可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

本实验的总体目标是构建由可诱导T7 RNA聚合酶调控的多基因合成操纵子，以实现多个蛋白质的同步表达。该方法可为合成生物学和生物化学领域的研究人员提供帮助，使其能够构建多蛋白代谢通路或研究依赖于共表达的蛋白复合物。该技术的主要优势在于，能够在大肠杆菌中通过单个质粒实现多个基因的同步表达。

来自我实验室的博士生 Mohamed Hassan 和合作项目学生 Angela Thompson 将演示该实验流程。根据文本方案获取并扩增目的基因后，准备第一个目的基因和 pMGX 载体的酶切反应。使用总体积为 40 微升的反应体系，其中包含 0.5 至 1.5 微克 DNA 和相应的限制性内切酶。

将反应体系在 37 摄氏度孵育 1 小时。然后加入 EcoRI，并让酶切反应继续进行额外 1 小时。为确保 NdeI 有效酶切，需在 EcoRI 之前加入 NdeI。

NdeI 对限制性酶切位点两侧双链 DNA 的长度敏感。先加入 NdeI 可确保其切割全长的环状质粒。将酶切反应产物上样至 0.7% 琼脂糖凝胶中，在 100 伏电压下电泳 55 分钟。

然后，使用洁净的手术刀或剃须刀片切下插入片段和载体条带，并将切下的凝胶片段放入1.5毫升离心管中。按照说明书使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。设置一个20微升的连接反应体系，其中包含0.15至0.5微克的载体DNA、适量的插入片段（根据基因大小确定）以及1微升T4 DNA连接酶。

在无菌条件下，将100 µL化学感受态XL1-Blue E.coli细胞分装液置于冰上融化5分钟。然后向细胞中加入5 µL含有目的基因的连接反应产物。将转化反应体系置于冰上孵育30分钟。

接下来，将细胞在42摄氏度水浴中热激45秒。然后将转化产物放回冰上，加入200 µL预冷的LB培养基。让细胞在室温下孵育2分钟。

将细胞在37摄氏度、220转/分钟的条件下孵育1小时，取100微升涂布于含有适当选择标记的LB琼脂平板上。为筛选可能的转化子菌落，需比较阴性对照组与连接反应组平板上的菌落数量。理想的菌落计数比例为1至2。

从每个连接反应中挑选四到八个单菌落，接种于4毫升含有适当抗生素的LB培养基中。将培养物在37°C、220转/分钟条件下过夜培养。使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的方案纯化质粒DNA，并用150至500纳克DNA进行20微升的酶切反应，每种酶NdeI和EcoRI各加入1微升。

将消化反应在 37 摄氏度孵育两小时。为了将第二个基因插入含有第一个基因的 pMGX 载体中，设置一个 40 微升的消化反应体系，其中包含 0.5 至 1.5 微克含有目的第一个基因的载体 DNA 和 1 微升 AVR2。将反应体系在 37 摄氏度孵育 1.5 小时，然后加入 1.5 微升小牛肠磷酸酶。

再孵育30分钟。接下来，设置一个40微升的消化反应体系，其中包含0.5至1.5微克含有目的第二个基因的pMGX载体。使用1微升AVR2和xpol。

将反应在 37 °C 下孵育两小时。将限制性消化产物在 0.7% 琼脂糖凝胶上进行电泳。使用干净的手术刀刀片切下插入片段和载体条带，操作方法如前所述。

根据文本方案提取质粒DNA并测定样品浓度后，使用基因2与pMGX-yfg1以3:1的插入片段与载体比例进行连接反应。同时设置仅使用pMGX-yfg1的阴性对照。将各反应体系中的5 µL转化至XL1-Blue感受态细胞中，操作步骤如前所述。

然后比较阴性对照组和连接反应组平板上的菌落数量。如果阴性对照组平板上出现大量菌落，请重新检查CIP处理步骤。从连接反应组中挑选4至8个单菌落，每个菌落接种于4 μL含相应抗生素的LB培养基中。

在37摄氏度、220转/分钟条件下过夜培养。按照前述方法提取并定量质粒DNA后，通过设置含有150至500纳克DNA和1微升EcoRI的酶切反应，筛选第二个基因的有效插入。将反应体系在37摄氏度孵育两小时。

建议使用EcoRI进行筛选，但在某些情况下，EcoRI可能产生两个或多个大小相似的插入片段，这些片段在凝胶上难以区分。为确保成功，应使用其他限制性内切酶（如NdeI）进行替代。将消化反应产物在琼脂糖凝胶上分离，观察是否存在与插入基因2大小相符的条带。

根据文本方案将其他基因克隆到质粒中。为了构建多顺反子质粒，首先将五个基因依次克隆至合适的质粒 pMGX A 中。本图显示了 pCR-Blunt-yfg1 和 pCR-Blunt-yfg2 在 pMGX A 质粒中的情况，以及用 indel 和 EcoRI 消化后的 pMGX A。为了将前两个基因克隆到 pMGX A 中，该质粒使用 indel 和 EcoRI 进行了消化。

克隆后，对 pMGX-yfg1 和 pMGX-yfg2 进行 AVR2 和 xpol 酶切，以确认成功获得克隆。本图显示了用 AVR2 酶切的 pMGXyfg1 载体，以及用 AVR2 和 xpol 酶切的 pMGX-yfg2 载体，以分离第二个目的基因。将所得插入片段克隆至 pMGX-yfg1，构建 pMGX-yfg1 two 载体。

如图所示，用 EcoRI 酶切 pMGX-yfg1 质粒二号，证实了目的基因二号已成功克隆至 pMGX-yfg1 载体中。该凝胶图像展示了插入片段处于正确方向与反向时，酶切后质粒之间的差异。若插入片段为反向，则两个 EcoRI 酶切位点将彼此靠近，导致酶切后产生的 50 个碱基对片段在凝胶电泳中无法被检测到，而载体主链则显得更大。

最后，构建五基因多顺反子表达载体后，通过蛋白质印迹检测表达的蛋白，证实所有五种蛋白均来自单个载体。注意，yfg5 所表达的蛋白与 yfg1 大小相同，在凝胶电泳中未能分开。若操作正确，掌握该技术后，每向 pMGX 载体中插入一个基因，可在三至四天内完成整个流程。

在进行该实验操作时，重要的是要记住使用磷酸酶（如小牛肠碱性磷酸酶）对载体进行处理并使其线性化，以去除载体DNA 5'端的磷酸基团。完成该步骤后，可进一步开展体内多基因表达等实验，用于表征并利用生物合成途径来生产天然产物，或研究蛋白质-蛋白质复合物。该技术为合成生物学领域的研究人员提供了实现复杂碳水化合物合成以及大肠杆菌基因工程改造的途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何在大肠杆菌中实现多基因表达系统。