Name: 通过DNA含量测定的哺乳动物复制时序的全基因组的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 了解CNR-ToR方法，利用FACS分选和DNA测序技术快速绘制哺乳动物全基因组复制时序图谱。该技术通过比较S期与G1期细胞的DNA含量差异，可在约一周内完成高分辨率分析，适用于多种细胞类型和疾病研究。

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感谢Oriya Vardi在生成图表过程中提供的帮助。IS课题组的工作得到了以色列科学基金会（资助号567/10）和欧洲研究理事会启动资助（#281306）的支持。

注意：ToR 只能在生长中的非同步细胞上进行测量。实验应从至少 1 - 2 × 106 个快速生长的细胞开始，通常可获得约 1 × 105 个处于 S 期的细胞（这是限速步骤）。建议每个实验设置两到三个重复。CNR-ToR 的整个流程可在一周内完成——前两天用于完成文库构建前的所有步骤，一到两天用于测序，另需一天进行初步数据分析。
1. 从培养物中收集细胞
注意：本实验方案适用于在10 cm培养皿中培养的细胞（细胞数量约为2 - 5 × 106个），但可轻松调整用于其他培养平台。
<ol>
	<li>对于悬浮培养的细胞，直接进行固定（第2节）。</li>
	<li>对于贴壁细胞，吸除液体，并用 3 mL 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤培养板。</li>
	<li>弃去 PBS，加入 1 mL 商品化胰蛋白酶-EDTA 溶液，37 °C 孵育 5 分钟，直至细胞脱落。 
	注意：胰蛋白酶处理时间应根据细胞类型进行调整。</li>
	<li>加入 3 mL 培养基以中和胰蛋白酶，将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管或 5 mL 聚苯乙烯管中，置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 固定
注意：此部分所有步骤均应在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心细胞 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清，用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞两次。</li>
	<li>将细胞重悬于 250 µL（总体积）冷 PBS 中。</li>
	<li>在轻轻涡旋混匀试管的同时，逐滴缓慢加入 800 µL 预冷至 -20 °C 的 100% 乙醇。最终乙醇浓度为 70 - 80%。 
	注意：此步骤建议使用高纯度乙醇。</li>
	<li>将细胞置于冰上孵育 30 分钟。 
	注意：此阶段细胞可在 4 °C 保存数天，或在 -20 °C 保存数月。</li>
</ol>
3. PI 染色
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并用 1 mL 冷 PBS 将细胞洗涤两次。</li>
	<li>吸除上清液后，将每个样品重悬于以下混合液中：1 mL PBS、5 µL 10 mg/mL RNaseA、50 µL 1 mg/mL 碘化丙啶（PI；使用前混匀）。调整细胞浓度至约 ~2 × 106 个细胞/mL。 
	注意：避光操作——PI 对光敏感。</li>
	<li>通过 35 µm 滤网过滤至 5 mL 聚苯乙烯管中，并用 Parafilm 封口。</li>
	<li>室温避光孵育 15–30 分钟。 
	注意：细胞现可进行 FACS 分析。如有需要，染色后的细胞可在 4 °C 避光保存至少 24 小时。</li>
</ol>
4. 分选
<ol>
	<li>使用流式细胞分选仪（FACS）对细胞进行分选。利用561 nm激光根据PI荧光强度区分细胞。根据流式细胞仪的配置，也可选用接近PI激发峰值535 nm的其他激光，如488 nm或532 nm。</li>
	<li>为获得最佳效果，应使用针对特定细胞大小推荐的最小喷嘴（对于大多数细胞 85 µm）。优先选择纯度模式而非得率。使用稳定且缓慢的流速，通常为每秒300-500个事件，鞘液压力为45 psi。</li>
	<li>通过设门，利用FCS散点图区分死细胞和亚细胞碎片（低FCS和高SSC） 与 SSC。通过绘制SSC-宽度（W）从活细胞中区分双联体 与 SSC-高度（H）后接 FSC-宽度（W） 与 FSC-H 图与 PI- W 与 PI-H（双联体将具有相同的H值但更大的W值）。对可存活的单细胞绘制代表细胞DNA含量的PI-Area（A）强度直方图。</li>
	<li>将细胞按G1期和S期进行分选，如图所示 图1S期的门控范围应较宽，并延伸至G1期和G2期，而G1期的门控范围应较窄，且尽可能远离S期。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术直方图；细胞周期分析；G1期，S期；PI染色；数据可视化。" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 基于PI荧光强度的细胞周期时相判定。该直方图显示小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）群体的细胞DNA含量分布（通过PI-Area测定）。利用标记的区域，根据DNA含量将细胞群体分为两个亚群：i）G1期细胞（2N DNA含量）和ii）S期细胞（2N–4N DNA含量）。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
注意：收集 G1 期细胞的目的是校正不同基因组区域间测序效率的偏差。另一种方法是使用同一种细胞类型中处于 G1 期阻滞的细胞。该方法可获得更纯净的结果（因其最大限度减少了 S 期细胞的污染），但可能引入因阻滞细胞与待测细胞之间遗传差异而导致的偏差。
<ol start="5">
	<li>在低温条件下进行分选，并将分选后的细胞收集至 1.5/2 mL 离心管中。分选后立即将离心管置于冰上。 
	注意：为提高 DNA 回收率，建议使用低吸附离心管，或使用含 4 - 5% BSA 的溶液在 4 °C 下孵育 1 - 3 小时进行预包被18。</li>
</ol>
5. DNA 纯化
<ol>
	<li>对于每个样品（G1 期和 S 期），使用 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA。 
	注意：使用商业试剂盒时，建议按照生产商说明，用 400 µL 洗脱缓冲液将 DNA 洗脱至 2 mL 离心管中以获得高产量。</li>
	<li>使用荧光计检测 DNA 浓度。 
	注意：通过 FACS 收集的 100,000 个哺乳动物细胞，通常可获得约 1 µg DNA。此步骤获得的 DNA 可在 4 °C 下短期保存数天，或在 -20 °C 下长期保存。</li>
</ol>
6. 超声处理
<ol>
	<li>将 DNA 转移至一个与所使用的磁力架兼容的 1.7 mL 离心管中。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用 2x SPRI 磁珠通过磁力架浓缩 DNA，并用 50 µL 洗脱缓冲液洗脱。</li>
	<li>使用聚焦式超声仪将 DNA 打断至平均目标片段峰值大小为 250 bp。对于 50 µL 的 DNA 样品，使用以下参数：50 W，20% 占空比，每脉冲 200 个循环，20 °C，120 秒。</li>
	<li>通过电泳检测打断后 DNA 的片段大小。推荐的片段分布范围为 200–700 bp，峰值约在 250 bp 处。 
	注意：此步骤后的 DNA 可在 4 °C 下短期保存数天，或在 -20 °C 下长期保存。</li>
</ol>
7. 文库构建与测序
注意：许多文库构建试剂盒和不同的测序平台应与我们所使用并在材料部分提及的平台具有相似的效果。事实上，过去曾使用与本方法非常相似的技术结合微阵列平台生成ToR图谱2。
<ol>
	<li>使用任何市售的文库制备试剂盒来制备文库。</li>
	<li>文库制备完成后，使用磁珠进行300 - 800 bp的片段大小选择。</li>
	<li>文库制备后，使用荧光计测量DNA浓度。</li>
	<li>使用电泳测量DNA片段大小。</li>
	<li>在任意测序平台上进行测序。 
	注意：建议每个样本至少测序1000万条读长。该测序深度相当于每约300 bp有一个读长（针对约3 Gb大小的基因组），足以实现50 - 100 kb分辨率的ToR测量。提高测序深度将减小窗口尺寸，从而可在更高置信度下提升分辨率。由于本方案仅收集覆盖度信息，因此无需进行成对末端测序。然而，成对末端测序可能有助于定位包含重复序列的读长。</li>
</ol>
8. 分析
注意：数据分析基于 A. Koren 所采用的方法 等19.
<ol>
	<li>使用 bowtie2 或任何可靠的短序列比对工具将测序数据比对到相应的基因组。将不同大小但具有相同覆盖度的染色体区域定义为在 G1 期样本中被 200 条读段覆盖的片段，并统计同一片段中 S 期读段的数量。</li>
	<li>计算每个片段的 S/G1 比值。这将生成一张显示基因组上 S/G1 比值大幅波动的图谱（图 3）。为验证 ToR 测量的可靠性，可将此图谱与 G1/G1 比值图谱（来自两次独立的 G1 期测量）进行比较，后者应平坦得多。</li>
	<li>通过从每个数值中减去所有片段（不包括 X 染色体）的平均值，并将结果除以所有片段 S/G1 比值的标准差，将数据标准化为均值为 0、标准差为 1。此步骤旨在转换为 z 分数，以便在不同实验之间进行比较。</li>
	<li>去除 UCSC 基因组浏览器列出的所有间隙区域，以及每个包含少于 15 个数据窗口的剩余间隙间片段。</li>
	<li>使用 Matlab 函数 csaps（参数设为 10−16）对剩余片段进行三次平滑样条拟合，并在每 100 kb 处进行插值。 
	注意：平滑与插值的参数应根据数据深度进行调整。也可使用其他合适的平滑方法和函数。</li>
	<li>在目视确认各重复实验的可靠性后，合并所有读段，并对合并后的数据执行上述相同流程，以计算更高分辨率的图谱。</li>
</ol>

<ol><li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011(2010).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li>
<li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319(2014).</li>
<li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+replication%3A+linking+epigenetics+to+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li>
<li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004(2012).</li>
<li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502(2013).</li>
<li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicating+by+the+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li>
<li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400(2012).</li>
<li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li>
<li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US5232828">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

原则上，任何可通过流式细胞术（FACS）分离出S期和G1期的增殖性真核细胞群体均可进行CNR-ToR分析（Rhind N. 和 Gilbert DM20综述）。本文所述方法已针对基因组大小约为3 Gb的哺乳动物细胞（如人和小鼠细胞）进行了优化。若需将其应用于其他真核生物，则需对CNR-ToR实验方案进行少量调整（如细胞制备和测序深度）。必须注意收集足够数量的S期细胞，因为这是限速步骤。因此，应先进行初步的细胞周期FACS分析，以确认实验的可行性，并验证S期细胞的数量。对于细胞周期不规则的细胞，建议预先用BrdU对细胞进行染色以标记分裂细胞，并按照抗BrdU试剂盒生产商的说明书操作至FACS步骤。通常情况下，细胞用10–20 µM BrdU染色30分钟。
建议每个实验设置生物学重复三次，以检测可能由细胞生长差异和分选过程不同引起的不一致结果。这对于识别不同细胞类型和条件下 ToR 图谱中的微小变化尤为重要。对于快速生长的细胞，每次重复建议使用一个 10 cm 的组织培养皿或培养瓶（含有约 2–5 × 106 个细胞...

哺乳动物的DNA复制受到严格调控，以确保在细胞周期中每条染色体精确地复制一次。复制按照高度有序的时序进行——多个较大的基因组区域（约兆碱基级别）在S期早期开始复制（称为早期复制区），而其他基因组区域则在S期中晚期复制（称为中期和晚期复制区）1。大部分基因组在所有组织中的复制时间相同（称为组成型复制时序区），而约30%至50%的基因组区域在不同组织之间2、细胞分化过程中3,4，以及在较小程度上的癌症转化过程中5，其复制时序会发生改变。此外，某些基因组区域表现为异步复制6,7,8，即两个等位基因之间的复制时序存在差异。
ToR 与多种基因组和表观基因组特征相关，包括转录水平、GC 含量、染色质状态、基因密度 等等。1,9ToR 还与突变率和突变类型相关10,11 因此，复制程序的紊乱与癌症相关联也就不足为奇了12,13ToR 与染色质结构之间的因果关系尚不清楚。一种可能是开放的染色质结构促进了早期复制。然而，另一种模型认为染色质是在复制过程中组装的，而 S 期起始和结束时存在的不同染色质调控因子导致了早期和晚期复制区域的差异性包装。1,14我们最近发现，ToR 通过影响不同基因组区域发生的突变类型，从而塑造了GC含量11.
荧光 原位 杂交（FISH）是用于在单个位点上测量ToR的主要方法。该方法通过计数表现出单一FISH信号的S期细胞所占百分比即可完成。 与 特定等位基因的双联体百分比15,16另一种方法是用BrdU对DNA进行脉冲标记，根据细胞在S期不同时间点的DNA含量进行分选，免疫沉淀含有BrdU的DNA，并通过qPCR检测沉淀DNA的丰度17.
基因组复制时间（ToR）作图可通过两种方法实现。第一种方法是上述基于BrdU免疫沉淀（BrdU-IP）方法的基因组版本，其中通过与微阵列杂交或深度测序，同时对整个基因组各组分中沉淀DNA的量进行定量。第二种方法为CNR-ToR，其原理是通过测量S期细胞中每个基因组区域的拷贝数，并以G1期细胞的DNA含量进行归一化。在该方法中，细胞通过FACS分选为非复制（G1期）和复制（S期）两组（图1）。G1期细胞在所有基因组区域具有相同的拷贝数，因此其DNA含量应一致。相反，S期的DNA拷贝数取决于ToR，因为早期复制区域在大多数细胞中已完成复制，其DNA含量加倍；而晚期复制区域在大多数细胞中尚未复制，因此其DNA含量与G1期细胞相似。因此，S期与G1期DNA含量的比值可反映ToR。每个基因组区域的DNA含量可通过与微阵列杂交或深度测序进行测定2,8。CNR-ToR方法的优势将在后文进一步讨论。
本文介绍了如图2所示的基于CNR-ToR方法的基因组ToR定位技术。文章详细讨论了从细胞收集到结果初步分析以及基因组ToR图谱构建的整个流程。本论文所述方案已在多种培养细胞类型中成功实施。未来对该方案的改进有望实现ToR在活体（in vivo）及稀有细胞类型中的定位作图。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛网帽&amp;nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNase-A 10 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind Eppendorf 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL MaxyClear 管&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>磁珠 - Agencourt AMPure XP&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>M系列&amp;nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L microTUBE AFA 纤维螺口管 6 x 16 mm</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 高灵敏度（HS）检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>电泳 2200 TapeStation 系统</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>测序 - Illumina NextSeq 系统</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy DNA 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom 磁力架</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>抗 BrdU/FITC 抗体</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS 分选仪</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS 软件</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

通过dna含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

基因组的复制发生在细胞周期的S期，这是一个受到高度调控的过程，以确保DNA复制的保真度。每个基因组区域在S期通过多个复制起点的同时激活而于特定时间进行复制。复制时间（ToR）与许多基因组和表观遗传特征相关联，并与突变率及癌症的发生有关。全面理解健康与疾病状态下基因组复制程序的完整图景，是未来的重要目标和挑战。
本文详细描述了&#34;通过S期与G1期拷贝数比率绘制基因组复制时间图谱&#34;的方法（以下简称：CNR-ToR），这是一种用于绘制哺乳动物细胞全基因组复制时间（ToR）图谱的简便方法。该方法基于S期细胞与G1期细胞之间的DNA拷贝数差异。CNR-ToR方法共分为6个步骤：1. 细胞准备并用碘化丙啶（PI）染色；2. 利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分选G1期和S期细胞；3. DNA纯化；4. 超声破碎；5. 文库构建与测序；以及6. 生物信息学分析。CNR-ToR方法操作快速简便，可获得高分辨率的DNA复制图谱。

典型的ToR图谱如图所示 图3 用于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。该图展示了分析过程，因为它同时显示了点状图（代表各个窗口的标准化S/G1比值，步骤8.3）和经三次平滑与插值处理后得到的曲线（步骤8.5）。
这类图谱可揭示复制程序的组织方式，该程序由两种类型的复制时间（ToR）区域拼接而成：i）大规模区域（数量级为兆碱基），在S期的早期、中期或晚期同时进行复制（CTR = 复制时间恒定区域）；以及 ii）复制时间转换区域（TTR），在这些区域中复制时间逐渐变化。CTR通过TTR相互连接，这两类复制组织共同覆盖整个基因组。
尽管ToR定位所用的测序覆盖度相对较低（每300 bp一个读段），所获得的定位图仍相当稳健。图4展示了MEF细胞三组重复样本之间的ToR图谱与小...

本文介绍一种相对快速且简便的方法，用于绘制哺乳动物全基因组复制时间图谱，涵盖从细胞分离到测序结果基础分析的全过程。按照本方案操作后，将获得一份代表性复制程序的基因组图谱。

通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

基因组的复制发生在细胞周期的S期，这是一个受到高度调控的过程，可确保DNA复制的保真度。每个基因组……

本实验的总体目标是绘制所选细胞的全基因组复制时序程序。该方法有助于回答复制研究领域中的关键问题，例如，基因组复制程序在健康与疾病状态下的变化方式。该技术的主要优势在于，它是一种快速且简便的方法，可用于在各种细胞及条件下绘制复制时间图谱。编写传真程序的主要负责人是医学系的传真专家 Dan Lehmann。该程序通常至少需要一到两乘以十的六次方个快速生长的非同步细胞作为起始材料。对于贴壁细胞，吸除液体，并用三毫升不含钙和镁的 PBS 洗涤每块培养板。弃去 PBS，向每块培养板中加入一毫升商品化胰蛋白酶-EDTA 溶液。在 37 摄氏度孵育五分钟，直至细胞脱落。加入 3 毫升培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞收集到 15 毫升锥形管或 5 毫升聚苯乙烯管中。将细胞置于冰上保存。开始此操作时，在 4 摄氏度条件下以 300 × g 离心 5 分钟。吸弃上清，用1毫升冷PBS洗涤细胞，随后离心收集细胞。第二次洗涤后，弃去PBS，将细胞重悬于250微升冷PBS中。在轻轻涡旋振荡离心管的同时，逐滴缓慢加入 800 微升 -20 摄氏度的 100% 高纯度乙醇。这将使乙醇终浓度达到 70% 至 80%。将细胞置于冰上孵育 30 分钟。将固定后的细胞在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 10 分钟，开始此操作。小心吸除上清液，并用 1 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后均需离心沉淀细胞。第二次洗涤后，吸除上清液，并用以下 PI 混合液重悬每个细胞。混合液包含 1 毫升 PBS，其中加入 5 微升浓度为 10 毫克/毫升的 RNA酶A，以及 50 微升浓度为 1 毫克/毫升的碘化丙啶。将样品通过 35 微米滤网过滤至 5 毫升聚苯乙烯管中。用封口膜密封试管。室温孵育15至30分钟。将样品避光保存，因为碘化丙啶对光敏感。将使用分选仪对细胞进行分选。使用561纳米激光器根据细胞的碘化丙啶荧光强度来区分细胞。为获得最佳效果，应选用针对特定细胞大小推荐的最小喷嘴。对于大多数细胞，其大小为85微米。使用稳定且缓慢的流速，通常每秒最多300至500个事件。通过设门（Gating），绘制FCS与SSC的散点图，以区分死细胞和亚细胞碎片。从活细胞中，通过绘制SSC宽度与SSC高度的散点图，接着绘制FFC宽度与FFC高度的散点图，以及碘化丙啶（propidium iodide）宽度与碘化丙啶高度的散点图，来区分双联体（doublets）。对于活的单个信号细胞，绘制碘化丙啶面积强度的直方图，该直方图代表细胞的DNA含量。在低温条件下将细胞分选为 G1 期和 S 期。S 期的门控范围应较宽，并延伸至 G1 期和 G2 期区域；而 G1 期的门控范围应较窄，尽可能远离 S 期。对于某些细胞类型，可能难以获得理想的细胞周期分布。最关键的是获取不含S期细胞的G1期细胞。将分选后细胞的试管从传真机中取出。分选后将离心管置于冰上。细胞分选完成后，按照生产商说明书，使用商品化的DNA纯化试剂盒对每个样品的DNA进行纯化。接着，使用聚焦式超声波破碎仪将DNA打断，目标平均片段大小为250个碱基对。通过电泳验证剪切后DNA的片段大小。推荐的片段长度分布为200至700个碱基对，峰值约在250个碱基对处。随后，按照文本方案中的描述进行文库构建、测序和分析。展示了小鼠胚胎成纤维细胞中整条一号染色体的复制时间图谱。图为约50兆碱基区域的放大视图。每个点代表各个窗口中S期与G1期信号的标准化比值，实线代表经三次平滑插值法计算得到的结果。高S/G1值对应早期复制，而低值对应晚期复制。红色箭头指向复制时间恒定区域的示例，绿色箭头指向时间转换区域的示例。该图显示了小鼠胚胎成纤维细胞三组重复样本之间复制时间图谱的可重复性，并与小鼠前B细胞在小鼠1号染色体相同18兆碱基区域内的三组重复样本进行比较。橙色箭头指向不同细胞系之间的差异区域示例。六个样本间斯皮尔曼相关性的热图进一步验证了这些结果。一旦掌握，该技术从细胞收集到图谱生成，若操作得当，可在一周内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何为生长中的细胞构建复制时间基因组图谱。

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科研

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Genetics

遗传学

通过DNA含量测定的哺乳动物复制时序的全基因组的测定

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。...

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。...

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

DT40 是一种模式脊椎动物遗传系统，为分析蛋白质功能提供了强有力的工具。本文介绍一种简单的方法，可在单分子水平上对 DT40 细胞 S 期期间影响 DNA...

利用DNA纤维技术在脊椎动物模型系统DT40中可视化DNA复制

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位...

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。...

使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

我们描述了一种将流式细胞术与高通量测序相结合的技术，用于鉴定基因组中晚期复制的区域。...

G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

该方法有助于分析纳米颗粒存在下DNA复制动态的变化。可根据感兴趣材料的细胞毒性水平选择不同的方法。此外，还提供了图像分析的描述，以辅助进行DNA纤维分析。...

纳米颗粒诱导的DNA损伤与修复动态研究中DNA纤维实验的演示

蛋白相关新生DNA富集与测序技术（eSPAN）旨在检测染色质相关蛋白在两条复制DNA链上的相对丰度，从而揭示染色质复制及其偶联过程的分子机制。本实验方案描述了在酵母和小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行eSPAN的操作步骤。...

通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

本文概述了利用二维凝胶电泳分析通过致病性、易形成结构的重复序列进行复制进程的实验步骤。...

基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

了解CNR-ToR方法，利用FACS分选和DNA测序技术快速绘制哺乳动物全基因组复制时序图谱。该技术通过比较S期与G1期细胞的DNA含量差异，可在约一周内完成高分辨率分析，适用于多种细胞类型和疾病研究。

通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

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