使用荧光抗体对小鼠表皮石蜡切片的免疫组织化学
2008年1月8日
我们描述了我们，在我们的实验室非常常规使用冷冻和石蜡切片修改表皮内的免疫定位可靠的方法。
在表皮中。免疫组化是将特定蛋白质定位到其表达区室的有效方法。在本视频中，我们展示了一种在表皮中免疫定位蛋白质的可靠方法，我们在实验室中经常使用该方法。
嗨，我是来自都灵博士实验室的 Tammy，位于渥太华健康研究所慢性病项目的低楼。今天，我们将向您展示一种在小鼠表皮的石蜡包埋组织切片上使用荧光抗体进行免疫组织化学的程序。在我们的实验室中，我们优化了使用 BO 的固定组织免疫定位表皮分化标志物的方案。
作为优化的一部分，我们在固定之前将皮肤放在纸巾上，以保持皮肤平整。该程序包括解剖表皮、固定、脱水、石蜡包埋和切片、脱蜡、再水化、抗原、暴露抗体标记，最后用落射荧光进行封片和可视化。那么让我们开始吧。
使用新生小鼠时，无需剃掉背部皮肤。但是，当您有有毛的老鼠时，您需要剃掉后皮，以免妨碍切割切片。当您进行解剖时，您需要非常小心，不要将镊子放在要用于检测的皮肤区域。
所以我们所做的是，我们只需将镊子放在我们要切割的地方的边缘，然后你非常小心地提起，切开表皮，记住不要触摸你想用于实验的区域。当我们修复皮肤时，我们不希望皮肤卷起并进入管中。我们希望它漂亮而平坦。
因此，为了帮助实现这一目标，我们将皮肤放在纸巾上，使其在固定时保持平整。所以现在我们在纸巾上已经把皮肤漂亮平整了，我们要做的是剪掉边缘或修剪它们，以去除我们可能被镊子损坏的部分。然后你把皮肤切成非常小的块，大约 2 毫米 x 2 毫米。
现在组织要被固定了。将皮肤切成易于处理的小块后，将其浸入 boin 溶液中。盖上试管，用 perfil 包裹试管，然后将它们放在摇杆上。
对于过夜孵育，重要的是在 boin 溶液中仅孵育 16 至 18 小时。较短或较长的固定期会损害您的组织。孵化结束了。
您用 PBS 冲洗组织，然后使用 30%、50% 和 70% 酒精进行一系列乙醇洗涤。您可以看到 BO 是黄色的，当您进行洗涤时，随着 boons 被稀释，洗涤的颜色变得越来越淡。每次 30 分钟，洗涤 2 次。
在乙醇中最后一次洗涤后，将样品置于新鲜的 70% 乙醇中，并可储存在 4 摄氏度下，直到进一步处理几次石蜡。嵌入。过度使用冷冻组织可以使组织完整性优越，并且样品可以长期储存。通常，核心设施产生的结果更具可重复性。
但是，如果您拥有设施和具有专业知识的专职作员，则可以在内部切割截面。学习剪出好的部分更像是一种艺术形式。因此，我们使用核心设施。
从核心设施收到载玻片后，您可以看到载玻片上存在石蜡。作为薄膜，将载玻片放在用铝箔包裹的架子上，就像烤土豆一样，并在 55 度下孵育 5 分钟。孵育结束后，快速解开载玻片，将载玻片放入甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
请务必记住，这些 5 分钟的垫圈应适时，孵育时间过长，甲苯对您的样品不利。三次洗涤和甲苯后，用 100% 乙醇快速冲洗。由于乙醇和甲苯会形成沉淀物，会干扰您的实验，因此这是一个需要记住的非常重要的步骤。
接下来，通过孵育玻片对样品进行再水化，在 95% 乙醇中 5 分钟，在 70% 乙醇中 5 分钟，然后在水中 2 次 5 分钟。此时，可以处理组织以使用 h 和 e 染色。为此，我们还使用核心设施。
用于抗原分离，将可怜的 500 密耳一次性柠檬酸盐缓冲液放入 1 升塑料烧杯中，然后浸入载玻片中。记得取下金属手柄并将烧杯放入微波炉中。用高功率微波 2 次 5 分钟。
记得在两次孵化之间打开门以冷却微波炉。微波加热完成后，从沸腾的柠檬酸盐缓冲液中取出载玻片，并将其放入装有温水的染色皿中。我们只使用温自来水，这样做的目的是将您的玻片从沸腾缓慢冷却到室温。
现在，您可以在 PBS 中洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，我们已准备好开始免疫组化。开始免疫染色时，我们需要做的第一件事是用一张薄纸擦干标本周围的区域。为了防止抗体交叉污染，我们用液体封闭剂划定样本周围的区域。
通过将滤纸放入培养皿中来准备加湿室。用水浸泡，去除多余的水并插入载玻片。我们使用加湿室的原因是为了确保在孵育期间我们的载玻片不会干涸。
幻灯片不要干燥非常重要，因为绘图会增加您的背景。此时用孵育缓冲液封闭玻片 30 分钟。封闭后，将玻片移回玻片架上，并在洗涤缓冲液中孵育。
像以前一样去除多余的缓冲液。将玻片放回加湿室中，与一抗孵育 1 小时。在室温下。
孵育 1 小时后，将玻片放回玻片架中，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。洗涤后，用纸巾去除标本周围多余的洗涤缓冲液。将玻片放回加湿室中，在室温下与二抗孵育 1 小时，与二抗孵育后，更换洗涤缓冲液 3 次，每次 15 分钟。
接下来，我们分 3 次 5 分钟洗涤。在 PBS 中，去除样品周围的多余液体，并将 PBS 从载玻片背面擦去，以将盖玻片安装到载玻片上。我们使用含有 2.5%DAB 的手机。
为了减少褪色，向载玻片中加入 80 微升滴加。小心不要引入任何气泡。然后在盖玻片上非常缓慢地降低。
注意不要留下任何气泡。气泡很糟糕，因为它们经常直接落在你的标本上，就在手机干燥后你想拍照的地方。现在你准备好去看看你的幻灯片了。
以下是使用 FITC 过滤器的成功染色。在 20 倍物镜中，我们看到 Clain 6 与表皮的所有超级基底层相关。我们实验室对 claudins 在表皮中的表达和定位非常感兴趣。
关于紧密连接和表皮通透性屏障的形成，我们刚刚向您展示了如何在小鼠皮肤上进行免疫组化。执行此程序时，请务必记住，您希望组织切片是平坦的，并且要确保载玻片在两次孵育之间不会变干。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种在表皮内可靠的蛋白质免疫定位方法，适用于冷冻和石蜡切片。该技术在实验室中常用于研究表皮分化标志物。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫组织化学
- 表皮生物学
- 蛋白质定位
背景
- 免疫组织化学对于定位特定蛋白质至关重要。
- 已针对表皮分化标志物优化了协议。
- 适当的固定和包埋对于组织完整性至关重要。
- 荧光抗体增强了蛋白质的可视化。
研究目的
- 展示一种可靠的免疫定位方法。
- 优化用于研究表皮分化的协议。
- 为研究人员提供详细的程序。
使用的方法
- 从小鼠皮肤中解剖和固定表皮。
- 石蜡包埋和切片。
- 抗原展示和抗体标记。
- 使用反荧光显微镜进行可视化。
主要结果
- 成功定位了表皮分化标志物。
- 使用优化的协议证明了结果的可重复性。
- 为表皮免疫组织化学提供了全面的指南。
- 强调了适当组织制备的重要性。
结论
- 该方法对蛋白质定位可靠且高效。
- 优化的协议可以增强实验结果。
- 这种方法可以适应各种研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Immunohistochemistry enables precise protein localization in epidermal layers, supporting target validation in dermatology and barrier function research. The method provides mechanistic de-risking by linking protein expression to functional compartments in mouse epidermis. Reliable staining improves predictive confidence in preclinical models of skin biology and permeability barrier formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by localizing proteins to basal, suprabasal, and stratum corneum compartments.
- Operational Value: Uses optimized paraffin and frozen section protocols to ensure reproducible antigen detection.
- Predictive Value: Supports functional inference of epidermal differentiation markers through subcellular expression patterns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence readouts for protein expression across epidermal layers.
- Reproducibility: Standardized fixation (Bouin’s or PFA) and antigen unmasking steps reduce variability between runs.
- Platform Reuse: Compatible with core facility processing and epi-fluorescence microscopy for scalable implementation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links tight junction proteins like claudin-6 to epidermal permeability barrier formation.
- Translational Continuity: Enables progression from discovery localization to preclinical validation of barrier function.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides spatial expression data to prioritize targets involved in skin integrity and dermatological disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of skin-related mechanisms.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by assigning proteins to specific epidermal compartments.
- Screening: Delivers standardized, quantitative immunofluorescence outputs for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Enables comparison of protein localization patterns across conditions using fluorescence intensity and layer-specific signals.
- Translational Research: Connects molecular localization to functional outcomes like barrier formation in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunohistochemistry pipeline for epidermal target validation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through compartment-specific protein localization.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, sectioning, and staining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in skin biology targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on epidermal expression and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, fixation, and sectioning to maintain epidermal integrity.
- Depends on access to core facilities for paraffin embedding, section cutting, and antigen unmasking.
- Necessitates optimization of antibody compatibility with Bouin’s or PFA fixation based on epitope sensitivity.
- Involves standardization of blocking, washing, and mounting steps to minimize background and preserve fluorescence.
- Limited by antibody availability and performance after harsh paraffin processing steps.
