一种用于通过LC-MS/MS分析高通量鉴定与核辅因子相互作用蛋白的蛋白质制备方法

本实验的总体目标是利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定与核辅因子相互作用的蛋白质。该方法有助于解答基因调控领域中与转录机制相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够鉴定出与核辅因子相互作用的蛋白质。

此外，该方法有助于我们更深入地理解靶向核因子的转录调控机制。转染后36小时，用预冷的PBS洗涤表达flag标签ARIP4的HEK 293细胞，用细胞刮刀收集细胞。将细胞转移至1.5毫升离心管中，于4°C、8000g离心2分钟。

吸去上清液，并用五倍于沉淀体积的高盐缓冲液重悬细胞沉淀。在4°C下旋转混合20分钟。旋转20分钟后，在4°C下以17,700g离心10分钟。

接下来，将上清液转移至新的 2 毫升离心管中，并加入上清液体积三倍的稀释缓冲液。再次进行离心，然后将上清液转移至另一支新的 2 毫升离心管中。在 10 分钟离心过程中，用 PBS 洗涤 50 微升抗 Flag 琼脂糖 beads。

然后在4°C条件下以2000g离心1分钟。弃去上清液，先用1摩尔盐酸甘氨酸、再用1摩尔盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris）重复洗涤步骤。随后用低盐缓冲液洗涤两次。

接下来，将50 µL洗涤后的磁珠与全细胞提取物混合，在2至4°C下轻轻旋转孵育4小时。然后使用钝头吸头将样品转移至微型离心柱中，使溶液滴入1.5 mL离心管中。

用液氮速冻穿流液，并在零下80摄氏度保存。接着，用低盐缓冲液洗涤Flag磁珠5次。洗脱时，将层析柱放入1.5毫升离心管中，在2000×g离心1分钟以干燥磁珠。

封闭层析柱底部，然后加入 50 µL 1 M 盐酸甘氨酸。在室温下轻轻振荡混合物 10 分钟。10 分钟后，将层析柱放入一个新的 1.5 mL 离心管中，在 2000×g 离心 1 分钟。

用10微升1摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）中和洗脱液，并通过移液和涡旋充分混匀。加入50微升100毫摩尔的碳酸氢铵。再加入10微升乙腈、2微升二硫苏糖醇以及50微升已中和的样品。

在56摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，将样品在室温下放置10分钟。然后向样品中加入10微升浓度为333毫摩尔的碘乙酰胺，并在37摄氏度下避光孵育30分钟。向混合物中加入10微升胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育过夜。

第二天将最终产物运送至液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）设施，或送至第三方质谱实验室进行分析。该图像显示了在HEK 293细胞中表达的带有flag表位标签的ARIP4蛋白，经flag特异性抗体免疫沉淀并电泳分离后的银染结果。作为对照，对未表达外源蛋白的HEK 293细胞进行了模拟纯化。

利用我们的方法，可以通过转录因子靶标识别潜在的核辅助因子，从而进一步加深对转录调控机制的理解。