Xenopus 卵母细胞：显微注射、去除滤泡细胞层以及电生理实验中快速溶液更换的优化方法

本实验的总体目标是在非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）中表达新的蛋白质，例如离子通道。该方法有助于回答任何需要功能性表达系统的领域中的关键科学问题。该技术不同变体的主要优势在于其操作速度快、结果可靠，且卵母细胞的存活率更高。

该方法可为离子通道的功能研究提供见解，此外还可应用于其他任何蛋白质的研究。我们最初提出该方法的构想，是由于意识到传统方法导致卵母细胞存活率较低。

根据文本方案，从雌性青蛙体内取出卵巢叶后，将卵巢叶置于含有青霉素和链霉素的无菌改良巴氏溶液（Modified Barth's Solution）中。切开卵巢叶，以使组织能够接触氧气。为分离第5至第6期的卵泡，用镊子夹住卵巢，将铂金环下放至卵泡上方，然后轻轻提起铂金环，以破坏卵泡与卵巢组织之间的结缔组织，从而分离卵泡。

使用铂金环筛选外观健康的卵母细胞。用剪去尖端、口径为1.5毫米的塑料巴斯德吸管将选定的卵泡转移至直径为35毫米的培养皿中。根据文本方案制备GABA A受体的cRNA和显微注射吸管后，使用石蜡油和带有细针的10毫升注射器对显微注射吸管进行后向填充。

然后将移液器安装到自制的显微注射装置上。使用带有无菌塑料吸头的移液器，将一滴mRNA溶液滴加到一块防潮热塑性材料的洁净面上。随后将注射用移液管的尖端浸入液滴中，并启动电机以回抽活塞。

mRNA 溶液应进入移液管，并与油相形成可见的界面。接着，将移液管尖端从液滴中抽出，并对注射移液管内部施加正压。此时，mRNA 溶液应在注射移液管的尖端形成一个小液滴。

使用底部粘有尼龙网并用 MBS 覆盖以进行注射的 60 毫米培养皿，将卵泡排列整齐，使其植物极朝上。利用显微操作仪，将注射毛细管置于单个卵泡上方。将注射针插入植物极中心，向毛细管内施加正压，以每分钟 0.6 微升的流速注入 50 纳升的 mRNA。

注射后等待5到10秒再将注射移液管尖从卵泡中移出，以避免信使RNA逸出。将注射后的卵泡转移至一个新的培养皿中，内含2毫升MBS。将培养皿放入设定为18摄氏度的葡萄酒冷却器中。

根据新表达蛋白的特性，在记录前将注射后的卵泡孵育1至7天。剥离卵泡时，将10个注射后的卵泡转移至含有0.5毫升MBS、1毫克/毫升胶原酶和0.1毫克/毫升胰蛋白酶抑制剂的硼硅酸盐玻璃管中。将玻璃管浸入36°C水浴中，孵育20分钟。

此处温度至关重要，因为升高一度可能杀死卵母细胞。将卵泡转移至第二个含有1毫升室温MBS的离心管中，清洗卵泡，并在管中静置约十秒钟。随后将卵泡转移至第三个含有0.5毫升双倍浓度MBS（含4毫摩尔EGTA）的离心管中，在室温下孵育四分钟，期间偶尔轻轻振荡离心管。

孵育四分钟至关重要，以确保卵泡层从卵母细胞上脱落。将卵泡转移至另一含有1毫升室温MBS的离心管中，清洗卵泡，并在管中静置约10秒。随后将卵母细胞转移至一个含有2毫升MBS的35毫米培养皿中。

然后，在体视显微镜下，用铂金环通过轻轻推动裸露的卵母细胞，将其与滤泡的外层包膜分离。将去除了包膜的卵母细胞保存至使用。在本实验中，通过机械方法分离的非洲爪蟾卵母细胞被显微注射编码 GABA A 受体亚基的 mRNA。

随后去除卵泡细胞层。将卵母细胞在-80毫伏的电压下钳制，并暴露于浓度递增的GABA中，同时存在GABAA受体的强效阳性变构调节剂THDOC。该图显示了不同GABA浓度下诱发的电流幅度，反映了该亚基组合对GABA的敏感性。

所使用的方程为 I(c) = Imax / (1 + (EC50/c)^n)，其中 c 为 GABA 的浓度，EC50 是在 1 微摩尔 THDOC 存在下引发半最大电流幅度的 GABA 浓度，Imax 为最大电流幅度，I 为电流幅度，n 为 Hill 系数。

α4β2δ GABA A 受体的 EC50 为 0.41 ± 0.12 微摩尔，n 值为 0.76 ± 0.04。一旦掌握，若操作得当，可在半小时内去除滤泡细胞层。该技术发展后，为研究人员改进非洲爪蟾卵母细胞中的蛋白质表达流程铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离被滤泡细胞层包裹的非洲爪蟾卵母细胞、将其显微注射 mRNA，以及后续去除滤泡细胞层的操作步骤。