爪蟾卵母:显微注射方法优化，滤泡细胞层的去除，并在电生理实验快速变化的解决方案
December 31st, 2016
描述了非洲爪蟾卵母细胞中分离单个卵泡、细胞质 RNA 显微注射、去除周围细胞层和蛋白质表达的优化程序。此外，还提出了一种在电生理实验中使用配体门控离子通道快速更换溶液的简单方法。
该程序的总体目标是表达新蛋白质，例如非洲爪蟾卵母细胞中的离子通道。这种方法可以帮助回答任何需要功能表达系统的领域中的关键问题。这种技术变体的主要优点是速度、可靠性和提高卵母细胞的存活率。
这种方法可以深入了解离子通道的功能。此外，它可以应用于任何其他蛋白质的研究。当我们意识到经典方法导致卵母细胞存活率低时，我们第一次想到了这种方法。
根据文本方案从雌性青蛙身上去除卵巢叶后，将叶放入补充有青霉素和链霉素的无菌改良巴斯溶液中。切开肺叶，让组织获得氧气。要挑出第 5 到 6 阶段的卵泡，使用镊子固定卵巢，然后将铂环降低到卵泡上，然后轻轻地撤回环以破坏结缔组织与卵泡从卵巢组织中分离。
使用铂环分拣出看起来健康的卵母细胞。使用塑料巴斯德移液器，吸头切成 1.5 毫米直径，将选定的卵泡转移到直径为 35 毫米的培养皿中。根据文本方案为 GABA A 受体和微量注射移液器制备 cRNA 后，使用石蜡油和带有细针头的 10 毫升注射器回填微量注射移液器。
然后将移液器安装到自制的微量注射装置上。使用带有无菌塑料吸头的移液器，将一滴 mRNA 溶液滴到一块防潮热塑性塑料的清洁面上。然后将注射移液管的尖端浸入液滴中，并打开电机以缩回柱塞。
mRNA 溶液应进入移液器并与油形成可见界面。接下来，将移液器的尖端从液滴中缩回，并对注射移液管的内部施加正压。注射移液管的尖端应形成一滴 mRNA 溶液。
使用底部粘有尼龙网并覆盖有 MBS 注射的 60 毫米培养皿，将卵泡排成一行，使其植物极朝上。使用显微作器，将注射移液管放在单个卵泡上。将注射针插入植物杆的中心，对移液器内部施加正压，以每分钟 0.6 微升的流速注射 50 纳升 mRNA。
等待 5 到 10 秒，然后从毛囊中取出注射移液器吸头，以避免信使 RNA 逸出。将注射的卵泡转移到装有 2 毫升 MBS 的新培养皿中。将盘子放入 18 摄氏度的酒柜中。
在记录之前，将注射的卵泡孵育 1 到 7 天，具体取决于新表达的蛋白质的身份。为了剥离卵泡，将 10 个注射的卵泡转移到含有 0.5 毫升 MBS、每毫升 1 毫克胶原酶和 0.1 毫克/毫升胰蛋白酶抑制剂的硼硅酸盐玻璃管中。将试管浸入 36 摄氏度的水浴中，并将卵泡孵育 20 分钟。
这里的温度很关键，因为再升高一度可能会杀死卵母细胞。在室温下将卵泡转移到含有 1 毫升 MBS 的第二根试管中，冲洗毛囊，然后将它们留在试管中约 10 秒钟。然后将卵泡转移到含有 0.5 毫升双倍浓缩 MBS 和 4 毫摩尔 EGTA 的第三根试管中，并在室温下孵育样品 4 分钟，偶尔摇动试管。
4 分钟的孵育时间对于确保卵泡层与卵母细胞分离至关重要。在室温下将卵泡转移到另一根含有 1 毫升 MBS 的试管中，冲洗毛囊，并在试管中放置约 10 秒。将卵母细胞转移到含有 2 毫升 MBS 的 35 毫米培养皿中。
然后，在立体显微镜下，使用铂环将裸露的卵母细胞推开，将外包膜与卵泡分离。储存剥落的卵母细胞直至使用。在本实验中，机械挑选的非洲爪蟾卵母细胞显微注射 GABA A 受体亚基的 mRNA 涂层。
然后去除滤泡细胞层。卵母细胞以负 80 毫伏电压夹紧，并暴露于浓度增加的 GABA 和 THDOC（GABA A 受体的一种有效的正变构调节剂）的存在下。该面板显示了取决于 GABA 浓度的引出电流振幅，表明该亚基组合对 GABA 的敏感性。
使用的方程是 I（c）Imax/n），其中 c 是 GABA 的浓度，EC50 是在存在一个微摩尔 THDOC 的情况下 GABA 的浓度，从而产生一半最大电流幅度。Imax 是最大电流幅度。I 是电流幅度，n 是 Hill 系数。
α 4 β 2 δ GABA A 受体的 EC50 为 0.41 0.12 微摩尔，n 为 0.76 0.04 一旦掌握，如果作得当，可以在半小时内去除滤泡细胞层。开发后，这项技术为研究人员改进非洲爪蟾卵母细胞中的蛋白质表达程序铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何分离被卵泡细胞层包围的非洲爪蟾卵母细胞、显微注射 mRNA 以及随后去除卵泡细胞层有一个很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概览
本文描述了在非洲爪蟾卵母细胞中分离单个卵泡和进行细胞质RNA微注射的优化程序。它还介绍了一种用于涉及配体门控离子通道的电生理实验中快速溶液变化的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- 非洲爪蟾卵母细胞常被用作研究蛋白质表达的模型系统。
- 传统方法往往导致卵母细胞存活率低。
- 改进的技术可以提高实验的可靠性和速度。
- 理解离子通道功能对各种生物学研究至关重要。
研究目的
- 在功能系统中表达新的蛋白质，特别是离子通道。
- 提供关于离子通道功能的见解。
- 提高实验过程中卵母细胞的存活率。
使用的方法
- 从非洲爪蟾卵母细胞中分离单个卵泡。
- 细胞质RNA微注射。
- 去除周围细胞层。
- 进行具有快速溶液变化的电生理学实验。
主要结果
- 优化的程序导致卵母细胞存活率提高。
- 提高了蛋白质表达的速度和可靠性。
- 成功在卵母细胞中表达了离子通道。
- 增强了对离子通道功能的理解。
结论
- 所描述的方法可以应用于离子通道之外的各种蛋白质。
- 这些技术代表了功能表达系统研究的重大进步。
- 进一步的研究可以利用这些方法来解决更广泛的生物学问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optimized Xenopus oocyte microinjection and follicular cell removal protocols enable robust functional expression of ion channels and membrane proteins, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The system's low endogenous channel background and rapid solution exchange facilitate quantitative electrophysiological assays, enhancing predictive confidence for lead identification and screening. These methods streamline the transition from molecular hypothesis to functional readout, reducing biological ambiguity at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate ion channels and transporters in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating protein-specific activity from endogenous background.
- Facilitates quantitative assessment of ligand-gated receptor pharmacology for target validation.
- Provides a platform for rapid hypothesis testing and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, scalable preparation of oocytes for downstream electrophysiological assays.
- Enables standardized, quantitative current measurements for compound screening.
- Supports assay readiness for high-throughput evaluation of channel modulators.
- Allows platform reuse for diverse membrane protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant ion channel pharmacology when appropriate.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of channel function.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative electrophysiological data.
- Supports translational biomarker development for ion channel targets.
Pipeline & Workflow Integration
These optimized Xenopus oocyte protocols position functional expression and electrophysiological analysis at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of membrane protein function and pharmacology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative current measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables EC50, Hill coefficient, and maximal current calculations for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models for ion channel targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse protein expression studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput of functional assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ion channel and transporter programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, oocyte handling, and electrophysiological recording.
- Demands access to specialized instrumentation for voltage clamp and solution exchange.
- Necessitates cross-team standardization of oocyte preparation and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different protein classes or ligand types.
- Temperature and incubation parameters are critical for oocyte viability and assay success.
