细胞形态改变与细胞运动的成像 果蝇 利用DE-钙黏蛋白报告基因转基因果蝇进行原肠作用研究
2016年12月29日
本文介绍了一种捕获果蝇（Drosophila）原肠胚形成过程的活体成像方法。该技术使我们能够更深入地理解早期发育过程中所涉及的顶端收缩现象，并进一步分析组织结构重塑期间调控细胞运动的机制。
本实验的总体目标是更好地理解果蝇原肠胚形成过程中细胞的形态与运动。本文提供了一种可靠的果蝇原肠胚形成测量方法，用于检测胚胎发育这一阶段形态发生性细胞运动的起始。该技术的主要优势在于，能够在原肠胚形成期间同时识别细胞重排和顶端收缩现象。
实验开始前，准备以下混合物：375 毫升水、125 毫升市售 100% 苹果汁和 12.5 克琼脂。
12.5 克葡萄糖。接下来，将混合物放入微波炉中加热，直至琼脂完全融化。然后将其倒入一个 3 厘米的细胞培养皿中。
将混合物于 4 摄氏度保存，以备后续使用。制备好苹果培养基后，在其表面添加一层薄薄的揉捏酵母糊，以供果蝇产卵。将 25 只雄性果蝇和 25 只雌性果蝇放入一个装有覆盖揉捏酵母的苹果培养基的培养瓶中。
用铝箔纸包裹塑料果蝇培养瓶，以促进果蝇产更多卵。将培养瓶倒置放入培养箱中过夜。次日早晨，将苹果汁培养板更换为新的。
然后用铝箔纸包裹瓶子，让果蝇产卵三到四个小时。果蝇产卵后，用棉签将卵从培养皿上轻轻刮下。用滤网收集胚胎，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
用 PBS 在 12 孔培养板中再清洗胚胎三次。在 12 孔培养板中用 50% 次氯酸钠溶液去除胚胎的卵膜。去卵膜处理后，再用 PBS 清洗胚胎三次。
将胚胎转移至含有 PBS 的 3 厘米细胞培养皿中。在显微镜下根据胚胎边界的透明程度挑选 5 期胚胎。使用 200 微升移液器吸头收集已分期的胚胎。
接下来，将两个选定的胚胎放置在玻璃盖玻片上，并用纸巾吸去多余的 PBS。用精细卷起的纸巾将胚胎背侧朝上调整至盖玻片表面。然后使用细针以硅脂将胚胎固定在玻璃盖玻片上。
在胚胎上加入一小滴Hollow Carbon Oil 700，将含有胚胎的盖玻片倒置放在凹面载玻片上，载玻片底部留出一定空间。然后将盖玻片粘附在载玻片上。
最后，使用共聚焦成像系统、氩离子488激光器和油浸物镜观察胚胎。通过活体成像采集延时图像，利用DE-钙黏蛋白GFP标记细胞运动，持续500秒，以分析果蝇原肠胚形成期间单个细胞的顶区。在500秒时，顶面收缩和内陷现象清晰可见。
通过使用我们的方法，我们可以进一步理解果蝇原肠作用的分子机制，以及癌症转移过程中涉及的上皮-间质转化。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种捕获果蝇原肠胚形成过程活体图像的方法，有助于加深对早期发育过程中顶端收缩现象的理解。该技术可实现对参与组织结构重塑的细胞运动进行详细分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 果蝇的原肠作用是胚胎发育过程中的关键阶段。
- 理解细胞形态与运动对于掌握发育过程至关重要。
- 顶端收缩在形态发生运动中起着重要作用。
- 活体成像技术可揭示细胞动态行为的细节。
研究目的
- 加深对黑腹果蝇原肠作用期间细胞运动的理解。
- 建立一种用于测量形态发生过程中细胞运动的可靠方法。
- 鉴定原肠作用期间的细胞重排和顶端收缩现象。
使用的方法
- 制备用于成像的特定混合物。
- 果蝇胚胎在原肠胚形成期间的活体成像。
- 细胞运动和形态变化的分析。
- 关键形态发生事件的鉴定。
主要结果
- 成功捕获果蝇原肠作用过程的活体图像。
- 鉴定出顶端收缩和细胞重排现象。
- 加深了对早期发育过程中细胞动态变化的理解。
- 为未来发育生物学研究提供了可靠的实验方法。
结论
- 该实验步骤为研究果蝇原肠作用提供了重要见解。
- 活体成像技术是研究细胞运动的有力工具。
- 研究结果有助于更深入理解发育过程的普遍机制。
常见问题
行业重要性概述
在果蝇（Drosophila）原肠胚形成过程中对细胞形态改变和运动进行活体成像，为解析上皮-间质转化（EMT）的分子机制提供了强有力的平台。EMT 过程与纤维化及癌症转移密切相关。该方法可实现对顶端收缩和细胞重排的高分辨率可视化，有助于提高针对 EMT 相关通路早期靶点验证的预测可信度。该策略加强了从发育生物学向生物制药研发中疾病相关机制研究的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在活体多细胞环境中研究与EMT相关的基因功能及信号通路动态。
- 通过直接可视化与疾病机制相关的形态发生事件，支持生物学风险评估。
- 有助于对调控顶端收缩和细胞命运转变的基因进行功能学靶点验证。
- 为在肿瘤学和纤维化研究项目中优先筛选EMT调控靶点提供预测性依据。
筛选与检测方法开发
- 建立了一种经过验证的成像系统，用于实时定量分析细胞运动和形态变化。
- 能够以可重复的方式测量顶端收缩和细胞重排，作为定量检测的输出结果。
- 支持对调节上皮-间质转化（EMT）化合物的表型筛选平台进行标准化。
- 为下游高内涵筛选工作流程提供稳定的生物系统准备。
转化与临床前研究
- 将发育过程中的上皮-间质转化（EMT）与疾病相关的转移和组织重塑模型相整合。
- 提供机制性见解，指导临床前研究中转化性生物标志物的选择。
- 基于活细胞表型证据，推动针对EMT的候选药物进行风险调整后的优化开发。
- 加强在EMT驱动的疾病领域中，从发现到临床前验证的连续性。
流程与工作流整合
该成像方法可整合到从早期假设验证到EMT相关靶点的临床前模型开发的整个发现流程中。
- Discovery Biology：支持对上皮-间质转化（EMT）及形态发生调控因子的假设验证与信号通路解析。
- Screening：提供针对细胞形态与运动的定量、可重复的输出结果，实现检测方法的标准化准备。
- Analytics：提供高内涵成像数据，用于遗传或药理学扰动的比较分析。
- Translational Research：将发育机制与疾病相关的EMT模型相连接，促进生物标志物的匹配与转化应用。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用的成像平台，适用于多种EMT及形态发生研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提升针对 EMT 的研发项目在预测置信度和机制去风险方面的水平。
- 操作价值：提供标准化、可扩展的成像工作流程，实现跨项目的可重复性。
- 战略价值：为“推进/终止”决策提供依据，并降低由 EMT 驱导的适应症在后期阶段的生物学风险。
- 组合影响：支持在各治疗领域中对调节 EMT 的资产进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备活体成像、共聚焦显微镜和Drosophila胚胎学方面的专业知识。
- 需要使用先进的成像设备以及用于延时分析的图像分析软件。
- 为确保可重复性，需在不同研究团队间对胚胎分期和成像方案进行标准化。
- 若将该方法应用于其他模式系统，可能需要优化报告基因构建体和成像条件。
- 实际限制包括通量受限以及对胚胎操作精度的要求。
