Name: 幼虫斑马鱼性腺组织的解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习从17日龄斑马鱼幼虫中分离性腺组织的技术，用于分析分子特性并研究性别分化的发育机制。该方法为发育生物学和遗传学研究提供了重要的实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 C Zhang 在鱼类饲养方面提供的帮助。本研究由国家自然科学基金（项目编号：31171074、31371099 和 31571067，资助对象：GP）以及浦江人才计划（项目编号：09PJ1401900，资助对象：GP）提供支持。

斑马鱼实验已获得复旦大学实验动物福利与使用委员会的批准。斑马鱼的饲养和繁殖均按照标准程序进行20。
1. 准备工作
<ol>
	<li>培养17日龄和25日龄的幼年斑马鱼
	<ol>
		<li>在交配前一天傍晚，将2条雄性和2条雌性成年斑马鱼（健康，3至6月龄，实验室AB品系）转移至交配缸中，用隔板将雌雄分开。次日早晨更换缸内水体并移除隔板以允许其交配。受精后1至2小时，在100 mm培养皿中收集受精卵。</li>
		<li>在早期发育阶段（4天内），将约40个胚胎置于含40 mL胚胎培养基（EM）的100 mm培养皿中，于28.5 °C培养，并每天更换两次EM。自5日龄（dpf）起，将幼鱼转移至1 L的养殖缸中（每缸40条幼鱼，300 mL系统水），并以活体轮虫喂养（充足供应，每日两次）。自10 dpf起，改用活体丰年虾替代轮虫进行喂养。在14 dpf时将鱼转移至循环水养殖系统21。</li>
		<li>在循环水系统中继续培养幼年斑马鱼至17 dpf或25 dpf。确保光照/黑暗周期为14/10小时，系统水的pH值约为7.2。测量17 dpf幼鱼（体长5.5至6.8 mm）和25 dpf幼鱼（体长8至11 mm）的体长22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备2%琼脂板用于解剖。
	<ol>
		<li>将4 g琼脂加入200 mL无菌水中，在微波炉中加热至溶液透明。</li>
		<li>将琼脂溶液冷却约15分钟，然后倒入直径为60 mm的培养皿中（约为培养皿体积的1/3）。将凝固后的琼脂板储存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 方案1：解剖17日龄和25日龄幼鱼的性腺组织
<ol>
	<li>将碎冰加入容器中，以麻醉17 dpf的幼鱼。用小塑料勺将已麻醉的幼鱼转移至含有30 mL冷Ringer's溶液的100 mm预冷培养皿中。将鱼保持在预冷的Ringer's溶液中孵育至少15分钟，以确保幼鱼完全麻醉。</li>
	<li>用小塑料勺将幼鱼转移至预冷的琼脂平板上。将整个鱼体浸入10 mL预冷的Ringer's溶液中，并轻轻使其侧卧。</li>
	<li>在25X体视显微镜视野下进行以下操作。用镊子夹住鱼体主干以固定。用另一把镊子从肛门至心脏方向纵向撕开腹部。轻轻去除身体一侧的皮肤和肌肉，以暴露内脏器官。</li>
	<li>小心移除位于 swim bladder（鳔）腹侧的器官团块。注意避免损伤附着在 swim bladder 上的性腺组织。</li>
	<li>切断 swim bladder 与前部躯体之间的连接，轻柔地拉出整个 swim bladder 及其相连的性腺组织。 
	注：在17 dpf阶段，性腺组织通常包含周围的上皮组织和原肾管（protonephridium），这些结构彼此不易分离；但在25 dpf时可较容易分开。性腺还与肛门相连，在肛门处可见左右两侧性腺相互连接的交界结构。</li>
	<li>用镊子小心地将性腺组织从 swim bladder 上分离，并清除周围脂肪组织。</li>
	<li>立即将分离出的性腺组织转移至预冷的含有200 µL Ringer's溶液的1.5 mL离心管中。将离心管置于冰上，直至所有幼鱼的性腺组织均完成分离。</li>
	<li>按照步骤2.1 -&#160; 2.7所述方法解剖25 dpf幼鱼的性腺。</li>
</ol>
3. 方案2：分析分离性腺组织的基因表达
<ol>
	<li>从幼虫性腺组织中提取总RNA。
	<ol>
		<li>将分离的性腺组织转移至新的无RNase的1.5 mL离心管中，去除林格氏液。加入100 µL裂解液，涡旋振荡直至组织完全裂解。</li>
		<li>按照试剂盒说明书进行总RNA提取操作。</li>
		<li>向RNA溶液中加入1/10体积的10×DNase I缓冲液和1 µL DNase I，轻轻混匀。37 °C孵育20分钟。</li>
		<li>向RNA溶液中加入1/10体积的DNase失活试剂，70 °C孵育10分钟。使用分光光度计测定总RNA浓度。于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行第一链cDNA合成
	<ol>
		<li>使用oligo(dT)-连接引物，按照生产商的说明书进行第一链cDNA合成。将1至2 µg RNA加入反应体系，总体积为20 µL。</li>
		<li>在45 °C孵育反应液90分钟，随后在70 °C加热5分钟以终止反应。</li>
		<li>向cDNA溶液中加入1 µL RNase H，以去除残留的RNA。轻轻混匀后，在约13,000 × g离心10秒，37 °C孵育20分钟。加入20 µL无核酸酶水，于-70 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行荧光定量PCR
	<ol>
		<li>在带有荧光染料的PCR仪上进行qPCR。采用以下扩增程序：95 °C 15秒，Tm-5 °C 15秒，68 °C 30秒，共35个循环。引物序列如下：amh（正向：GTGGATGGCAGCAGTACGAC；反向：GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG），cyp19a1a（正向：GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG；反向：CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG），nanos3（正向：GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT；反向：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC），vasa（正向：ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT；反向：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）和β-actin（正向：AGTGCGACGTGGACATCCGTA；反向：GCACTTCCTGTGGACGATGGA）19。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

斑马鱼已成为一个强大的模式生物，被广泛应用于发育和疾病相关研究。成年斑马鱼器官（如脑、心脏、性腺和肾脏）的分离方法已有充分记录23,24,25。由于幼体斑马鱼的性腺组织体积微小且处于动态重塑过程中，性腺组织的分离是一项具有挑战性的任务。以往研究通常采用整个解剖的躯干组织，或基于转基因 vasa:EGFP 的细胞分选及激光显微切割技术来分析幼体性腺26。在斑马鱼驯化过程中，4号染色体发生了修饰，导致其性别决定机制至今仍不明确。本文所述方法可提供相对纯净且早期的性腺样本，适用于进一步的形态学和分子水平检测，有助于揭示斑马鱼的性别决定机制。
在发育早期阶段，将正在发育的性腺与其他结构分离并不容易。本方法描述了如何进行该解剖操作。要成功实施本实验方案，需注意一些关键步骤。首先，幼年斑马鱼的生长条件对于获得预期结果至关重要。幼年斑马鱼的性腺发育是一个高度动态的...

野生型斑马鱼4号染色体上的主要雌性性别决定因子在驯化型斑马鱼中丢失或发生改变即 常用实验室菌株1相反，它们具有多基因性别决定系统，并受到温度、缺氧、食物可得性和种群密度等环境因素的影响。斑马鱼性别发育的详细机制尚未完全阐明。一些基本问题仍有待回答，例如斑马鱼性别决定发生的时间、主要的性别决定信号是什么，以及哪些基因调控性腺转化的第一步。2,3.
在斑马鱼性别发育过程中，已确认存在几个重要阶段。在发育早期，从受精后4小时（hpf）开始，原始生殖细胞（PGCs）经历特化、向生殖嵴迁移并增殖。原始生殖细胞的数量以及生殖细胞与体细胞之间的相互作用对性腺分化至关重要4。在受精后13天（dpf），性腺处于未分化阶段。到17 dpf时，无论未来发育为雌性还是雄性，性腺均发育为具有双向潜能的卵巢。从卵巢向睾丸的转变始于21至25 dpf，该过程依赖于细胞凋亡，并可能持续数周。到35 dpf时，性腺性别已确定，卵巢和睾丸均开始进行性别特异性的配子生成5,6,7。
迄今为止，已提出多种与性别决定相关的候选基因和机制。蛋白质组学和转录组学分析分离出许多具有性别二态性表达的基因，这些基因已被用于研究斑马鱼的性别分化8,9,10。例如，在斑马鱼幼体中，cyp19a1a 基因特异性地在卵巢中表达，而在精巢中不表达11,12。此外，amh 基因在卵巢滤泡颗粒细胞中弱表达，但在精巢支持细胞（Sertoli cells）中强表达13。相反，vasa 基因在雌性和雄性斑马鱼的生殖细胞中持续表达，因此可作为合适的性腺标记基因14,15。
研究性腺基因表达水平对于理解性别决定和分化的分子机制至关重要，尤其是在双潜能卵巢阶段3,9然而，幼年斑马鱼体型较小，其性腺相应也较小，这使得性腺组织的分离以进行后续分子分析变得困难。以往的研究采用显微解剖从鳃盖至肛孔之间的整个躯干区域16该组织样品虽然含有性腺，但由多种组织和器官组成。 alternatively，可采用性腺特异性表达GFP的转基因动物（如vasa:EGFP）用于性腺组织的分离。 通过 荧光激活细胞分选（FACS）和激光捕获显微切割17,18但其广泛应用受到限制。本文介绍一种简单的方法，用于分离17天和25天龄幼鱼斑马鱼的性腺组织。我们展示了性腺相对于其他器官的位置，并从周围组织中分离出形态完整的性腺。进一步展示了性腺特异性基因，如vasa和 cyp19a1a 通过定量PCR（qPCR）分析发现，这些基因在分离的性腺中的表达水平显著高于躯干组织。本实验方案可实现对幼年斑马鱼性腺特异性基因的鉴定、分离、RNA纯化及扩增，从而为进一步开展性腺组织的分子分析提供支持。19.

<table><tbody><tr><td>细胞培养皿 100 mm</td><td>康宁</td><td>430167</td><td>用于胚胎培养</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>配制1 L所需溶液：加入17.5 g NaCl、0.75 g KCl和2.9 g CaCl₂&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；然后加入0.41 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 0.412 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO4 无水物和 4.9 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>将20倍浓缩的EM用蒸馏水稀释</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>基因</td><td>121985</td><td>用于制备2%琼脂平板</td></tr><tr><td>Trizol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>量杯玻璃</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>用于制备2%琼脂平板</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>用于加热琼脂</td></tr><tr><td>镊子 DUMONT#5INOX</td><td>世界精密仪器公司</td><td>500341</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>纯水设备</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>林格氏液&amp;rsquo;s 溶液</td><td></td><td></td><td>对于需要的1 L溶液：加入6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 以及1.19 g HEPES；然后加水定容至1 L；调节pH至7.2。经滤膜除菌后，保存于已灭菌的透明聚碳酸酯容器中。</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>金属浴</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Model GL-150</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>用于显微照片</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>微型RNA提取试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>从性腺组织中分离RNA</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>在RNA溶液中进行DNA消化</td></tr><tr><td>RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#K1631</td><td>用于第一链 cDNA 合成</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#EN0202</td><td>用于消化cDNA溶液中的残留RNA。</td></tr><tr><td>SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>该产品是一种基于Taq DNA聚合酶的2×实时PCR预混液&amp;nbsp; 适用于SYBR Green I嵌合检测试验。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Ne滴</td><td>OD-2000+</td><td>测定总RNA的浓度</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 汉堡</td><td>基因表达谱分析</td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼体性腺组织的解剖

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

尽管野生斑马鱼具有 ZZ/ZW 性别决定系统，但驯化后的斑马鱼已丢失了性染色体，转而采用多基因性别决定系统，即由分布在基因组中的多个基因共同决定个体的性别。目前，参与调控性腺发育的基因及其作用机制仍不清楚。通常情况下，分离性腺组织是研究性别发育过程的第一步。本文介绍了一种从受精后 17 天（dpf）和 25 天（dpf）的斑马鱼幼鱼中分离性腺组织的操作流程。所获得的性腺组织可用于后续的形态学观察和基因表达谱分析。

对AB品系的斑马鱼幼鱼进行了性腺解剖。图1展示了17 dpf和25 dpf时斑马鱼幼鱼典型的性腺组织。首先，切开腹部一侧的皮肤和肌肉以暴露内脏器官。在移除内脏团块后，鱼鳔连同性腺保留在体腔内。性腺附着于鱼鳔的腹侧（图1B'中的箭头所示）。在17 dpf时，性腺处于双潜能卵巢阶段。分离得到的性腺包含左侧和右侧性腺，呈半透明状（图1C）。大多数情况下，其周围被覆有上皮组织和原肾管（图1C中的箭头所示）。在25 dpf时，性腺常被脂肪组织包裹（图1D）。在此发育阶段，可观察到较大或较小的性腺。未成熟卵巢体积较大，这是由于次级卵母细胞和滤泡细胞的发育增加了性腺体积（图1E）；而未成熟精巢体积较...

本文介绍了一种分离幼体斑马鱼性腺组织的实验方案，该方法将有助于开展斑马鱼性别分化与维持机制的研究。

尽管野生斑马鱼具有 ZZ/ZW 性别决定系统，但驯化斑马鱼已丢失了性染色体，转而采用多基因性别决定系统。

本实验的总体目标是从幼体斑马鱼中分离性腺组织，并分析所分离组织的分子特性。该方法有助于回答斑马鱼性别发育领域中的关键科学问题，例如调控性腺发育的基因保守性以及斑马鱼性别发育的分子基础。该技术的主要优势在于，可对受精后仅17天的斑马鱼幼体性腺组织进行解剖，以研究其细胞及分子生物学状态。通常，初学者会因幼鱼性腺组织体积微小且结构动态变化而在此方法上遇到困难。为准备性腺解剖，将两条雄性和两条雌性成年斑马鱼分别转移至分隔式交配缸的两侧。次日早晨更换缸内水体，并移除隔板以启动交配。受精后一至两小时，收集并转移约四十枚卵至含有40毫升胚胎培养基（EM）的100毫米培养皿中。将胚胎在28.5°C条件下孵育四天，每天更换两次EM。孵育结束后，将幼鱼转移至1升的养殖缸中。受精后第五天（DPF）开始，喂食活体轮虫给鱼类。当幼鱼达到10天时，投喂活体丰年虾。随后在14天时，将幼鱼转移至循环水系统中。将斑马鱼幼鱼培育至17天或25天。然后在17日龄和25日龄时测量幼鱼的体长。通过将4克琼脂加入200毫升无菌水中制备2%的琼脂平板用于解剖。将混合物放入微波炉中加热至透明。将琼脂冷却15分钟，然后倒入直径为60毫米的培养皿中。将凝固的琼脂平板储存于4摄氏度。向已麻醉的17天后受精（17 DPF）幼鱼所在的水槽中加入碎冰。将麻醉后的幼虫转移至含有30毫升冷Ringer溶液的100毫米预冷培养皿中。在预冷的Ringer溶液中孵育鱼类至少15分钟，以确保幼虫完全麻醉。使用塑料勺将幼虫转移至预冷的琼脂平板上。将整条鱼体浸入10 mL冰冷的林格氏液中，并轻轻将其侧放。在体视显微镜下以25倍放大倍数观察，用镊子夹住鱼体主干以固定。然后用另一对镊子从肛门至心脏方向纵向撕开腹部。接下来，轻轻去除身体一侧的皮肤和肌肉，以暴露内脏器官。然后，小心移除位于鱼鳔腹侧的大型器官，注意避免损伤附着在鱼鳔上的性腺。切断鱼鳔与体内组织的连接，然后小心取出整个鱼鳔及性腺组织。使用镊子将性腺组织从鱼鳔上仔细分离。并清理周围的脂肪组织。立即将分离的性腺组织转移至预冷的1.5毫升离心管中，管内含200微升林格溶液。将离心管置于冰上，直至所有幼虫的性腺组织均分离完毕。从幼虫性腺组织中提取总RNA时，将分离的性腺转移至新的无RNase的1.5毫升离心管中，并移除林格氏溶液。然后加入100 µL裂解液，涡旋振荡管子直至组织完全裂解。根据制造商说明书进行总RNA提取后，在RNA溶液中加入十分之一体积的DNase I缓冲液和1微升DNase I，轻轻混匀管内溶液。将样品在37摄氏度孵育20分钟。随后，在RNA溶液中加入十分之一体积的DNase失活试剂。将样品在 70 摄氏度下孵育 10 分钟。然后使用分光光度计测量总 RNA 的浓度。进行第一链 cDNA 合成时，使用 oligo-dT 接头引物以及 1 至 2 微克 RNA，按照制造商的说明书操作。在45摄氏度下孵育反应90分钟。随后，将样品在70摄氏度下加热5分钟以终止反应。向cDNA溶液中加入1微升RNase H，以去除残留的RNA。轻轻混匀管中的内容物，并在约13,000 × g条件下离心10秒。将试管在37°C下孵育20分钟。然后，向样品中加入20 µL无核酸酶水。并将 cDNA 储存于 -70 摄氏度。最后，使用荧光染料，按照文本方案中列出的条件和引物进行 qPCR 质量检测。该图显示了 17 天后受精（DPF）的幼年斑马鱼典型的性腺组织。性腺附着在鳔的腹侧，如图所示。在17天仔鱼中，含有左右两侧的性腺，呈透明状。大多数情况下，性腺周围被上皮组织和原肾管所包围。在25天后受精（DPF）时，性腺通常被脂肪组织包裹，可观察到较大或较小的性腺。最后，为了分析分离得到的性腺组织的分子特性，通过定量PCR（QPCR）检测了性腺标志物amh、cyp19a1a、nanos3和vasa的表达水平。结果显示，与对照组织相比，性腺组织中这些标志基因的表达水平显著升高。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。在进行该实验时，重要的是要始终为斑马鱼幼体提供一致的饲养条件，因为这对获得预期结果至关重要。该技术建立后，为研究斑马鱼性别发育机制的科研工作开辟了道路。观看本视频后，您应该能够充分掌握如何从幼体斑马鱼中分离性腺组织。

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

幼虫斑马鱼性腺组织的解剖

本实验方案描述了从成年斑马鱼中识别和解剖器官的步骤。...

成年斑马鱼器官的解剖

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。...

斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

本文描述了在多个发育阶段对斑马鱼心脏进行解剖和分离的清晰、标准化方法。同时讨论了相关的标注与定量技术。...

斑马鱼（Danio rerio）幼虫、幼体及成体的心脏解剖

我们介绍一种利用标准胚胎显微注射和体视显微镜设备对斑马鱼幼鱼进行微量灌胃的新方法。我们证明，微量灌胃是一种安全且高效的技术，可用于将精确控制的多种物质特异性地递送至斑马鱼幼鱼的肠腔内。...

斑马鱼幼鱼的微量灌胃

脊髓横断后，成年斑马鱼在损伤后六周内可实现功能恢复。为了利用幼鱼的透明特性以及更快的恢复速度，我们介绍了一种横断斑马鱼幼体脊髓的方法。横断后，我们观察到感觉功能在损伤后2 天开始恢复，损伤后3天出现C形弯曲运动。...

幼年斑马鱼脊髓横断术

本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察新近发现的脊椎动物眼球中一种在进化上保守的结构——眼上沟。利用斑马鱼幼体，我们展示了识别参与眼上沟形成与闭合因素所必需的技术方法。...

上眼眶沟的可视化 斑马鱼 胚胎发生

本文提供了一种用于活体成像晚期胚胎期黑腹果蝇（Drosophila）雄性生殖腺的解剖方案。该方案可用于在正常条件下，或经过转基因操作及药物干预后，观察细胞内的动态过程。...

晚期胚胎的解剖与活体成像 果蝇 性腺

本方案描述了在成年斑马鱼中切除肝脏腹叶以研究肝脏再生的过程。...

成年斑马鱼的部分肝切除术

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。...

活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

这是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 性腺解剖结合冷冻裂解，用于制备生殖系样本以进行免疫荧光分析 通过...

C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

本文介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以进行单细胞RNA测序分析的方法。...

斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

学习从17日龄斑马鱼幼虫中分离性腺组织的技术，用于分析分子特性并研究性别分化的发育机制。该方法为发育生物学和遗传学研究提供了重要的实验基础。

斑马鱼幼体性腺组织的解剖

探索更多视频