多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、 体内 组织分析

本实验的总体目标是通过结合高分辨率结构信息与定量光谱数据，实现对活体组织的功能特性进行表征。该方法可用于解答癌症生物学领域中的关键问题，例如量化治疗对组织微结构和灌注的影响。该技术的主要优势在于，可使用同一探头从相同位置同时采集图像和光谱数据。

该技术的应用前景可拓展至胃肠道癌症治疗领域，因为该探头可与常规内窥镜技术兼容。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为探头位置的微小偏差会显著影响数据的准确性。当我们意识到将高分辨率成像技术与定量光谱方法相结合的重要性时，便首次提出了该方法的构想。

该方法的可视化演示至关重要，因为其构建和校准过程复杂，使得制备步骤难以掌握。要开始组装多模态微内窥镜的高分辨率荧光显微成像模块，需将一个470纳米的二向色镜安装到一个30毫米的笼式立方体中。将笼式组件杆连接到笼式立方体的前侧、右侧和左侧。

将一个无应力固定环安装到带螺纹的笼式安装板上，并将一个透镜筒旋入该固定环中。将另一块笼式安装板连接到透镜筒上，并与第一块笼式安装板对齐。接着，将一块紫外增强铝镜固定在直角镜架中。

将四根杆固定在镜架的前部，另将两根杆以对角方式固定在镜架的右侧。将透镜筒组件滑入笼式立方体的左侧。将镜架组件的右侧与透镜筒组件连接。

将Z轴平移架滑动到组件的右侧。将10倍消色差物镜安装到平移架上。接着，将光纤适配板固定到XY轴平移透镜架上。

将载物台滑入物镜前方的装置上。使用固定环，将合适的激发滤光片和发射滤光片安装至透镜筒内。将激发滤光片透镜筒旋入笼式立方体前端。

将发射滤光片透镜套管插入直角反射镜支架的前端。使用环氧树脂将一个455纳米LED灯固定在激发滤光片前方的笼式安装板上。在每个滤光片透镜套管前方滑入一块笼式安装板。

使用固定环将消色差双合透镜管镜片固定到另一个透镜筒中，使镜片外侧的箭头朝向透镜筒的外螺纹端。将管镜连接到左侧笼板上，并在管镜前方放置另一块笼板。使用无应力固定环将USB黑白相机连接到笼板上。

开始组装亚漫反射光谱模态时，使用环氧树脂将一个带螺纹的笼式安装板固定在钨卤素光源的前端。将四根笼式组件杆插入笼式安装板，并将一个Z轴平移调节架滑入这些杆上。将一个20倍消色差物镜旋入Z轴平移调节架中。

将光纤适配板连接到XY轴平移支架上，并将该支架滑动安装至物镜前方的组件上。最后，使用合适的安装装置将两个组件紧密地固定在同一光学平台上。开始构建光源-探测器分离切换装置时，将一个外螺纹SMA光纤适配板旋入铝制电机臂中。

将电机臂适配器安装到电机臂的背面。然后，将步进电机旋入铝制电机外壳中。将电机臂组件旋入电机杆，并拧紧锁定螺丝。

接下来，将三个光纤适配器板拧入一个光开关，然后将面板拧到光开关上。将步进电机的杆穿过光开关的中心孔。将步进电机驱动器放置在无焊红色电路板的中线上。

将驱动器连接至合适的电源和步进电机。将光学开关固定在光学平台上。将一根550微米、0.22数值孔径的光纤跳线连接到电机臂上。

将另一端连接到USB光谱仪。连接光纤探头时，将中央的1毫米成像光纤电缆连接至高分辨率荧光显微成像模组组件。将左侧的200微米多模光纤电缆连接至亚扩散反射光谱成像模组组件。

从左侧继续，按顺序将剩余的多模光纤连接至光学切换装置的左、中、右三个适配器。为开始实验的校准，请将所有USB外设连接到计算机。打开所有仪器，并确保钨卤素灯的快门处于打开状态。

然后，关闭室内灯光并遮蔽其他环境光源。打开数据采集软件。在进行校准前，让设备运行 30 分钟。

将20%漫反射标准板放入校准装置的底部区域。将光纤探头插入装置左侧的插槽，并将电动光学开关设置到左侧，以选择374微米作为DS设置。在软件中，将积分时间设置为500毫秒。

然后，单击“获取光谱”以开始采集该 SDS 的 RMAX。RMAX 采集完成后，将光谱保存至指定文件夹。关闭钨卤素灯快门，并采集该 SDS 的 R 暗光谱。

打开快门，将探头移至校准装置的右侧插槽，并将电动光开关设置为中间位置，对应730微米的SDS设置。采集该SDS的RMAX和RDARK以完成校准。首先，确定合适的数据采集皮肤区域。

使用黄色荧光笔作为荧光素的来源，对选定区域进行轻微染色。开始高分辨率荧光显微镜观察时，打开455纳米LED光源，并关闭钨卤素灯的快门。将光纤探头轻轻接触皮肤表面。

移动探针以扫描经吡喃染色的组织，显示顶端电流的深层结构。在软件中设置合适的曝光时间和增益，以避免图像饱和。然后，单击“获取图像”以获得静态图像。

将探头保持在原位以进行亚漫反射光谱测量。关闭455纳米LED，打开钨卤素灯快门。然后，在左侧切换至374微米SDS设置。

单击“采集光谱”以获取该SDS的R-组织光谱。然后切换到中间位置，采集730微米SDS的R-组织光谱。打开后处理软件，单击“运行”。

当系统提示时，选择校准光谱、体内光谱和高分辨率荧光图像以获得组织图像。高分辨率荧光显微成像模式可提供组织位点的高分辨率、聚焦清晰的图像。派洛宁染色显示单个角质形成细胞的轮廓。

后处理软件利用亚扩散反射光谱数据计算血红蛋白浓度、黑色素浓度和组织氧饱和度。使用该多模态显微内窥镜将良性黑色素细胞痣与邻近的正常皮肤组织进行比较。与正常组织相比，黑色素细胞痣显示出略低的血红蛋白浓度和略高的黑色素浓度。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时之内完成。在进行此操作时，需注意让钨卤素灯预热15分钟，并在数据采集前使用反射标准物对仪器进行校准。在此步骤完成后，可采用其他技术（如共聚焦显微镜或多光子显微镜）进一步研究蛋白质结构或代谢的亚细胞水平变化。

该技术发展之后，为研究人员探索化疗过程中组织灌注与微结构之间的关系开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建和使用一种混合型微型内窥成像与光谱分析装置。