Name: 可诱导T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习利用可诱导T7 RNA聚合酶介导的pMGX系统，在大肠杆菌中实现多基因共表达。该方法可构建多基因合成操纵子，用于同步表达多种蛋白质，助力合成生物学与生物化学研究。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。

1. 获取目的基因
<ol>
	<li>设计合成基因。
	<ol>
		<li>优化基因序列以适用于 E. coli 表达。</li>
		<li>从序列中去除任何有问题的限制性酶切位点（AvrII、NdeI、EcoRI 和 XbaI）。</li>
		<li>引入用于克隆的限制性酶切位点；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选质粒的多克隆区域（图 S1-S4）。如需要，可加入 5′ 或 3′ 编码标签以用于 Western 印迹检测。</li>
		<li>将设计好的基因进行商业合成订购。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用平末端克隆试剂盒将基因平末端克隆至平末端载体中；或设计引物扩增该基因（然后进入步骤 1.2.2）；或在基因两端添加额外的 5′ 和 3′ 末端以便直接克隆至 pMGX 质粒，并进入步骤 2。本文代表性结果来自将目标基因进行平末端克隆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增目标基因（来自已设计并优化的合成基因，或含有目标基因的模板 DNA）15。
	<ol>
		<li>设计带有克隆用限制性酶切位点的引物；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选质粒的多克隆区域（图 S1-S4）。如需要，可加入 5′ 或 3′ 编码标签以用于 Western 印迹检测。</li>
		<li>通过 PCR 扩增目标基因15。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物16。</li>
		<li>若出现非特异性扩增，通过凝胶回收法纯化扩增的基因；若无非特异性条带，则使用酶反应纯化试剂盒进行纯化。</li>
		<li>使用分光光度计在 260 nm 处检测吸光度以定量 DNA；以洗脱缓冲液作为空白对照17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将目的基因克隆至多基因表达系统载体 pMGX18
<ol>
	<li>用 NdeI 和 EcoRI 对获得的目的基因和所需的载体 pMGX 进行限制性酶切。 
	注意：如果回收到大量重新环化的质粒，请在加入 EcoRI 前让 NdeI 酶切反应进行 1 小时。
	<ol>
		<li>使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg DNA 和每种酶各 1 µL，以及 4 µL 相应的 10x 缓冲液。</li>
		<li>对于 NdeI 和 EcoRI 双酶切，使用 EcoRI 缓冲液，先加入 NdeI 内切酶，在 37 °C 下酶切 1 小时；然后加入 EcoRI 内切酶，继续反应 1 小时。由于 NdeI 对靠近 DNA 末端的切割位点较为敏感，若先用 EcoRI 酶切可能会影响 NdeI 的有效切割。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将限制性酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳（对于 1 kb 的基因，使用 0.7% 琼脂糖凝胶，110 V 电泳 55 分钟；针对不同大小的基因选择合适的琼脂糖浓度，请参考文献16）。</li>
	<li>使用洁净的手术刀或剃须刀片切下插入片段和载体条带，并将切下的凝胶片段放入 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>根据试剂盒制造商的操作说明，使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA。</li>
	<li>按照插入片段与载体摩尔比为 3:1 的比例，将目的基因连接至 pMGX 载体中；同时设置一个不含插入片段的 pMGX 载体的阴性连接对照。
	<ol>
		<li>配置 20 µL 连接反应体系，包含 1 µL T4 DNA 连接酶、0.15–0.5 µg 载体 DNA（约 5 µL），以及根据 3:1 的插入片段/载体比例和待插入基因大小计算出的适量插入片段；pMGX 载体骨架的大小介于 5,312 至 5,504 bp 之间。设置一个除目的基因外其余组分均相同的阴性对照反应。确保阴性对照连接反应与含插入片段的连接反应中所用的载体 DNA 量相等。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将连接产物转化至 XL1-Blue 感受态大肠杆菌（E. coli）中，获得重组质粒 pMGX-yfg1（含目的基因 1）、pMGX-yfg2（含目的基因 2）… pMGX-yfgn（含目的基因 n）。操作过程中采用无菌技术（在生物安全柜内或火焰旁进行）。
	<ol>
		<li>将化学感受态 XL1-Blue E. coli 细胞（100 µL 分装）置于冰上融化 5 分钟，然后加入 5 µL 连接反应产物，冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 42 °C 水浴中热激 45 秒，随后加入 200 µL 冷 LB 培养基，再冰上孵育 2 分钟。</li>
		<li>在 37 °C、220 rpm 条件下振荡培养 1 小时，然后取 100 µL 菌液涂布于含有适当筛选标记（氨苄青霉素或卡那霉素）的 LB 琼脂平板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选阳性转化子克隆。
	<ol>
		<li>比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。理想的菌落比例应大于 1:2。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 2.1 并参考相关注意事项。</li>
		<li>根据阴性对照与连接组的菌落数比例，从每个不同基因的连接反应中挑选 4–8 个单菌落（1–n）用于筛选，分别接种至含相应抗生素的 4 mL LB 液体培养基中，37 °C、220 rpm 振荡过夜培养。</li>
		<li>根据试剂盒制造商的操作说明，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA。</li>
		<li>设置 20 µL 的 NdeI + EcoRI 双酶切反应体系，包含 150–500 ng DNA、每种酶各 1 µL 及 2 µL 相应的 10x 缓冲液。在此反应中，NdeI 和 EcoRI 应同时加入，以便确认目的基因位于两个限制性酶切位点之间。建议设置一个空载体 pMGX 的阴性对照。在 37 °C 水浴中酶切 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将基因2插入含有基因1的pMGX载体pMGX-yfg1
<ol>
	<li>用 AvrII 酶切 pMGX-yfg1，并用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理。
	<ol>
		<li>使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg 载体 DNA（约 5–10 µL 提取的 DNA）和 1 µL AvrII 酶，以及 4 µL 相应的 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 1.5 小时，然后加入 1.5 µL CIP，继续在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 AvrII 和 XbaI 酶切 pMGX-yfg2，以释放目的基因。
	<ol>
		<li>使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg DNA，每种酶各 1 µL，并加入 4 µL 相应的 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将酶切产物在适当浓度（0.7%）的琼脂糖凝胶上进行电泳，使用洁净的手术刀或刀片切下插入片段和载体条带（参见步骤 2.2–2.3）。</li>
	<li>按照试剂盒生产商的说明书，使用凝胶回收试剂盒提取 DNA，并对 DNA 进行定量17。</li>
	<li>按照插入片段与载体摩尔比为 3:1 的比例，将基因 2 连接到 pMGX-yfg1 中。同时设置一个不含插入片段的 pMGX-yfg1 酶切产物的阴性连接对照。操作方法同步骤 2.5。</li>
	<li>取 5 µL 连接反应产物，转化至 XL1-Blue 感受态 E. coli 细胞中，包括连接成功的质粒 pMGX-yfg1,2（含有目的基因 1 和 2）以及阴性对照 pMGX-yfg1，操作参见步骤 2.6。</li>
	<li>比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。理想的菌落比例应大于 1:2。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 3.1，检查 CIP 处理过程。</li>
	<li>根据阴性对照与连接组的菌落比例，从连接反应平板上挑选 4–8 个单菌落，分别接种于含适当抗生素的 4 mL LB 培养基中，在 37 °C、220 rpm 条件下过夜培养。</li>
	<li>按照试剂盒生产商的说明书，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA，并进行定量17。</li>
	<li>通过 EcoRI 酶切 pMGX-yfg1,2 来筛选第二个基因的有效插入。
	<ol>
		<li>使用 20 µL 酶切反应体系，其中包含 150–500 ng DNA、1 µL EcoRI 酶和 2 µL EcoRI 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否出现与基因 2 大小相符的条带（参见步骤 2.2）。需注意，基因可能以非预期的反向方向插入载体中。</li>
</ol>
4. 将第三个基因添加到含有基因1和基因2的pMGX载体中，即pMGX-yfg1,2
<ol>
	<li>用 AvrII 酶切 pMGX-yfg1,2，并用 CIP 处理，操作如步骤 3.1 所示。</li>
	<li>用 AvrII 和 XbaI 酶切 pMGX-yfg3，操作如步骤 3.2 所示。</li>
	<li>将限制性酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，使用洁净的手术刀或刀片切下插入片段和载体条带；参见步骤 2.2–2.3。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA，并对 DNA 进行定量17。</li>
	<li>按照 3:1 的插入片段与载体摩尔比，将基因 3 连接到 pMGX-yfg1,2 中，并设置一个不含额外插入片段的 pMGX-yfg1,2 酶切产物的阴性连接对照，操作如步骤 3.5 所示。</li>
	<li>将 5 µL 连接反应产物转化至 XL1-Blue 感受态 E. coli 细胞中，包括连接成功的质粒 pMGX-yfg1,2,3（包含目标基因 1、2 和 3）以及阴性对照 pMGX-yfg1,2，操作如步骤 2.6 所示。</li>
	<li>比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 4.1 并检查 CIP 处理过程。</li>
	<li>根据阴性对照与连接组的菌落数量比例，从连接反应平板上挑选 4–8 个单菌落，分别接种于含有适当抗生素的 4 mL LB 培养基中；在 37 °C、220 rpm 条件下过夜培养。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA。</li>
	<li>通过使用 EcoRI 对 pMGX-yfg1,2,3 进行限制性酶切，检测第三个基因是否成功插入，操作如步骤 3.10 所示。</li>
	<li>将酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳；观察是否出现与基因 2 和基因 3 大小相符的条带（参见步骤 2.2）。注意：基因 3 可能以不期望的反向插入载体中。若基因 2 与基因 3 大小相同，则需选择另一个合适的限制性酶切位点用于筛选。 
	注意：根据需要，对每个新基因重复上述步骤。</li>
</ol>
5. 利用多基因表达系统产生目的蛋白并通过蛋白质印迹法评估表达水平
<ol>
	<li>将包含所有目的基因的阳性克隆转化至化学感受态、用于蛋白表达的菌株中 E. coli，例如 BL21-(λDE3)。
	<ol>
		<li>解冻100 µL化学感受态BL21-(λDE3)菌液 E. coli 冰上孵育5分钟，然后加入1 µL阳性克隆质粒DNA；冰上孵育30分钟。</li>
		<li>将细胞在42 °C水浴中热激45秒，然后加入200 µL预冷的LB培养基。冰上孵育2分钟。</li>
		<li>在37 °C、220 rpm条件下振荡培养细胞1小时，然后取100 µL菌液涂布于含有适当选择标记（氨苄青霉素或卡那霉素）的LB琼脂平板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达蛋白。
	<ol>
		<li>从B21-(λDE3)转化平板上挑取单克隆菌落，接种于含相应抗生素的4 mL LB培养基中，于37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。</li>
		<li>使用1 mL过夜培养物接种100 mL含适当抗生素的LB培养基。</li>
		<li>在37 °C、220 rpm振荡培养至OD600 0.6。</li>
		<li>用100 µM IPTG诱导培养，在25 °C、220 rpm条件下培养15小时。</li>
		<li>取1 mL培养物，于13,000 x g离心1分钟，弃上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用裂解液按照制造商说明书裂解细胞，对可溶性细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，以确定所有蛋白是否成功表达19.</li>
</ol>

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多个基因的共表达正变得日益重要，特别是在表征和重建复杂的多基因代谢通路方面3,4,5。pMGX系统使在E. coli中进行多基因共表达成为常规操作6,7,8，并为不同研究者提供了便捷的工具。本研究展示了利用pMGX-A单个质粒系统可同时表达五种目标蛋白。目前许多可用的共表达系统仅允许插入两个基因，从而构建双顺反子质粒，例如pET Duet载体12。若需引入更多基因，则必须使用带有不同筛选标记的多个双顺反子载体。与其他多基因表达系统相比，pMGX系统可轻松将多个基因克隆至同一质粒中，并能够在无需不同供体质粒或去除基因内部多个限制性酶切位点的情况下重复使用限制性酶切位点1...

多种蛋白质的共表达正变得日益重要，尤其在合成生物学应用中，需要同时表达多个功能模块1；在研究蛋白质-蛋白质复合物时，其表达与功能通常依赖于共表达2,3；以及在表征和利用生物合成途径时，通路中的每个基因都必须表达4,5,6,7,8。目前已开发出多种用于共表达的系统，尤其是在实验室重组蛋白表达的常用宿主生物Escherichia coli中9。例如，可使用带有不同可筛选标记的多个质粒，通过大量不同的表达载体分别表达各个蛋白质10,11。用于多蛋白表达的单质粒系统则可采用多种策略：使用多个启动子分别调控各基因的表达10,12；采用合成操纵子，将多个基因编码在同一转录本中2,13；或在某些情况下，使用单个基因编码一条多肽链，随后通过蛋白水解加工产生成熟的目标蛋白质14。
<img alt="双顺反子构建图解，DNA 酶切，基因克隆的连接过程，质粒载体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：pMGX 工作流程展示多顺反子载体的构建。 pMGX 系统提供了一种灵活且易于使用的策略，用于在可诱导的 T7 启动子控制下构建合成操纵子。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究描述了一种高效系统的使用方法，该系统用于在可诱导的T7 RNA聚合酶控制下构建多基因合成操纵子（图1）。该系统能够在单个质粒上同时表达多个基因。该系统基于一种最初称为pKH22的质粒系统，已在多种不同应用中成功使用6,7,8。本文进一步扩展了该质粒系统，新增四种相关载体：pMGX-A，一种无C端或N端标签、带有氨苄青霉素抗性标记的表达载体；pMGX-hisA，一种编码N端六聚组氨酸标签、带有氨苄青霉素抗性标记的表达载体；pMGX-K，一种无C端或N端标签、带有卡那霉素抗性标记的表达载体；以及pMGX-hisK，一种编码N端六聚组氨酸标签、带有卡那霉素抗性标记的表达载体。本研究展示了利用pMGX系统（特别是pMGX-A）构建包含五个基因的多顺反子载体的方法，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中成功实现了各个蛋白质的独立表达。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶（CIP）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II 融合 DNA 聚合酶</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX 免染蛋白凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE 缓冲液</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 化学感受态细胞</td><td></td><td></td><td>实验室自制感受态细胞</td></tr><tr><td>B-PER 细菌蛋白提取试剂</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>随聚合酶提供</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒，由 VWR 提供，货号：CA101318-972</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His 标签抗体 [HRP]，单克隆抗体，小鼠来源</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光 HRP 底物</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>巴氏杀菌脱脂奶粉</td><td>本地杂货店</td><td></td><td>普通杂货店品牌奶粉即可满足要求</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>PT 型膜，孔径 0.45 &amp;micro;m，尺寸 200 mm × 4 m，由 VWR 提供，货号：CA10061-086</td></tr><tr><td>质粒 DNA 提取试剂盒</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A 质粒 DNA 小量提取试剂盒 I，由 VWR 提供，货号：CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy 实验室</td><td></td><td>请联系 Boddy 实验室获取，邮箱：cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>根据目标基因设计所需引物</td></tr><tr><td>合成基因</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>根据需要进行设计和优化</td></tr><tr><td>厚型印迹滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 化学感受态细胞</td><td></td><td></td><td>实验室自制感受态细胞</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽 - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra 垂直电泳槽</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>恒温培养箱（烘箱）</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna 剃刀</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>电源模块</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>透射紫外灯</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal，由 Sigma 提供</td></tr><tr><td>紫外面罩</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western 转膜装置</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot 转膜槽</td></tr></tbody></table>

可诱导的t7 rna聚合酶介导的多基因表达系统，pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

多蛋白共表达在合成生物学、蛋白质-蛋白质复合物研究以及生物合成途径的表征与利用中正变得日益重要。本文描述了一种高效系统的应用，该系统可用于构建由可诱导T7 RNA聚合酶调控的多基因合成操纵子。此系统能够实现单个质粒上多个基因的同时表达。本文公开了一组四种相关的载体：pMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-K 和 pMGX-hisK，它们分别携带氨苄青霉素或卡那霉素抗性筛选标记（A 和 K），并可选择是否含有N端六组氨酸标签（his）。文中提供了利用该载体系统构建合成操纵子的详细实验方案及相关数据，结果表明，基于pMGX的系统可轻松构建包含五个基因的表达体系，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中成功表达全部五种编码蛋白。该系统与实验流程使研究人员能够常规地在大肠杆菌（E. coli）中表达复杂的多组分模块和代谢途径。

本研究旨在从单个质粒中共同表达五种蛋白质。编码N端或C端六组氨酸标签的五段密码子优化的合成基因片段通过商业途径购得。通过PCR扩增合成基因，并分别克隆至PCR-blunt载体中进行测序。为构建多顺反子质粒，首先将五个目的基因依次克隆至合适的pMGX质粒（pMGX-A）中。 图2 显示 PCRBlunt-yfg1 和 PCRBlunt-yfg2 除了用 NdeI + EcoRI 消化的 pMGX-A 外（见步骤 2）。为了将前两个基因克隆到 pMGX-A 中，将质粒用 NdeI + EcoRI 消化（图2）。将目的基因克隆至 pMGX-A 载体后，新构建的质粒命名为 pMGX-yfg1 和 pMGX-yfg2用 AvrII + XbaI 进行酶切消化，以确认获得成功的克隆，结果如所获得的 1.1-kb 和 1.3-kb 条带所示 图3</str...

本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX 质粒系统。

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

多种蛋白质的共表达在合成生物学、蛋白质-蛋白质复合物研究以及蛋白质功能表征与利用中正变得日益重要……

本实验的总体目标是构建由可诱导T7 RNA聚合酶调控的多基因合成操纵子，以实现多个蛋白质的同步表达。该方法可为合成生物学和生物化学领域的研究人员提供帮助，使其能够构建多蛋白代谢通路或研究依赖于共表达的蛋白复合物。该技术的主要优势在于，能够在大肠杆菌中通过单个质粒实现多个基因的同步表达。来自我实验室的博士生 Mohamed Hassan 和合作项目学生 Angela Thompson 将演示该实验流程。根据文本方案获取并扩增目的基因后，准备第一个目的基因和 pMGX 载体的酶切反应。使用总体积为 40 微升的反应体系，其中包含 0.5 至 1.5 微克 DNA 和相应的限制性内切酶。将反应体系在 37 摄氏度孵育 1 小时。然后加入 EcoRI，并让酶切反应继续进行额外 1 小时。为确保 NdeI 有效酶切，需在 EcoRI 之前加入 NdeI。NdeI 对限制性酶切位点两侧双链 DNA 的长度敏感。先加入 NdeI 可确保其切割全长的环状质粒。将酶切反应产物上样至 0.7% 琼脂糖凝胶中，在 100 伏电压下电泳 55 分钟。然后，使用洁净的手术刀或剃须刀片切下插入片段和载体条带，并将切下的凝胶片段放入1.5毫升离心管中。按照说明书使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。设置一个20微升的连接反应体系，其中包含0.15至0.5微克的载体DNA、适量的插入片段（根据基因大小确定）以及1微升T4 DNA连接酶。在无菌条件下，将100 µL化学感受态XL1-Blue E.coli细胞分装液置于冰上融化5分钟。然后向细胞中加入5 µL含有目的基因的连接反应产物。将转化反应体系置于冰上孵育30分钟。接下来，将细胞在42摄氏度水浴中热激45秒。然后将转化产物放回冰上，加入200 µL预冷的LB培养基。让细胞在室温下孵育2分钟。将细胞在37摄氏度、220转/分钟的条件下孵育1小时，取100微升涂布于含有适当选择标记的LB琼脂平板上。为筛选可能的转化子菌落，需比较阴性对照组与连接反应组平板上的菌落数量。理想的菌落计数比例为1至2。从每个连接反应中挑选四到八个单菌落，接种于4毫升含有适当抗生素的LB培养基中。将培养物在37°C、220转/分钟条件下过夜培养。使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的方案纯化质粒DNA，并用150至500纳克DNA进行20微升的酶切反应，每种酶NdeI和EcoRI各加入1微升。将消化反应在 37 摄氏度孵育两小时。为了将第二个基因插入含有第一个基因的 pMGX 载体中，设置一个 40 微升的消化反应体系，其中包含 0.5 至 1.5 微克含有目的第一个基因的载体 DNA 和 1 微升 AVR2。将反应体系在 37 摄氏度孵育 1.5 小时，然后加入 1.5 微升小牛肠磷酸酶。再孵育30分钟。接下来，设置一个40微升的消化反应体系，其中包含0.5至1.5微克含有目的第二个基因的pMGX载体。使用1微升AVR2和xpol。将反应在 37 °C 下孵育两小时。将限制性消化产物在 0.7% 琼脂糖凝胶上进行电泳。使用干净的手术刀刀片切下插入片段和载体条带，操作方法如前所述。根据文本方案提取质粒DNA并测定样品浓度后，使用基因2与pMGX-yfg1以3:1的插入片段与载体比例进行连接反应。同时设置仅使用pMGX-yfg1的阴性对照。将各反应体系中的5 µL转化至XL1-Blue感受态细胞中，操作步骤如前所述。然后比较阴性对照组和连接反应组平板上的菌落数量。如果阴性对照组平板上出现大量菌落，请重新检查CIP处理步骤。从连接反应组中挑选4至8个单菌落，每个菌落接种于4 μL含相应抗生素的LB培养基中。在37摄氏度、220转/分钟条件下过夜培养。按照前述方法提取并定量质粒DNA后，通过设置含有150至500纳克DNA和1微升EcoRI的酶切反应，筛选第二个基因的有效插入。将反应体系在37摄氏度孵育两小时。建议使用EcoRI进行筛选，但在某些情况下，EcoRI可能产生两个或多个大小相似的插入片段，这些片段在凝胶上难以区分。为确保成功，应使用其他限制性内切酶（如NdeI）进行替代。将消化反应产物在琼脂糖凝胶上分离，观察是否存在与插入基因2大小相符的条带。根据文本方案将其他基因克隆到质粒中。为了构建多顺反子质粒，首先将五个基因依次克隆至合适的质粒 pMGX A 中。本图显示了 pCR-Blunt-yfg1 和 pCR-Blunt-yfg2 在 pMGX A 质粒中的情况，以及用 indel 和 EcoRI 消化后的 pMGX A。为了将前两个基因克隆到 pMGX A 中，该质粒使用 indel 和 EcoRI 进行了消化。克隆后，对 pMGX-yfg1 和 pMGX-yfg2 进行 AVR2 和 xpol 酶切，以确认成功获得克隆。本图显示了用 AVR2 酶切的 pMGXyfg1 载体，以及用 AVR2 和 xpol 酶切的 pMGX-yfg2 载体，以分离第二个目的基因。将所得插入片段克隆至 pMGX-yfg1，构建 pMGX-yfg1 two 载体。如图所示，用 EcoRI 酶切 pMGX-yfg1 质粒二号，证实了目的基因二号已成功克隆至 pMGX-yfg1 载体中。该凝胶图像展示了插入片段处于正确方向与反向时，酶切后质粒之间的差异。若插入片段为反向，则两个 EcoRI 酶切位点将彼此靠近，导致酶切后产生的 50 个碱基对片段在凝胶电泳中无法被检测到，而载体主链则显得更大。最后，构建五基因多顺反子表达载体后，通过蛋白质印迹检测表达的蛋白，证实所有五种蛋白均来自单个载体。注意，yfg5 所表达的蛋白与 yfg1 大小相同，在凝胶电泳中未能分开。若操作正确，掌握该技术后，每向 pMGX 载体中插入一个基因，可在三至四天内完成整个流程。在进行该实验操作时，重要的是要记住使用磷酸酶（如小牛肠碱性磷酸酶）对载体进行处理并使其线性化，以去除载体DNA 5'端的磷酸基团。完成该步骤后，可进一步开展体内多基因表达等实验，用于表征并利用生物合成途径来生产天然产物，或研究蛋白质-蛋白质复合物。该技术为合成生物学领域的研究人员提供了实现复杂碳水化合物合成以及大肠杆菌基因工程改造的途径。观看本视频后，您应能充分理解如何在大肠杆菌中实现多基因表达系统。

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科研

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Genetics

遗传学

可诱导T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

来源： 贝伦斯，C. 等 应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰 视频实验杂志 (2015)本视频演示了利用可诱导表达系统来确定细菌效应蛋白 CaeB 在宿主细胞凋亡级联反应中的干扰位点。该方法概述了使用四环素响应系统转染表达 CaeB...

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学习利用可诱导T7 RNA聚合酶介导的pMGX系统，在大肠杆菌中实现多基因共表达。该方法可构建多基因合成操纵子，用于同步表达多种蛋白质，助力合成生物学与生物化学研究。

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

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