A蛋白制备方法在蛋白质与核余子交互使用LC-MS / MS分析的高通量鉴定
January 24th, 2017
我们已经建立了使用LC-MS / MS系统共同调节相互作用蛋白的纯化的方法。
本程序的总体目标是使用 LC-MS/MS 分析鉴定与核辅因子相互作用的蛋白质。这种方法可以帮助回答与基因调控领域转录机制相关的关键问题。这种技术的主要优点是我们可以识别与核辅因子相互作用的蛋白质。
此外，这种方法使我们能够更好地了解目标核因子的转录调控机制。通过用冰冷的 PBS 洗涤细胞片并用细胞刮刀收集细胞，在转运后 36 小时收获表达标志标记的 ARIP4 的 HEK 293 细胞。将细胞转移到 1.5 毫升试管中，然后在 4 摄氏度下以 8000 g 离心 2 分钟。
吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于五倍体积的高盐缓冲液中。将混合物在 4 摄氏度下旋转 20 分钟。旋转 20 分钟后，将试管在 17， 700 g 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。
接下来，将上清液转移到新的 2 ml 试管中，并加入稀释缓冲液至上清液体积的三倍。再进行一次离心，然后将上清液转移到新的 2 ml 试管中。在 10 分钟离心过程中，用 PBS 洗涤 50 μL 抗旗珠。
然后将试管在 4 摄氏度下以 2000 g 离心 1 分钟。去除上清液并重复洗涤步骤，首先用 1 摩尔盐酸甘氨酸，然后用 1 摩尔盐酸 tris。然后用低盐缓冲液洗涤两次。
接下来，将 50 μL 洗涤的珠子与全细胞提取物混合。在 2 到 4 摄氏度下轻轻旋转混合物 4 小时。然后用钝头将样品转移到微量离心柱中，让溶液滴入 1.5 mL 试管中。
在液氮中快速冷冻流出，并在零下 80 摄氏度下储存。接下来，用低盐缓冲液洗涤旗珠五次。洗脱时，将色谱柱放入 1.5 mL 试管中，以 2000 g 离心 1 分钟以干燥磁珠。
盖上色谱柱底部，然后加入 50 μL 1 摩尔甘氨酸盐酸盐。在室温下轻轻摇晃混合物 10 分钟。10 分钟后，将色谱柱放入新的 1.5 mL 试管中，以 2000 g 离心 1 分钟。
用 10 微升 1 摩尔 tris 盐酸盐中和洗脱的溶液，并通过移液和涡旋充分混合。加入 50 微升 100 毫摩尔碳酸氢铵。10 μL 乙腈、2 μL 二硫苏糖醇和 50 μL 中和样品。
在 30 摄氏度下孵育 56 分钟。孵育后，将样品在室温下放置 10 分钟。然后向样品中加入 10 微升 333 毫摩尔碘乙酰胺，在 37 摄氏度下避光孵育 30 分钟，向混合物中加入 10 微升胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，将最终产品运送到 LC-MS/MS 设施或第三方质谱实验室进行分析。该图显示了使用 Flag 特异性抗体进行免疫沉淀并通过电泳分离后，HEK 293 细胞中表达的 Flag 表位标记的 ARIP4 的银染。作为对照，对不表达外源蛋白的 HEK 293 细胞进行模拟纯化。
使用我们的方法，可以通过它们感兴趣的转录因子来识别推定的核辅因子，并进一步增强我们对转录调控机制的理解。
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概述
本研究提出了一种使用LC-MS/MS分析纯化协同调控相互作用蛋白的方法。该技术旨在识别与核辅因子相互作用的蛋白，从而增强我们对转录调控机制的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 基因调控
背景
- 理解转录机制对基因调控至关重要。
- 识别蛋白质相互作用可以揭示细胞过程的洞见。
- LC-MS/MS是分析蛋白质相互作用的强大工具。
- 该方法专注于核辅因子及其调控作用。
研究目的
- 识别与核辅因子相互作用的蛋白。
- 阐明转录调控机制。
- 提供一种可靠的蛋白纯化方法。
使用的方法
- 收集表达带标签的ARIP4的HEK 293细胞。
- 用冰冷的PBS洗涤细胞。
- 用细胞刮刀收集细胞。
- 在4°C下以8000g离心细胞两分钟。
主要结果
- 成功识别与核辅因子相互作用的蛋白。
- 增强对转录机制的理解。
- 展示了LC-MS/MS方法的有效性。
- 在基因调控研究中的潜在应用。
结论
- 该方法为研究蛋白质相互作用提供了宝贵的工具。
- 它有助于更广泛地理解基因调控。
- 未来的研究可以在这种技术基础上获得更多洞见。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
