通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

本实验的总体目标是绘制所选细胞的全基因组复制时序程序。该方法有助于回答复制研究领域中的关键问题，例如，基因组复制程序在健康与疾病状态下的变化方式。

该技术的主要优势在于，它是一种快速且简便的方法，可用于在各种细胞及条件下绘制复制时间图谱。编写传真程序的主要负责人是医学系的传真专家 Dan Lehmann。该程序通常至少需要一到两乘以十的六次方个快速生长的非同步细胞作为起始材料。

对于贴壁细胞，吸除液体，并用三毫升不含钙和镁的 PBS 洗涤每块培养板。弃去 PBS，向每块培养板中加入一毫升商品化胰蛋白酶-EDTA 溶液。在 37 摄氏度孵育五分钟，直至细胞脱落。

加入 3 毫升培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞收集到 15 毫升锥形管或 5 毫升聚苯乙烯管中。将细胞置于冰上保存。开始此操作时，在 4 摄氏度条件下以 300 × g 离心 5 分钟。

吸弃上清，用1毫升冷PBS洗涤细胞，随后离心收集细胞。第二次洗涤后，弃去PBS，将细胞重悬于250微升冷PBS中。

在轻轻涡旋振荡离心管的同时，逐滴缓慢加入 800 微升 -20 摄氏度的 100% 高纯度乙醇。这将使乙醇终浓度达到 70% 至 80%。将细胞置于冰上孵育 30 分钟。

将固定后的细胞在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 10 分钟，开始此操作。小心吸除上清液，并用 1 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后均需离心沉淀细胞。

第二次洗涤后，吸除上清液，并用以下 PI 混合液重悬每个细胞。混合液包含 1 毫升 PBS，其中加入 5 微升浓度为 10 毫克/毫升的 RNA酶A，以及 50 微升浓度为 1 毫克/毫升的碘化丙啶。将样品通过 35 微米滤网过滤至 5 毫升聚苯乙烯管中。

用封口膜密封试管。室温孵育15至30分钟。将样品避光保存，因为碘化丙啶对光敏感。

将使用分选仪对细胞进行分选。使用561纳米激光器根据细胞的碘化丙啶荧光强度来区分细胞。为获得最佳效果，应选用针对特定细胞大小推荐的最小喷嘴。

对于大多数细胞，其大小为85微米。使用稳定且缓慢的流速，通常每秒最多300至500个事件。

通过设门（Gating），绘制FCS与SSC的散点图，以区分死细胞和亚细胞碎片。从活细胞中，通过绘制SSC宽度与SSC高度的散点图，接着绘制FFC宽度与FFC高度的散点图，以及碘化丙啶（propidium iodide）宽度与碘化丙啶高度的散点图，来区分双联体（doublets）。对于活的单个信号细胞，绘制碘化丙啶面积强度的直方图，该直方图代表细胞的DNA含量。

在低温条件下将细胞分选为 G1 期和 S 期。S 期的门控范围应较宽，并延伸至 G1 期和 G2 期区域；而 G1 期的门控范围应较窄，尽可能远离 S 期。

对于某些细胞类型，可能难以获得理想的细胞周期分布。最关键的是获取不含S期细胞的G1期细胞。将分选后细胞的试管从传真机中取出。

分选后将离心管置于冰上。细胞分选完成后，按照生产商说明书，使用商品化的DNA纯化试剂盒对每个样品的DNA进行纯化。接着，使用聚焦式超声波破碎仪将DNA打断，目标平均片段大小为250个碱基对。

通过电泳验证剪切后DNA的片段大小。推荐的片段长度分布为200至700个碱基对，峰值约在250个碱基对处。随后，按照文本方案中的描述进行文库构建、测序和分析。

展示了小鼠胚胎成纤维细胞中整条一号染色体的复制时间图谱。图为约50兆碱基区域的放大视图。每个点代表各个窗口中S期与G1期信号的标准化比值，实线代表经三次平滑插值法计算得到的结果。

高S/G1值对应早期复制，而低值对应晚期复制。红色箭头指向复制时间恒定区域的示例，绿色箭头指向时间转换区域的示例。该图显示了小鼠胚胎成纤维细胞三组重复样本之间复制时间图谱的可重复性，并与小鼠前B细胞在小鼠1号染色体相同18兆碱基区域内的三组重复样本进行比较。

橙色箭头指向不同细胞系之间的差异区域示例。六个样本间斯皮尔曼相关性的热图进一步验证了这些结果。一旦掌握，该技术从细胞收集到图谱生成，若操作得当，可在一周内完成。

观看本视频后，您应能充分理解如何为生长中的细胞构建复制时间基因组图谱。