利用功能基因组筛选识别在肿瘤细胞球体培养潜在的新药物靶标

该 siRNA 筛选方案的目标是研究基因沉默对癌细胞系球状体生长的影响。与传统的二维细胞培养技术相比，癌症球状体表现出的条件与体内肿瘤中遇到的条件更相似。该方法可用于对人类癌症中经常改变的基因进行功能评估，更重要的是，它可用于在更复杂的培养条件下确定哪些基因是潜在的癌基因或肿瘤抑制因子，例如在三维培养中看到的，特别是在缺氧条件下。

这项技术的主要优点是适应性强，因此研究人员可以使用它来研究他们首选细胞系中感兴趣的特定基因。我们相信它建立在当前的靶向 sRNA 筛选方法之上。人们普遍认为，靶向筛选而不是全基因组菌株使科学家能够提出特定问题并产生更可靠的结果。

我们已经分析了基因沉默对球状体活力和大小的影响，但您也可以使用生物识别染料进行不同的筛选读数，例如细胞凋亡。演示该程序的是来自我们实验室的 Patty Wai。首先在室温下解冻含有 siRNA 文库的 96 孔板。

然后使用台式离心机以 1， 000 倍 g 的速度旋转 5 分钟。使用多通道移液器向每个板的孔中加入 10 μL 含有优化转染试剂的还原血清培养基。孵育 15 分钟，以形成含有 siRNA 的转染复合物。

与任何筛选流程一样，在进行全面筛选之前，应稳健优化转染条件下细胞系的球状体形成能力。接下来，对要筛选的细胞进行胰蛋白酶消化，直到它们从培养瓶中分离。细胞分离后，用适当体积的细胞系特异性培养基中和胰蛋白酶，转移至离心管中，并在台式离心机中以 1， 000 倍 g 离心 5 分钟以收集细胞。

弃去上清液，用适当体积的培养基将沉淀重悬至单细胞悬液中。使用自动细胞计数仪进行细胞计数。然后用冷培养基将悬浮液稀释至每 180 μL 5， 000 个细胞。

将细胞悬液转移到储液槽中。使用设置为 180 μL 的多通道移液器，移液管将细胞悬液混合并转移到含有 siRNA 的 96 孔板中。将板在预冷的 4 摄氏度离心机中以 1， 000 倍 g 离心 10 分钟，然后在 37 摄氏度的组织培养箱中孵育板。

此时，细胞将在孔底部显示为马赛克。24 小时后，在显微镜下观察细胞。此时，应将细胞聚集在一起，在孔的中心形成一个球

向每个孔中加入 100 微升完全培养基，以促进生长，然后再返回培养箱。生长三天后，从每个孔中轻轻去除 100 μL 培养基，并加入 100 μL 新鲜培养基。第 7 天，在显微镜下检查球体，然后继续在读板器上定量球体大小，该读板器可以定量监测球体随时间的增长。

要量化椭球体大小，请先在计算机上打开软件。选择 96 孔板，选择合适的板类型，然后输入实验名称。然后，将含有球状体的 96 孔板插入台式微孔板成像细胞仪中。

接下来，选择 Tumorsphere 应用程序。选择基于图像的焦点以更改焦点，以便椭球体处于焦点中并具有最佳对比度。选择需要扫描的孔，然后开始扫描。

接下来，确保对象掩码准确表示椭球体大小。对于生长 7 天的 BT474 球体，将 Precision （精度） 调整为 High（高），并将最小 Colony Diameter （菌落直径） 设置为 200 微米。使用 Export 功能以带注释的数据文件的形式导出数据，该文件将进行分析以识别对球状体面积具有统计学显著影响的 siRNA。

成像后，从每个孔中取出 100 微升培养基，并加入 100 微升发光活力染料以确定细胞活力。将板孵育 15 分钟后，使用发光读板机扫描板。该方案也可适用于其他癌细胞系。

非靶向对照的反向转染程序对任何测试品系的活力均未显著影响，而泛素 B（一种阳性细胞杀伤对照）的转染显著降低了活力。用 200 基因人 siGENOME siRNA 文库一式三份反向转染 BT474 细胞。观察球体面积和活力。

识别出 z 分数大于 1.7 的显著异常值。显著增加或减少球状体面积和活力的 SiRNA 以蓝色阴影表示，红色表示对照 siRNA。这组显微照片显示了用 E-Cadherin（一种非靶向对照）、PIK3CA、ERBB2 或 SF3B1 siRNA 反向转染后 7 天，BT474 球状体的代表性图像。

该直方图显示了反向转染后 7 天每种 siRNA 处理如何影响细胞活力。与对照组相比，敲低 ERBB2 和 PIK3CA 显著降低了细胞活力。该图像表明，可以成功地对球状体进行免疫染色，以揭示基因沉默对靶蛋白的影响。

一旦掌握，就可以在一天内在多个细胞系中筛选数百个基因，这允许可靠地鉴定对三维培养中存活很重要的潜在新基因。观看此视频后，您应该对如何成功培养适合 sRNA 介导的基因沉默的癌细胞球体有很好的了解。您还可以通过对球体进行免疫组化来研究基因沉默的影响。

这可以提供有价值的空间信息，这些信息可以告诉您潜在的生物学信息。