝对反射率（R抗体374µm 和 R抗体730µm）使用以下公式。 
	<img alt="374μm 处吸光度方程；组织与暗反射的公式，实验分析" src="/files/ftp_upload/54564/54564eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="吸收计算公式，光谱分析，光谱学研究中使用的方程。" src="/files/ftp_upload/54564/54564eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> 
	后处理代码如前所述，通过拟合漫反射光谱（公式1和公式2）计算出拟合曲线，进而确定组织生理参数，包括[Hb]、[Mel]和SaO₂。2).11,22,24</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处报道的多模态高分辨率成像与亚扩散反射光谱光纤束微探针内窥镜可由研究人员优化后用于多种应用，包括在人体或动物研究中进行内窥镜或手持式操作。因此，该技术为可视化提供了灵活的方法 体内 从两个不同组织深度测量血红蛋白浓度、黑色素浓度和组织氧饱和度的同时，对顶端组织微结构进行成像。本文描述了光纤探头的技术规格，概述了高分辨率成像系统与亚扩散反射成像系统的组装方案，并展示了其在人体组织中的应用。 体内，使用派瑞宁染料作为荧光对比剂以实现组织可视化。其他染料（如普鲁黄或荧光素）可在获得适当批准后替代派瑞宁染料使用。4-7,11
该设计中的任何探头特性均可进行修改。对于高分辨率荧光显微内窥镜模式，直径为1 mm的成像光纤由50,000根独立纤芯组成，纤芯间距为4.5 µm，从而实现恒定的亚细胞空间分辨率4.5 µm。若研究人员希望获得更小或更大的视场，可选用不同尺寸的成像光纤，此类光纤直径通常在0.14至1.40 mm之间，易于获取。选用焦距为50 mm的管镜，以确保CMOS传感器能够完整捕获来自成像光纤的1 mm视场。在物镜保持不变...

光纤束微内窥镜技术通常采用成像技术或多种光谱技术的组合来分析体内组织。1-3 其中一种成像技术——高分辨率荧光微内窥镜技术，可利用外用对比剂（如普鲁黄、荧光素或派洛宁染料），在微小的微尺度视场内以亚细胞分辨率对组织表层微结构进行成像。1,3-11 该成像方式在实时定性区分病变与正常上皮组织方面表现出良好的临床性能，且观察者间差异较小。8 偶尔，研究人员会利用高分辨率荧光显微镜数据提取细胞和细胞核大小、腺体面积等定量特征，但该技术仍主要作为一种定性方法，用于可视化组织形态。1,3,8-10 另一方面，光谱技术（如漫反射光谱）旨在提供组织功能信息，在多个器官中定量识别癌变病灶方面也展现出良好的临床应用前景。2,12-15
因此，需要一种能够整合这两种模式的设备，以进一步降低观察者间的差异性，保持对组织微结构的实时可视化，并提供更全面的组织健康分析。为实现这一目标，研制了一种多模态基于探针的仪器，该仪器将两种模式集成于单根光纤探针中：高分辨率荧光显微内镜与亚扩散反射光谱技术11。该方法将顶端组织形态（结构特性）的定性高分辨率图像与来自两个不同组织深度的定量光谱信息（功能特性）进行共配准，包括局部血红蛋白浓度（[Hb]）、黑色素浓度（[Mel]）和氧饱和度（SaO2）11,12,16。这种特定的亚扩散反射光谱模式采用两种源-探测器间距（SDS），以采样两个独特的组织深度，从而通过检测至基底膜及下方组织间质，提供更全面的组织健康信息11。
光纤探头由一根直径为1 mm的中心成像光纤组成，包含约50,000根纤芯 4.5 µm 直径为纤芯元件，包层直径为1.1 mm，总涂层直径为1.2 mm。该图像光纤周围环绕着五根 200 µm 直径纤维，包层直径为 220 µm。每个 200 µm 多模光纤的中心间距为 864 µm 远离图像光纤的中心。每一个 200 µm 多模光纤是 25° 分开。使用最左侧的 200 µm 多模光纤作为“源”光纤，以及额外的三根 200 µm 将多模光纤作为“收集”光纤时，这种几何结构必然形成三个中心到中心的SDS 374 µm, 730 µm, 1,051 µm，以及 1,323 µm光纤尖端被封装在一个圆柱形金属外壳中，以保持各光纤之间的距离恒定。该圆柱形金属外壳的直径为3 mm。光纤探头的远端（朝向光纤探头尖端）长度为2英尺。在近端（朝向仪器设备端）处，探头分成六根独立的光纤，该部分额外长度为2英尺，总长度为4英尺。 图1 显示了光纤探头的示意图。
<img alt="光纤探头设计、CAD 图纸及光谱测量的组装步骤。" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：光纤探头设计。 该光纤探头由一根直径为 1 mm 的成像光纤和四根直径为 200 µm 的多模光纤组成。本图展示了（a）金属端帽的结构，用于固定探头尖端处光纤的几何排列，相对于最左侧的 200 µm 多模光纤，可实现 374、730 和 1,051 µm 的源-探测距离（比例尺 ≈ 1 mm）；（b）光纤被约束在金属端帽内的示意图，显示了光纤纤芯、包层和涂层（比例尺 ≈ 1 mm）；（c）光纤周围的保护性聚酰胺护套（比例尺 ≈ 1 mm）；（d）探头完成后的远端尖端，带有金属指握结构以及包含所有光纤的单根黑色电缆（比例尺 ≈ 4 mm）；以及（e）探头远端尖端的实际照片（比例尺 ≈ 4 mm）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54564/54564fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
这种多模态仪器及其相关技术是首次将这些模态集成于单个探头中，尽管目前已存在其他结合不同模态的结构/功能联合技术。例如，高光谱成像将宽场成像与血红蛋白和黑色素的定量特性相结合17,18，还有其他技术将光学相干断层扫描（OCT）与组织蛋白表达分析相结合19，仅举几例。本文报道了一种结构紧凑且易于实现的仪器装置，采用通用光纤探头，可根据不同应用需求进行优化，包括用于下消化道和食管的内窥镜检查，或作为手持探头用于口腔及体表皮肤检测11,20。
该仪器的硬件需要定制的数据采集和后处理代码，以获取漫反射光谱，并进而提取得到的体积平均组织生理参数，包括[Hb]、[Mel]和SaO₂。2定制的数据采集代码旨在实现从相机（用于高分辨率荧光显微镜）和光谱仪（用于漫反射光谱）同时采集数据。制造商的网站通常提供驱动程序，以支持与多种编程语言的集成。定制的后处理代码可导入 先验的 吸收值 体内 [Hb] 和 [Mel]21 然后利用先前开发的非线性优化拟合过程，对光谱数据进行拟合曲线的生成。22 拟合曲线通过最小化 χ2 其自身与原始光谱之间的值，并确定组织生理参数（[Hb]、[Mel] 和 SaO2) 从拟合曲线中得出且具有最低的 χ2 值22 代码可进行修改，以纳入其他发色团的吸收，例如此处使用的外源性吡喃素墨水，从而确保目标生理参数不受影响。
组织健康的生理指标，如[Hb]、[Mel]和SaO2，可作为肿瘤对治疗反应的报告，或作为局部血管化和血管生成的指标14,23。结合高分辨率荧光显微内镜模式有助于引导探头定位，并为研究人员提供更完整的上皮组织结构与功能关系图像。本文描述了多模态显微内镜的构建与应用11。

<table><tbody><tr><td>带二向色滤光片支架的30 mm笼式立方体</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>CM1-DCH</td><td></td></tr><tr><td>470 nm二向色镜（光束分束器）</td><td>Chroma Corporation</td><td>T470lpxr</td><td></td></tr><tr><td>笼式组件杆，1.5&quot;，4件装</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>ER1.5-P4</td><td></td></tr><tr><td>笼式组件杆，3.0&quot;，4件装</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>ER3-P4</td><td></td></tr><tr><td>笼式组件杆，2.0&quot;，4件装</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>SM1螺纹30 mm笼式板</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>SM1系列无应力固定环</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>SM1PRR</td><td></td></tr><tr><td>SM1透镜套管，1.00&quot;螺纹深度</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>SM1L10</td><td></td></tr><tr><td>直角运动学镜架</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>KCB1</td><td></td></tr><tr><td>1&quot;紫外增强铝镜</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Z轴平移镜架</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>SM1Z</td><td></td></tr><tr><td>10X Olympus平场消色差物镜</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>RMS10X</td><td></td></tr><tr><td>XY平移透镜镜架</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>带SM1螺纹的SMA光纤适配板</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>SM1SMA</td><td></td></tr><tr><td>SM1透镜套管，0.50&quot;螺纹深度</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>440/40带通滤光片（激发）</td><td>Chroma Corporation</td><td>ET440/40x</td><td></td></tr><tr><td>525/36带通滤光片（发射）</td><td>Chroma Corporation</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>快干环氧胶</td><td>Loctite</td><td>1395391</td><td></td></tr><tr><td>455 nm LED光源外壳套件 - 3瓦</td><td>LED Supply</td><td>ALK-LH-3W-KIT</td><td></td></tr><tr><td>1&quot;消色差双胶合透镜，f = 50 mm</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>AC254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>Flea 3 USB黑白相机</td><td>Point Grey, Inc.</td><td>FL3-U3-32S2M-CS</td><td></td></tr><tr><td>0.5&quot;支架座，L = 1.5&quot;</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>PH1.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5&quot;光学支架，L = 4.0&quot;</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>TR4</td><td></td></tr><tr><td>安装底座，1&quot; x 2.3&quot; x 3/8&quot;</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>长寿命钨卤素光源（可见光-近红外）</td><td>Ocean Optics</td><td>HL-2000-LL</td><td></td></tr><tr><td>20X Olympus平场物镜</td><td>Edmund Optics, Inc.</td><td>PLN20X</td><td></td></tr><tr><td>定制铝制电机臂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制设计与制造</td></tr><tr><td>定制铝制电机臂适配器</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制设计与制造</td></tr><tr><td>定制铝制电机外壳</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制设计与制造</td></tr><tr><td>步进电机 - 400步/转</td><td>SparkFun Electronics</td><td>ROB-10846</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>定制铝制光纤开关</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制设计与制造</td></tr><tr><td>定制铝制光纤开关面板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制设计与制造</td></tr><tr><td>Arduino Uno - R3</td><td>SparkFun Electronics</td><td>DEV-11021</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>自粘式电子面包板</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12002</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>EasyDriver - 步进电机驱动器</td><td>Sparkfun Electronics</td><td>ROB-12779</td><td></td></tr><tr><td>12 V，229 mA电源</td><td>Phihong</td><td>PSM03A</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>增强灵敏度USB光谱仪（可见光-近红外）</td><td>Ocean Optics</td><td>USB2000+VIS-NIR-ES</td><td></td></tr><tr><td>550 &amp;micro;m，0.22 NA，SMA-SMA光纤跳线</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>M37L01</td><td></td></tr><tr><td>定制光纤探头</td><td>Myriad Fiber Imaging</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>20% Spectralon漫反射标准板</td><td>Labsphere, Inc.</td><td>SRS-20-010</td><td></td></tr><tr><td>标准黄色荧光笔</td><td>Sharpie</td><td>25005</td><td>多个供应商，可用原黄素或荧光素替代</td></tr></tbody></table>

多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、 体内 组织分析

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

近期的光纤束微内窥镜技术可实现无创分析 体内 利用成像技术或多种光谱技术的组合来评估组织。将成像与光谱技术整合至单一光学探头，可能实现对组织健康状况更全面的分析。本文将两种截然不同的技术——高分辨率荧光显微内镜成像与漫反射光谱——整合于一个光学探头中。高分辨率荧光显微内镜成像可用于可视化观察组织表层的微观结构，尽管该技术主要为定性方法，但已证明可在新生物性与非新生物性组织之间实现有效的实时区分。漫反射光谱则是一种可提取组织生理参数的技术，包括局部血红蛋白浓度、黑色素浓度及氧饱和度。本文阐述了构建该光纤探头所需的技术规格、仪器搭建方法，并随后在组织样本上演示了该技术的应用。 体内 人类皮肤。该研究揭示了组织微结构（特别是表皮角质形成细胞）可与其相关的生理参数进行共定位分析。本文介绍的仪器及光纤束探头可优化为手持式或可与内窥镜兼容的装置，适用于多种器官系统。未来还需进一步的临床研究，以验证该技术在不同上皮疾病状态下的应用可行性。

按照本方案操作后，研究人员将获得该组织部位的全视野、高分辨率且聚焦清晰的图像（图5）。若使用标准黄色荧光笔中的吡喃宁墨水进行染色，可观察到细胞轮廓；若使用如普鲁黄等染料染色，则可观察到单个细胞核。光谱采集完成后，后处理软件将使用 先验的 知识 体内 血红蛋白浓度（[Hb]）和黑色素浓度（[Mel]）21 以拟合亚扩散反射光谱并确定血红蛋白浓度（[Hb]）、黑色素浓度（[Mel]）和组织氧饱和度（SaO2如所示 图5后处理软件采用宽泛的生理范围（[Hb] = 0–150 mg/ml，[Mel] = 0–30 mg/ml，以及 SaO2 = 0-100%）以拟合校准光谱。21
<img alt="静态平衡；皮肤样本的荧光与浓度分析；示意图显示[Hb]、[Mel]、Sa...

本文描述了一种多模态显微内窥镜的组装与使用方法，该内窥镜可同时获取组织表层的图像数据以及组织生理参数，包括血红蛋白浓度、黑色素浓度和氧饱和度。该技术可用于评估组织结构与灌注情况，并可根据研究者的具体需求进行优化。

近年来的光纤束微内窥镜技术能够利用成像技术或多种技术的组合，对活体组织进行无创分析。

本实验的总体目标是通过结合高分辨率结构信息与定量光谱数据，实现对活体组织的功能特性进行表征。该方法可用于解答癌症生物学领域中的关键问题，例如量化治疗对组织微结构和灌注的影响。该技术的主要优势在于，可使用同一探头从相同位置同时采集图像和光谱数据。该技术的应用前景涉及胃肠道癌症治疗，因为该探头可与常规内窥镜技术兼容。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为探头位置的微小偏差会显著影响数据的准确性。当我们意识到将高分辨率成像技术与定量光谱方法相结合的重要性时，便首次提出了该方法的构想。该方法的可视化演示至关重要，因为其构建和校准过程复杂，使得制备步骤难以掌握。要开始组装多模态微内窥镜的高分辨率荧光显微成像模块，请将一个470纳米的二向色镜安装到一个30毫米笼式立方体中。将笼式组件杆连接至笼式立方体的前侧、右侧和左侧。将无应力固定环连接至带螺纹的笼式安装板，并将镜头筒旋入固定环中。将另一块笼式安装板连接至镜头筒，使其与第一块笼式安装板对齐。接着，将紫外增强铝镜固定在直角镜架中。将四根杆固定在镜架的前部，另将两根杆以对角方式固定在镜架的右侧。将透镜筒组件滑入笼式立方体的左侧。将镜架组件的右侧与透镜筒组件连接。将Z轴平移架滑动安装到组件的右侧。将10倍消色差物镜安装到平移架上。接着，将光纤适配板固定到XY轴平移透镜架上。将载物台滑入物镜前方的装置上。使用固定环，将合适的激发滤光片和发射滤光片安装至透镜筒内。将激发滤光片透镜筒旋入笼式立方体前端。将发射滤光片透镜管插入直角反射镜支架前端。使用环氧树脂将455纳米LED固定在激发滤光片前方的笼式板上。在每个滤光片透镜管前方滑入一块笼式板。使用固定环将消色差双胶合管镜固定到另一个透镜筒中，使透镜外侧的箭头朝向透镜筒的外螺纹端。将管镜连接到左侧笼板，在管镜前方放置另一块笼板。使用无应力固定环将USB黑白相机连接到笼板上。开始组装亚漫反射光谱模态时，使用环氧树脂将螺纹笼板固定在钨卤素光源的前端。将四根笼杆插入笼板，并将Z轴平移支架滑入笼杆上。将一个20倍消色差物镜旋入Z轴平移支架中。 将光纤适配板连接至XY轴平移调节架，并将该调节架滑入物镜前方的组件中。最后，使用合适的安装装置将两个组件紧密固定在同一光学平台上。开始构建光源-探测器分离切换装置时，将一个外螺纹SMA光纤适配板旋入铝制电机臂中。将电机臂适配器安装到电机臂背面。然后，将步进电机拧入铝制电机外壳中。将电机臂组件旋入电机杆，并拧紧锁定螺丝。接下来，将三个光纤适配器板拧入一个光开关，然后将面板拧到光开关上。将步进电机的杆穿过光开关的中心孔。将步进电机驱动器放置在无焊红色电路板的中线位置。将驱动器连接至合适的电源和步进电机。将光学开关固定在光学平台上。将一根550微米、0.22数值孔径的光纤跳线连接到电机臂上。将另一端连接到USB光谱仪。连接光纤探头时，将中央的1毫米成像光纤电缆连接至高分辨率荧光显微成像模块组件。将左侧的200微米多模光纤电缆连接至亚扩散反射光谱成像模块组件。从左侧开始，按顺序将剩余的多模光纤连接至光学切换装置的左、中、右三个适配器。为开始实验的校准，请将所有USB外设连接到计算机。打开所有仪器，并确保钨卤素灯的快门处于打开状态。然后，关闭室内灯光并遮蔽其他环境光源。打开数据采集软件，让设备运行30分钟后再进行校准。将一个20%漫反射标准板放入校准装置的底部区域。将光纤探头插入装置左侧的插槽中，并将电动光学开关设置到左侧，以选择374微米作为DS设置。在软件中，将积分时间设置为500毫秒。然后，单击“获取光谱”以开始采集该SDS的RMAX。RMAX采集完成后，将光谱保存至指定文件夹。关闭钨卤素灯快门，采集该SDS的R暗光谱。打开快门，将探头移至校准装置的右侧插槽，并将电动光开关设置为中间位置，对应730微米的SDS设置。采集该SDS的RMAX和RDARK以完成校准。首先，确定合适的数据采集皮肤区域。使用黄色荧光笔作为荧光素的来源，轻轻染色选定区域。开始高分辨率荧光显微镜观察时，打开455纳米LED光源，并关闭卤素钨灯的快门。将光纤探头轻柔地接触皮肤。移动探针以扫描经吡喃染色的组织，显示顶端电流的深层结构。在软件中设置合适的曝光时间和增益，以避免图像饱和。然后，单击“获取图像”以获得静态图像。将探头保持在原位以进行亚漫反射光谱测量。关闭455纳米LED，并打开钨卤素灯快门。然后，在左侧切换至374微米SDS设置。单击“采集光谱”以获取该SDS的R-组织光谱。然后切换到中间位置，采集730微米SDS的R-组织光谱。打开后处理软件，单击运行。当系统提示时，选择校准光谱、体内光谱和高分辨率荧光图像以获得组织图像。高分辨率荧光显微成像模式可提供组织位点的高分辨率、聚焦清晰的图像。派洛宁染色显示单个角质形成细胞的轮廓。后处理软件利用亚漫反射光谱数据计算血红蛋白浓度、黑色素浓度和组织氧饱和度。使用该多模态显微内窥镜将良性黑色素细胞痣与其邻近的正常皮肤组织进行比较。与正常组织相比，黑色素细胞痣显示出略低的血红蛋白浓度和略高的黑色素浓度。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时之内完成。在进行此操作时，需注意让钨卤素灯预热15分钟，并在数据采集前使用反射标准物对仪器进行校准。在此步骤完成后，可采用其他技术，如共聚焦显微镜或多光子显微镜，进一步研究蛋白质结构或代谢过程中的亚细胞变化。该技术发展之后，为研究人员探索化疗过程中组织灌注与微结构之间的关系开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建和使用一种混合型微型内窥成像与光谱分析装置。

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生物工程

多峰成像和光谱学纤维束显微内窥镜纲要非侵入性，<em&gt;在体内</em&gt;组织分析

在许多生物学和临床情境中，研究细胞过程在其天然微环境中的动态演变具有显著优势。本文介绍了低成本光纤显微镜的组装及其应用，该显微镜可实现实时成像，适用于细胞培养、动物实验以及临床患者研究。...

高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

小型动物成像技术可实现活体内的连续诊断检查和治疗干预。in...

小鼠内窥镜检查技术 在体 内 癌症发生的多模态成像及肠道伤口愈合与炎症评估

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。...

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本研究提出了一种利用非线性光学光谱与质谱成像技术对软组织中药物进行关联成像的方法。将高分辨率皮肤成像与高灵敏度药物检测相结合，为研究药物在皮肤中的分布提供了有力手段，这对于开发更优的局部外用产品至关重要。...

相关光学光谱与质谱成像方法用于可视化软组织切片中的药物分布

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。...

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography,...

一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

学习多峰成像与光谱学纤维束显微内窥镜技术，用于非侵入性体内组织分析。该方法结合高分辨率荧光成像与漫反射光谱，可同时获取组织结构图像与血红蛋白、黑色素等生理参数，为癌症生物学研究提供功能表征工具。

多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、体内组织分析

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多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、 体内 组织分析

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