Name: 超声引导下人骨髓间充质干细胞在实验性肠炎小鼠模型中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学习超声引导下心腔内注射人骨髓间充质干细胞技术，用于实验性克罗恩病小鼠模型。该方法可提高干细胞归巢至发炎肠道的效率，为炎症性肠病治疗研究提供新策略。

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Maneesh Dave 得到了美国国防部资助项目 PR141774 以及美国克罗恩病和结肠炎基金会职业发展奖的支持。Fabio Cominelli 实验室得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DK042191（F.C.）、DK055812（F.C.）、DK091222（F.C.）和 DK07948（F.C.）的支持。Arnold Caplan 实验室部分得到了 L. David 和 E. Virginia Baldwin 基金会的支持。资助机构在本研究的数据分析或论文撰写过程中未发挥任何作用。本文内容完全由作者负责。

本研究中的所有小鼠实验和操作均经凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会批准。操作在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。在凯斯西储大学干细胞核心设施，根据大学医院机构审查委员会批准的方案，在获得知情同意后抽取骨髓（BM）。
1. 人骨髓来源间充质干细胞（hMSCs）的培养与转导
注意：hMSCs 的分离在先前的出版物中有详细描述15,20。
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔低糖培养基（DMEM-LG）中培养分离的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）。将细胞置于含25 mL生长培养基的T175培养瓶中，在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下培养。每3–4天更换一次培养基。在第14天进行hMSCs的初次传代。
	<ol>
		<li>当细胞达到80%融合度时，完全移除旧培养基，并用5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS；适用于75 cm组织培养瓶）轻轻洗涤细胞。</li>
		<li>从培养瓶中移除PBS，加入4 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）。将培养瓶放回37 °C培养箱中孵育5–10分钟。尽量缩短暴露时间。</li>
		<li>当大多数细胞变圆或从培养皿脱落时，加入相当于胰蛋白酶体积一半的牛胎血清以终止反应。</li>
		<li>将细胞悬液转移至适当大小的离心管中。以400 × g离心5分钟，然后小心移除上清液。</li>
		<li>用5 mL培养基（DMEM-LG + 10% FBS）重悬细胞，并使用血细胞计数板计数细胞。 
		注意：此时细胞可用于传代培养或用三重报告基因进行转导。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对hMSCs进行三重报告基因转导。
	<ol>
		<li>将1.5 × 106个细胞接种于一个T175培养瓶中。在25 mL生长培养基中于37 °C、95%湿度和5% CO2条件下培养细胞。等待24小时使细胞贴壁。</li>
		<li>在15 mL离心管中配制病毒混合液，具体方法见参考文献18。
		<ol>
			<li>在37 °C水浴中解冻慢病毒。将160 µL浓度为5 mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液加入8 mL培养基（DMEM-LG + 10% FBS）中，终浓度为100 µg/mL。涡旋振荡3秒。加入感染复数（MOI）为5的病毒（首次解冻）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移除细胞培养瓶（步骤1.2.1）中的培养基，并将病毒混合液加入细胞中。在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下孵育10小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 mL DMEM-LG + 10% FBS中加入4 mL浓度为100 µg/mL的硫酸鱼精蛋白，继续孵育14小时。</li>
	<li>在转导24小时后，更换为25 mL新鲜培养基（DMEM-LG + 10% FBS）以终止转导过程。</li>
	<li>通过流式细胞术检测mRFP表达水平来确认转导效率18。 
	注意：本实验中使用转导效率超过65%的hMSCs。</li>
	<li>每周两次更换25 mL新鲜培养基（DMEM-LG + 10% FBS）以扩增细胞。在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下培养细胞。当细胞达到80%融合度后进行传代。</li>
	<li>当达到所需细胞数量后，按照步骤1.1.2–1.1.4进行胰酶消化处理。</li>
	<li>计数细胞，并将其重悬于无菌PBS（1×）中，最终浓度为1 × 106 个细胞/75 µL。将细胞置于冰上保存，以便运输至超声设备。实验中使用第2–5代的hMSCs。</li>
</ol>
2. 超声引导下将人源间充质干细胞注射至左心室的心内注射法
注意：实验中使用已建立小肠炎症的 SAMP1/YitFc 小鼠以及年龄和性别匹配的 AKR/J 小鼠。SAMP 和 AKR 小鼠需在特定病原体阴性条件下饲养，给予标准实验室饲料，并维持 12 小时光照/12 小时黑暗的昼夜循环。此处，超声引导的心脏注射在凯斯西储大学（CWRU）动物研究设施内的专用无菌心脏超声室内进行，该房间使用消毒剂消毒并用 70% 酒精冲洗。实验室研究人员在进行心内注射时必须穿戴个人防护装备，包括防护服、带眼罩的面罩和无菌手套。在整个操作过程中必须维持小鼠的体温。
<ol>
	<li>在麻醉小鼠之前设置超声成像系统。本方案中使用专为小鼠超声心动图设计的超声设备。
	<ol>
		<li>打开电源并初始化换能器（30 MHz），以建立新的研究。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在诱导室中使用100%氧气以0.2 - 0.5 L/min流速输送3 - 4%异氟烷对小鼠进行麻醉。整个实验过程中通过鼻罩以100%氧气输送2%异氟烷维持麻醉状态。在开始成像前，通过夹捏脚趾、翻转小鼠并观察其是否无运动反应来确认麻醉效果。 
	注意：麻醉诱导后应将眼用软膏涂抹于小鼠眼部，以防止角膜干燥。将麻醉后的小鼠转移至成像设备即， 生物发光成像系统和超声），并在该处接受维持剂量的异氟烷麻醉。在整个麻醉过程中，每10分钟通过观察尾部和足垫对夹捏刺激是否无反应，来确定麻醉开始时间和麻醉深度。</li>
	<li>将成像台和超声耦合剂的温度设置为 37 °C。</li>
	<li>使用脱毛膏完全去除麻醉小鼠胸部区域的毛发。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于成像台上，用胶带固定其上下肢，以防止操作过程中身体移动。所有小鼠在操作过程中均需使用心电图监测器进行监测。</li>
	<li>使用10%聚维酮碘棉签清洁小鼠胸部区域皮肤，随后使用70%乙醇棉签擦拭。在小鼠胸部区域涂抹一层厚厚的凝胶。</li>
	<li>将换能器安装在支架上，并调整其位置，直至视野中清晰可见左心室。</li>
	<li>加入150 µL转导的hMSC细胞悬液（2 x 10⁵）6 将150 µL无菌PBS中的hMSCs吸入1 mL注射器（配备28 G针头），并将注射器固定至相应的持针器上。为观察搏动性血流，注射器内保留少量空气柱。为避免细胞聚集，注射前需重悬细胞。</li>
	<li>将注射器推进至小鼠胸腔，在超声引导下调整针头轨迹，进入左心室。</li>
	<li>在超声成像引导下，将注射器针头经肋间穿刺进入小鼠左心室。 
	注意：在超声图像中，注射器针尖应清晰可见于左心室。通过观察是否有新鲜动脉血流入注射器，可进一步确认位置正确。以上均为成功插入的标志。</li>
	<li>在2分钟内非常缓慢地注射hMSC细胞悬液，施加轻柔压力。</li>
	<li>注射悬浮细胞后，轻轻拔出针头，擦去超声耦合剂，并解除胶带对小鼠的固定。</li>
	<li>将动物放入一个带有预热垫的新洁净笼子中。 
	注意：操作完成后，应为小鼠提供温暖的环境直至其恢复。应避免过热，因为外周血管扩张会妨碍恢复。在小鼠完全恢复前应密切监测，并与其他小鼠隔离，完全恢复的指征是小鼠能够维持胸卧位。</li>
	<li>监测动物直至其完全从麻醉中恢复，并在实验结束前每日进行监测。</li>
</ol>
3. 人源间充质干细胞的生物发光成像（BLI）
<ol>
	<li>在心内注射后24小时，使用生物发光成像系统对小鼠进行成像。开始 体内 成像软件。启动成像系统并新建一项研究。
	<ol>
		<li>在控制面板中，通过单击设置成像参数 &#34;序列设置。&#34; 在成像模式中，选择 &#34;发光&#34; 和 &#34;照片&#34; 将曝光时间设置为 0.5 s 至 10 min。将像素合并（binning）设置为 &#34;培养基&#34; 以及F/stop值 &#34;1.&#34; 将激发滤光片设置为 &#34;阻断&#34; 以及发射滤光片至 &#34;打开&#34; 将视野设置为 &#34;C&#34; 两只小鼠。通过点击采集控制面板，将序列设置添加到图像向导中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开氧气泵，并将机器内的麻醉诱导舱和鼻罩中的异氟烷浓度均设置为2.5%。</li>
	<li>腹腔注射小鼠 300 µL D-荧光素钠（12.5 mg/mL）。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉诱导室。
	<ol>
		<li>2 - 3 分钟后，将小鼠转移至 体内 成像室，将小鼠头部置于麻醉气体混合装置的鼻锥中。成像过程中使用眼用油膏保护小鼠眼睛。如需同时成像多只小鼠，应使用黑色遮光板，防止光线反射至邻近小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 &#34;获取&#34; 在D-Luciferin注射后10分钟，按下按钮开始图像采集。</li>
	<li>重复步骤 3.3 至 3.5，以成像更多小鼠。</li>
	<li>之后 体内 图像采集，通过二氧化碳处死小鼠2 吸入麻醉后行颈椎脱位，以确认死亡。执行该操作 离体 分析。
	<ol>
		<li>如果 离体 20分钟后进行分析；在处死小鼠前，需重复荧光素注射（步骤3.3）；荧光素注射后20分钟，生物发光成像信号可能减弱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖小鼠以取出整个胃肠道（即， 从胃到直肠）、肠系膜淋巴结（MLN）、肺、脾和肝。用镊子和剪刀将其置于培养皿中2,4.</li>
	<li>将含有移植器官的培养皿放入成像室，按照步骤 3.1 - 3.6 采集生物发光成像（BLI）图像。</li>
	<li>成像完成后，将取出的器官转移至含有最佳切割温度（OCT）包埋剂的组织模具中。使用干冰在 -80 °C 下对模具进行冷冻。对冷冻切片进行抗荧光素酶抗体免疫组织化学染色，以确认hMSCs的存在。16.</li>
	<li>为量化光强度，使用工具面板中的感兴趣区域（ROI）工具16,19选择感兴趣区域（ROI）框，并将其移动到图像上的目标区域。单击 &#34;ROI 测量&#34; 并将数据保存为 SEQ 文件格式。将数据导出为 .txt 文件，并使用统计软件进行定量分析的基本统计检验。16.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种在实验性克罗恩病的小肠小鼠模型中，通过超声引导进行心内注射人源间充质干细胞（hMSCs）的新技术。该技术具有极高的存活率和成功率，因为可根据超声提供的小鼠左心室实时高分辨率图像，实时调整穿刺针的进针路径。将细胞递送至左心室的优势在于，hMSCs可经动脉系统内分布，并绕过静脉循环，从而避免细胞在肺部聚集。此前，通常采用颈动脉插管进行动脉内注射以递送间充质干细胞（MSCs）16,21颈动脉插管方法需要通过手术暴露颈动脉，以便将导管置入动脉内。导管向前推进至主动脉弓，用于细胞输注。随后移除导管并对颈动脉进行结扎。与颈动脉插管相比，这种新型的超声引导下向左心室注射MSCs的技术具有更小的侵入性，操作更快（约10分钟/小鼠 vs. 60分钟/小鼠），且并发症发生率和死亡率更低&#60;10% 与 30%）。将小鼠超声引导下心内注射hMSCs的技术转化为人类临床试验，可通过经导管插管至肠系膜上动脉（目前该操作已用于治疗慢性肠系膜缺血和难治性胃肠道出血）来实现，从而将hMSCs递送至病变的小肠。</p...

克罗恩病（Crohn's disease, CD）是一种常见的慢性小肠和大肠炎症性疾病，被认为是由宿主免疫系统对肠道微生物产生不适当反应所致7,8。近期研究表明，小鼠和人类的间充质干细胞（MSCs）均能在肠道炎症的小鼠模型中抑制炎症反应1,3,4,5。目前有多个正在进行的临床试验，使用来源于骨髓或脂肪组织的人类MSCs治疗炎症性肠病（IBD）患者，其中包括CD患者9。这些临床试验中采用了两种MSC治疗途径：一种是通过系统性输注（即静脉注射）MSCs治疗管腔型IBD（包括CD）；另一种是对肛周CD患者的瘘管病灶进行局部应用或注射干细胞。在最近一项关于MSC治疗IBD的荟萃分析中，系统性（即静脉）MSC治疗在最多40%（95% CI：7 - 79%）的管腔型IBD（包括CD）患者中有效，而当MSCs被直接局部注射至CD患者的病变瘘管时，疗效显著更高，达到61%（95% CI：36 - 85%）9。最近一项针对异体脂肪来源干细胞治疗CD肛周瘘的III期多中心、随机、安慰剂对照试验显示，直接将干细胞注射至CD患者肛周瘘管可获得具有统计学意义的临床和影像学上的瘘管愈合证据，进一步支持了上述荟萃分析的结果10。静脉注射MSC治疗管腔型CD疗效较低的原因尚未得到充分研究，但可能的原因之一是MSC向炎症部位归巢的能力不足。在结肠炎小鼠模型中的研究显示，静脉注射的MSC仅有极小比例（1 - 5%）能够到达发炎的结肠，其余大部分细胞被肺部过滤清除（首过效应）1,2,5,11,12。因此，许多小鼠研究在结肠炎动物模型中采用腹腔注射（i.p.）方式给予MSC4。然而，这些研究也表明，仅有少量细胞能够到达并定植于结肠，其疗效主要依赖于分泌可溶性旁分泌因子，例如肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白（TSG-6）2。MSC发挥免疫抑制和组织修复作用的机制是多方面的，包括旁分泌作用、不依赖细胞邻近的因子（如TSG-6）以及依赖细胞邻近的因子（如程序性死亡配体1（PD-L1）或Jagged 1）。因此，MSC在炎症部位的定位可能有助于提高治疗效果9,13。事实上，最近一项研究发现，将MSC直接植入结肠损伤部位可通过分泌促血管生成的血管内皮生长因子（VEGF）促进组织愈合；而静脉注射后仅观察到轻微的修复效果5。为了提高MSC向炎症部位（即SAMP小鼠的小肠）的靶向定位，本研究开发了超声引导下经心内注射至左心室的MSC递送技术。影像引导注射可确保注射的准确性，从而提高成功率，并降低发病率和死亡率。此外，将MSC注射至左心室可使其进入动脉循环，从而在被肺部截留之前优先到达发炎的小肠。
本研究中，采用人骨髓来源的间充质干细胞（hMSCs）注射至克罗恩病（CD14）的小鼠模型SAMP-1/YitFc（SAMP）体内。SAMP是一种特征明确的自发性慢性炎症小鼠模型，几乎100%发生小肠炎症14。该炎症在无任何化学、免疫或遗传干预的情况下，由肠道微生物群诱导产生，且与人类CD高度相似11。本研究同时使用了性别和年龄匹配、无炎症的AKR/J（AKR）小鼠作为SAMP小鼠的亲本对照组。
人骨髓间充质干细胞（hMSCs）从正常匿名供体的骨髓（BM）样本中分离，并在实验室中使用经过验证且已发表的方案进行扩增15,16分离扩增后，通过多种实验在实验室中评估了间充质干细胞（MSC）的成骨、成脂和成软骨分化能力。15将含有hMSCs的羟基磷灰石/磷酸三钙陶瓷立方体皮下植入免疫缺陷型CB17-Prkdc SCID小鼠，进行成骨功能检测。17立方体实验可验证成骨和成软骨潜能，被视为评估单个间充质干细胞制备物的最终检测方法17可视化人骨髓间充质干细胞（hMSCs） 体内 注射后，使用慢病毒将携带三重报告基因构建体的hMSCs进行转导，该构建体包含由改良的小鼠增殖性肉瘤病毒（mnd）启动子驱动的萤火虫荧光素酶（fl）、单体红色荧光蛋白（mRFP）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（ttk）18三重报告基因中的萤火虫荧光素酶是一种酶，可在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）中将注射的荧光素（luciferin）转化为氧化荧光素（oxyluciferin），并产生光子/白光。该信号可被高灵敏度的电荷耦合器件（CCD）相机检测到（生物发光）。 在体 光学成像系统，可实现小鼠体内活体hMSCs的可视化。生物发光成像（BLI）是一种灵敏的技术，可用于细胞的连续追踪及 离体 分析。使用强mnd启动子可驱动三重融合报告基因构建体的持续表达，从而实现对注射的hMSCs成像超过16周。19人骨髓间充质干细胞（hMSCs）难以转导，且转导效率较低。通过采用优化的转导方案，显著提高了hMSCs的转导效率，并增强了外源基因的表达水平。18利用流式细胞术检测mRFP表达（三种报告基因之一），证实了转导hMSCs的效率可高达83%。分化实验及 体内 立方体实验表明，经转导的人类间充质干细胞（hMSCs）具有分化为软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞的能力17.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>吉布科</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>吉布科</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>吉布科</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>吉布科</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>175 cm 组织培养瓶</td><td>康宁</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>75 cm 组织培养瓶</td><td>康宁</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂</td><td>费舍尔医疗</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>标准冷冻模具</td><td>Tissue-Tek&amp;nbsp;</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-Pac HIV 表达包装系统</td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉片</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Piramal Helathcare&amp;nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>精细科学工具</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀（Wagner）</td><td>精细科学工具</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 宠物眼膏</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 超声耦合凝胶</td><td>Parker 实验室</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>费舍尔科技</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>SAMP 小鼠</td><td>克利夫兰消化疾病研究中心核心实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKR 小鼠</td><td>克利夫兰消化疾病研究中心核心实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 成像系统</td><td>&amp;nbsp;Visual Sonics，多伦多，加拿大</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;IVIS spectrum 系列系统&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件&amp;nbsp;</td><td>Caliper LifeSciences，PerkinElmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三重报告基因系统</td><td>由美国凯斯西储大学 Zheng-Hong Lee 博士惠赠（参考文献19）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

超声引导下向心脏注射人源间充质干细胞以增强其向肠道归巢：在小鼠实验性炎症性肠病模型中的应用

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

克罗恩病（CD）是一种常见的慢性小肠和大肠炎症性疾病。小鼠和人类间充质干细胞（MSCs）具有免疫抑制潜力，已被证明可在肠道炎症的小鼠模型中抑制炎症反应，尽管给药途径可能限制其归巢能力和治疗效果1,3,4,5。将MSCs局部应用于结肠损伤模型，已在减轻结肠炎症方面显示出更高的疗效。然而，目前关于增强人骨髓来源间充质干细胞（hMSCs）在实验性克罗恩病SAMP-1/YitFc（SAMP）模型中小肠炎症部位定位的技术数据仍较为缺乏。本研究描述了一种新型的超声引导下经心内注射hMSCs至SAMP小鼠的技术，该小鼠是慢性肠道炎症的一个特征明确的自发性模型。同时采用性别和年龄匹配、无炎症的AKR/J（AKR）小鼠作为对照。为分析hMSCs的生物分布与定位情况，我们通过携带三重报告基因的慢病毒对hMSCs进行转导。该三重报告基因包括：用于生物发光成像的萤火虫荧光素酶（fl）；用于细胞分选的单体红色荧光蛋白（mrfp）；以及用于正电子发射断层扫描（PET）成像的截短型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ttk）。研究结果表明，在心内注射24小时后，hMSCs主要定位于SAMP小鼠的小肠，而在无炎症的AKR小鼠中则未见明显定位。这种新型的超声引导下向SAMP小鼠左心室注射hMSCs的技术可确保较高的细胞递送成功率，并使小鼠快速恢复，且并发症和死亡率极低。该技术可能成为增强MSCs在其他小肠炎症模型（如TNFΔRE6）中定位的有效方法。未来的研究将确定通过动脉内给药提高hMSCs的定位是否可进一步提升其治疗效果。

图1 表明hMSCs可被三重报告基因高效转导，并保持其干细胞特性。转导后的hMSCs可通过BLI实时可视化图1C, 图3）。这种新型的超声引导下将hMSCs注射至SAMP小鼠左心室的方法可确保极高的注射成功率，使小鼠快速恢复，并将发病率和死亡率降至最低（图2）。向一只小鼠注射hMSCs的平均耗时约为10分钟，采用该技术观察到的发病率和死亡率低于8-9%。死亡的主要原因为出血性心包积液引起的中风和心脏压塞。 离体 心内（动脉内）注射hMSC后24小时进行的分析证实，该给药途径可使hMSC归巢至SAMP小鼠发炎的小肠组织，而不会归巢至无炎症的对照小鼠图3C 和 D）。此外，人源间充质干细胞（hMSCs） tends 不会滞留在无炎...

在结肠炎症模型中进行的小鼠研究表明，静脉注射或腹腔注射的间充质干细胞（MSC）仅有小部分（1 - 5%）会归巢至发炎的结肠1,2。本研究显示，通过超声引导下心脏内注射MSC可提高其在肠道的定植率。

克罗恩病（Crohn's disease, CD）是一种常见的慢性炎症性肠病，主要累及小肠和大肠。小鼠和人类间充质干细胞（MSCs）具有……

本实验的总体目标是在实验性克罗恩病小鼠模型中，采用超声引导下经心内注射人骨髓来源的间充质干细胞（HMSC），以观察HMSC向肠道的归巢现象。该方法有助于解答炎症性肠病领域中的关键问题，即在炎症期间是否需要增加HMSC在小肠内的局部定植。该技术的主要优势在于，能够在小鼠活动度最小、死亡率最低的情况下，实现较高的HMSC递送成功率。通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为多个变量可能影响实验结果，需要操作者充分理解人源间充质干细胞的生物学特性。本实验操作将由本实验室的博士后 Paola Menghini 进行示范。在特定病原体阴性动物实验设施中，建立小鼠超声心动图成像系统操作流程，并启动30兆赫换能器。随后，通过脚趾夹捏法确认动物镇静程度是否合适，并在动物眼睛上涂抹眼膏。使用脱毛膏去除胸部区域的毛发，将动物以仰卧位放置于37摄氏度的成像台面上。用胶带固定四肢，防止操作过程中肢体移动，并使用10%聚维酮碘和70%乙醇对暴露的胸壁皮肤进行消毒。在皮肤上涂抹一层较厚的37°C超声耦合剂，将超声探头安装至支架上，调整探头位置，直至在视野中清晰可见左心室。随后，将2×10⁶个转导的人类间充质干细胞在150 µL无菌PBS中轻轻重悬，制成均匀的细胞悬液，并将细胞悬液吸入一支配有28G针头的1 mL注射器中。每只小鼠注射的细胞悬液体积应少于150微升，以避免容量超负荷导致死亡。将注射器固定在注射器架上，然后在超声引导下推进注射器靠近小鼠胸腔，根据需要调整针头路径，并通过肋间间隙将针尖穿刺进入左心室。在超声图像中充分显示针头对于确保针头正确进入左心室的路径和插入、实现成功注射以及避免心脏抑制和死亡至关重要。针尖应在左心室内清晰可见，还可通过观察是否有新鲜动脉血流入注射器来进一步确认位置正确。轻柔地推动推杆，缓慢注射人骨髓间充质干细胞（HMSC）悬液，持续约两分钟。当所有细胞注射完毕后，轻柔地拔出针头，将动物置于预先加热的垫子上并放入清洁的笼子中，持续监测直至完全恢复。注射后24小时，启动生物发光成像系统，并在活体成像软件中新建一项研究。在控制面板中设置成像参数时，点击序列设置。在成像模式下，选择生物发光成像并拍照。将曝光时间设置为0.5秒至10分钟，增益设为中等，光圈设为f/1。将激发滤光片设为阻断，发射滤光片设为开放，视野设为可同时观察两只小鼠。然后单击采集控制面板，将已设置的序列添加到成像向导中。接着，向第一只小鼠注射 300 微升 D-荧光素酶底物。在动物的眼睛上涂抹眼膏，并将小鼠转移至活体成像室中。在注射D-荧光素10分钟后，点击“采集”开始图像采集。完成所有小鼠的成像后，分别取每只动物的整个胃肠道、肠系膜淋巴结、肺、脾脏和肝脏。随后按照前述方法对器官进行成像，用于整体动物生物发光成像。人骨髓间充质干细胞（HMSC）可高效转导三重报告基因，同时保持其干细胞特性，并可

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医学

超声引导下人骨髓间充质干细胞在实验性肠炎小鼠模型中的应用

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超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。...

超声引导下经胸心肌内注射小鼠技术

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基于干细胞的治疗已成为修复心肌梗死后受损心肌组织的有效策略。我们提供了一种利用可被酶促交联的明胶水凝胶进行干细胞移植的最佳体内应用方法。...

小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

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超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

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向免疫缺陷小鼠股骨内注射人造血干细胞和祖细胞

本文介绍了一种通过超声引导将血管干细胞精确递送至主动脉管壁的实验方案。该技术可有效靶向血管壁，并促进主动脉瘤和主动脉夹层的血管修复。...

精准超声引导下干细胞递送用于主动脉疾病中的血管修复

本文详细介绍了一种采用29 G x 88...

超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

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