Name: 生物相容的液晶弹性体泡沫的合成中用作细胞支架的三维空间细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 学习利用生物相容性液晶弹性体制备三维泡沫状细胞支架的方法。该技术支持细胞附着与增殖，可用于研究空间细胞间相互作用，为组织工程和生物医学研究提供新平台。

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作者感谢肯特州立大学（合作研究资助以及对肯特州立大学再生医学计划−ReMedIKS的支持）对本项目提供的经费支持。

注意：使用三臂星形嵌段共聚物制备三维液晶弹性体（LCE）泡沫状材料的以下步骤如图1所示。核磁共振（NMR）表征在Bruker DMX 400-MHz仪器上进行，以氘代氯仿（CDCl3）为溶剂，室温下记录谱图，并以内标残留峰7.26为参考。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱采用Bruker Vector 33 FT-IR光谱仪，以衰减全反射模式测定。对于以下方案的每一步，均需穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. α-氯代-ε-己内酯（单体）的合成（依据 Jérôme et al.28 的实验步骤）
<ol>
	<li>开始合成前，按以下步骤纯化 27 g 的 3-氯过氧苯甲酸：
	<ol>
		<li>在 800 mL 蒸馏水中加入 1.28 g 一水合磷酸二氢钠和 8.24 g 七水合磷酸氢二钠。用氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 7.4，并保留 30 mL 该溶液；此即缓冲溶液。</li>
		<li>使用分液漏斗，将 3-氯过氧苯甲酸溶于 35 mL 乙醚中。用 10 mL 缓冲溶液（按步骤 1.1.1 配制）洗涤有机相，重复洗涤三次。</li>
		<li>向有机相中直接加入 3 g 硫酸钠；该干燥剂可吸收有机相中的水分。</li>
		<li>过滤溶液以除去干燥剂。在减压条件下，使用旋转蒸发仪于 850 mbar 和 40 °C 浓缩滤液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 18.5 g 纯化的 3-氯过氧苯甲酸溶于 150 mL 无水二氯甲烷中，在超声浴中搅拌使其溶解；该过程通常需要 20 分钟。将溶液置于分液漏斗中。</li>
	<li>在双颈圆底烧瓶中，使用磁力搅拌器在氮气氛围下将 13.1 g 2-氯环己酮溶于 15 mL 无水二氯甲烷中。持续搅拌。</li>
	<li>将装有 3-氯过氧苯甲酸溶液的分液漏斗（来自步骤 1.2）安装至步骤 1.3 中的双颈烧瓶上。用氮气吹扫系统。调节分液漏斗的开口，使氯过氧苯甲酸溶液以每两秒一滴的速度滴加到 2-氯环己酮溶液中，并在氮气氛围下继续搅拌反应混合物 96 小时。</li>
	<li>将反应混合物冷却至 -20 °C 并保持 1 小时，使副产物 m-氯苯甲酸（m-CBA）沉淀析出。</li>
	<li>过滤除去 m-氯苯甲酸（m-CBA），并用饱和的硫代硫酸钠溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液依次洗涤剩余溶液。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪在 850 mbar 和 40 °C 下减压除去溶剂。通过在 2.3 Torr 和 96 °C 下减压蒸馏，纯化所得淡黄色粘稠液体。</li>
	<li>通过以下 1H NMR 峰监测合成反应的完成情况。1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ[ppm])：4.75–4.68 (m, 1H, CHClCO)，4.37–4.26 (m, 1H, CH2O)，4.18–4.05 (m, 1H, CH2O)，以及 2.06–1.58 (m, 6H, −CH2−)6,27。</li>
</ol>
2. 通过开环共聚反应合成α-三臂星形嵌段共聚物（SBC-αCl）（Sharma et al.6 和 Amsden et al.29）
<ol>
	<li>合成前，用2%（v/v）的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷甲苯溶液填充20 mL安瓿瓶，搅拌约24小时进行硅烷化处理。用异丙醇冲洗，并将安瓿瓶置于140 °C烘箱中干燥30分钟。</li>
	<li>向安瓿瓶中加入3.64 g蒸馏的ε-己内酯、0.5 g α-氯代-ε-己内酯和0.25 mL甘油。使用涡旋振荡器混合1分钟。</li>
	<li>向安瓿瓶中加入4.90 g D,L-丙交酯，并用氮气吹扫。将安瓿瓶放入120 °C烘箱中以熔化D,L-丙交酯；该过程通常需要约2小时。再次使用涡旋振荡器混合，确保所有组分充分混匀，然后向安瓿瓶中加入66 µL辛酸亚锡（Sn(Oct)2）。 
	注意：D,L-丙交酯在此过程中会冷却，需重新加热至熔化。</li>
	<li>最后一次使用涡旋振荡器剧烈混合，并用氮气吹扫。</li>
	<li>用橡胶塞封闭安瓿瓶。将连接至真空管路的针头（通常使用实验室真空系统即可）穿过橡胶塞。开启真空泵，并用火焰加热玻璃长颈，缓慢旋转直至玻璃自身闭合。注意避免熔化橡胶塞。安瓿瓶火焰密封后，将其置于沙浴、烘箱或其他合适的加热装置中，在140 °C下反应48小时。</li>
	<li>取出安瓿瓶，于室温下冷却。</li>
	<li>在密封处敲开安瓿瓶，加入10 mL二氯甲烷以溶解高黏性液体。将溶液转移至分液漏斗中。</li>
	<li>准备一个含有100 mL冷甲醇的烧瓶（使用干冰/丙酮浴冷却至约-78 °C）。将分液漏斗（步骤2.7）固定在烧瓶上方。调节分液漏斗活塞，使液体以每两秒一滴的速度缓慢滴加（滴加方式）。</li>
	<li>通过过滤（使用滤纸）收集白色沉淀，并在50至60 °C的真空烘箱中干燥。</li>
	<li>通过以下1H NMR和FT-IR峰监测合成反应的成功情况。1H NMR（400 MHz，CDCl3，δ [ppm]）：5.29–5.03（m，COCHCH3），4.43–4.25（m，CHCl），4.24–4.12（m，CH2O），4.11–4.03（t，J = 4.6 Hz，CH2O），3.80–3.68（m，CHCH2），3.09–2.64（宽峰，s，OH），2.39（t，J = 4.5 Hz，α-H），2.33（t，J = 5.1 Hz，α-H），以及1.77–1.25（m，CH2，CH3）；FT-IR（1/λ [cm-1]）：2,932（s），2,869（m），1,741（s），961（s），866和735（m）6,27。 
	注意：为制备更具亲水性的三维液晶弹性体（LCE），可按照上述开环共聚（ROP）方法，制备线性嵌段共聚物（LBC）替代星形嵌段共聚物（SBC）。
	<ol>
		<li>向硅烷化处理的安瓿瓶混合物中加入0.3 g聚乙二醇（PEG）、3.15 g ε-己内酯、1.0 g α-氯代-ε-己内酯和5.0 g D,L-丙交酯。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. α-Cl-三臂SBC至α-N3-三臂SBC（SBC-αN3）的合成修饰（依据Sharma et al.6）
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中通入氮气，将5 g SBC-αCl溶于30 mL无水N,N'-二甲基甲酰胺中。</li>
	<li>加入0.22 g叠氮化钠，室温下反应过夜。 
	注意：叠氮化钠具有毒性，需穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪在11 mbar、40 °C条件下减压除去N,N'-二甲基甲酰胺。将残留物溶于30 mL甲苯中，于2,800 × g离心15分钟，重复三次以除去生成的盐。再使用旋转蒸发仪在77 mbar、40 °C条件下减压除去甲苯。</li>
	<li>通过1H NMR和FT-IR特征峰监测叠氮基取代反应的完成情况。 
	注：1H NMR谱图与前体SBC-αCl相似，仅在3.90 ppm处出现归属于叠氮基团的新峰；FT-IR（1/λ [cm-1]）：2,928、2,108（s，叠氮基）、1,754（s）、1,450（s）、960（m）、865（s）、733（s）和696（m）。</li>
</ol>
4. 胆固醇5-己炔酸酯（LC基团）的合成（依据Sharma et al.6 和 Donaldson et al.30）
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中，加入 3 g 5-己炔酸和 130 mL 二氯甲烷，用冰浴冷却至 0 °C。</li>
	<li>在另一个圆底烧瓶中，加入 8.28 g N,N'-二环己基碳二亚胺、10.3 g 胆固醇和 0.2 g 4-二甲氨基吡啶。</li>
	<li>将 5-己炔酸溶液逐滴加入含有胆固醇混合物的烧瓶中，并将最终混合物在 0 °C 下维持 1 小时。</li>
	<li>让混合物在室温下静置过夜，使其自然升温至室温。</li>
	<li>通过使用 415 级滤纸过滤，除去生成的二环己基脲沉淀，并弃去沉淀。</li>
	<li>在减压条件下，使用旋转蒸发仪（850 mbar，40 °C）浓缩滤液。将所得残余物溶解于 150 mL 正己烷中。</li>
	<li>在减压条件下，使用旋转蒸发仪（335 mbar，40 °C）蒸发溶剂。向油状残余物中加入 350 mL 乙醇以析出最终产物。用乙醇洗涤生成的类白色固体，并在 50 °C 下真空干燥固体产物。</li>
	<li>使用以下 1H NMR 和 FT-IR 特征峰监测合成反应。1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm])：5.39 (d, J = 4.7 Hz, 1H, CH=C), 4.70–4.58 (m, 1H, CHOCO), 2.44 (t, J = 2.5 Hz, 2H, CH2CO), 2.34 (m, 2H, CH2-CH=), 2.31 (m, 2H, CH2CH2-COO), 2.28 (s, 1H, HC≡C), 2.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡C-CH2), 2.07–1.06 (m, 2H, CH2, CH), 0.94 (s, 3H, CH3), 0.89 (d, J = 1.8 Hz, 3H, CH3CH), 0.88 (d, J = 1.8 Hz, 6H, CH3-CH)，0.67 (s, 3H, CH3)。FT-IR (1/λ [cm-1])：2,830–2,990（宽而强峰），2,104（中等），1,695（强），1,428（中等），1,135（中等），999（强），798（强）和 667（强）。</li>
</ol>
5. 通过叠氮-炔烃胡伊斯根环加成反应（&#34;点击&#34;反应）将α-N3-三臂SBC化学修饰为α-胆固醇-三臂SBC（SBC-αCLC）以获得SBC-Chol（依据Sharma et al.6）
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中，将1摩尔当量的SBC-αN3（1.5 g）溶于100 mL新蒸馏的四氢呋喃（THF）中。加入1.2摩尔当量的胆固醇-5-己炔酸酯（1.94 g）、0.1摩尔当量的碘化亚铜（0.06 g）和0.1摩尔当量的三乙胺（0.03 g）。在氮气氛围下，于35 °C搅拌过夜。</li>
	<li>在357 mbar和40 °C条件下，使用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂。</li>
	<li>将残留物混合物溶于80 mL二氯甲烷中，室温下以2,800 × g离心5分钟，以去除未反应的原料和副产物。</li>
	<li>使用以下1H NMR和FT-IR特征峰监测合成反应。1H NMR（400 MHz，CDCl3，δ [ppm]）：7.54（s，CH=C-三唑）、5.43–5.34（m，胆固醇C=CH）、5.10–5.06（m，COCHCH3）、4.68–4.55（m，O-CH-胆固醇）、4.24–4.19（m，CH2O）、4.18–4.13（t，J=5.0 Hz，CH2O）、4.11–4.05（t，J=4.4 Hz，CH2O）、2.47–2.41（t，J=4.9 Hz，COCH2）、2.31–2.25（m，COCH2）、2.07–1.02（m，CH2、CH3）、1.05–1.03（s，CH2、CH3）、0.96–0.92（d，J=3.3 Hz，CH2、CH3）、0.91–0.87（dd，J=1.9 Hz，J=1.8 Hz，CH3）和0.71–0.68（s，CH3）。FT-IR（1/λ [cm-1]）：3,260（s）、2,920（s）、1,710（s）、1,460（s）、1,370（s）、1,240（m）、1,190（s）、733（s）和668（s）。</li>
</ol>
6. 2,2-双(1-己内酯-4-基)丙烷（交联剂，BCP）的合成（依据 Gao et al.27 和 Albertsson et al.31）
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中，制备含有10.8 g 2-双(4-羟基环己基)丙烷和52 mL乙酸的溶液。</li>
	<li>配制一种溶液，其中含有11 g三氧化铬溶于50 mL乙酸和8 mL蒸馏水中。将此溶液逐滴加入步骤6.1中制备的溶液中，同时将混合物的温度维持在17至20 °C之间。例如， 在水浴中）；此滴加过程需2小时。待过程完成后，使溶液继续搅拌约30分钟。</li>
	<li>加入50 mL异丙醇，在室温下搅拌溶液过夜。</li>
	<li>在减压条件下使用旋转蒸发仪（137 mbar，40 °C）浓缩深紫色溶液。加入 300 mL 蒸馏水以析出沉淀，沉淀应为浅紫色。</li>
	<li>使用415号滤纸过滤粗产物。用约250 mL蒸馏水或直至固体变为白色为止，洗涤固体物质。</li>
	<li>将固体材料溶于15 mL苯中，40 °C下溶解，然后在25 °C下重结晶。</li>
	<li>将8.34 g干燥的二酮溶于干燥的二氯甲烷中，并与含有6.0 g间氯过氧苯甲酸的75 mL二氯甲烷溶液一同加入烧瓶中。</li>
	<li>在40 °C下回流反应24小时。</li>
	<li>将反应混合物在 -20 °C 冷却 10 分钟以沉淀 m-氯苯甲酸副产物</li>
	<li>移除 m通过过滤（使用滤纸）除去氯苯甲酸，并在减压条件下浓缩溶液。</li>
	<li>用200 mL 2-庚酮洗涤粘稠的粗产物，并在50 °C下减压干燥沉淀物过夜。</li>
	<li>使用以下方法监测合成过程 1H NMR 和 FT-IR 峰 1H NMR（400 MHz，CDCl₃）3，δ [ppm]）：4.42–4.37（dd， J = 14.2, 7.4 Hz, 2H, CH2OC=O)，4.21–4.15（t，2H， J = 11.3 Hz, CH2OC=O)，2.80–2.75（ddt， J = 14.3, 6.5, 1.6 Hz, 2H, CH2COO), 2.63–2.57 (tt, J = 13.3, 2.1 Hz, 2H, CH2COO), 2.04–1.93 (m, 4H, -CH2CH2OC=O), 1.70–1.56 (m, 4H, -CH2 CH2COO), 1.48-1.38 (m, 2H, -CHC(CH3)2)，0.84（单峰，6H，CH3C-）。</li>
</ol>
7. 使用六亚甲基二异氰酸酯（HDI）或2,2-双(1-己内酯-4-基)丙烷（BCP）27作为交联剂制备多孔三维弹性体支架（根据Gao et al.27）
<ol>
	<li>使用0.75 g SBC-αCLC制备三臂弹性体混合物，加入0.25 mL HDI（或0.45 mL BCP）和0.24 mL蒸馏的ε-己内酯单体。加入60 µL Sn(Oct)2。若使用BCP替代HDI，先将SBC-αCLC与BCP通过涡旋混合，并置于140 °C烘箱中加热至BCP完全熔化并溶解（此步骤可能需要长达2 h）。BCP完全溶解后，将其从烘箱中取出，加入Sn(Oct)2，再进行涡旋混合。</li>
	<li>通过裁剪一块1 × 4 cm的金属片制备&#34;牺牲性&#34;镍泡沫模板。从短边一端开始卷起，使最终卷成的金属片尺寸约为1 × 1 cm（见图4）。</li>
	<li>将镍泡沫放入玻璃小瓶或铝箔袋中，倒入步骤7.1制备的混合物，完全覆盖泡沫并保持2 min。用巴斯德吸管移除多余混合物，随后在80 °C烘箱中静置过夜。</li>
	<li>剥去铝箔或打破玻璃容器。使用剃刀刀片刮除金属泡沫周围的弹性体，以暴露镍金属表面。</li>
	<li>在100 mL水中配制1 M三氯化铁（FeCl3）溶液。将泡沫放入烧瓶中，加入70 mL FeCl3溶液。在室温下搅拌三天，每天更换一次FeCl3溶液。每次更换前，用去离子水搅拌泡沫0.5 h。 
	注：蚀刻过程通常在三天后完成。为确保蚀刻完全，可进行触觉压缩测试，直至泡沫手感变软。若泡沫在触觉压缩测试中仍具阻力，则表明残留有金属模板。</li>
	<li>用乙醇冲洗弹性体泡沫，并在40 °C真空烘箱中干燥过夜。</li>
	<li>采用扫描电子显微镜（SEM）、差示扫描量热法（DSC）、机械压缩测试和热重分析（TGA）对材料进行表征27。 
	注：若需制备更具亲水性的三维液晶弹性体（LCE），可按照步骤7.5所述方法，将SBC替换为LBC（需确保LBC也含有液晶基元）。</li>
</ol>
8. 使用无菌技术将SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞接种至弹性体支架并进行培养
<ol>
	<li>用1 mL 70%乙醇清洗弹性体两次，对其进行灭菌。进行10分钟紫外照射，并用1 mL 70%乙醇再次清洗。再用1 mL无菌水和1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）各冲洗两次。将弹性体置于24孔细胞培养板中。</li>
	<li>准备含90%杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）的SH-SY5Y细胞生长培养基。</li>
	<li>使用血细胞计数器计数细胞后，将1.5 × 105个SH-SY5Y细胞重悬于100 μL培养基（接种液）中。将该溶液滴加至弹性体表面，确保形成液滴。</li>
	<li>将接种后的弹性体在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，以促进细胞贴壁。然后加入0.5 mL培养基，再次于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>每隔一天用1 mL PBS清洗后更换培养基。</li>
</ol>
9. 弹性体结构的显微成像
<ol>
	<li>用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定生长在弹性基底上的细胞，固定15分钟。用3 mL PBS洗涤三次，每次5分钟，然后将带有固定细胞的弹性基底放入培养皿中，并附上盖玻片。 
	注意：PFA具有毒性，请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>用500 µL PBS中的0.1% 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对固定后的样品染色10分钟，随后用1 mL PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>立即使用共聚焦显微镜结合DAPI荧光对弹性基底进行成像，获取贯穿整个样品的图像序列。 
	注：本实验中使用20X物镜和60X物镜获取图像序列。</li>
	<li>使用ImageJ32分析光学共聚焦图像序列。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

液晶弹性体最近因其对刺激的响应性而被研究作为生物相容性细胞支架。已证明其是理想的细胞支架平台。然而，在制备和设计新型液晶弹性体（LCE）支架时，一个重要的考虑因素是多孔性。引入可溶性固体23或气体并不总能产生均一的孔隙结构或完全相互连通的孔道。使用可被刻蚀去除的金属模板，不仅能够获得更有序且规则的内部结构，还可实现对孔径大小和孔密度的调控。该方法直接借鉴了先前用于制备石墨烯泡沫的金属模板技术22。金属模板还可在LCE交联前预先成型，从而为构建具有规则多孔结构的复杂精密构型提供了广泛的可能性，这些结构可被设计成更接近内源性微环境。采用此方法制备的泡沫状LCE材料有助于更深入地研究细胞与材料之间的相互作用，更重要的是，可研究细胞间的空间相互作用，这是在二维（2D）环境中无法实现的。二维细胞支架无法使细胞与邻近细胞自由地相互作用。此外，细胞通常以单层形式生长（或直接堆叠生长），缺乏充分的空间进行生长，更重要的是，缺乏进行相互作用所需的空间。在设计可能用于植入物或长期实验平台的构建体时，某些具有特定空间相互作用特性的细胞类型（如神经元和胶质细胞）尤为...

已有多种生物相容性合成材料被设计用于细胞研究及组织再生，旨在促进细胞黏附与增殖1,2,3,4,5已有一些生物相容性材料的实例，称为液晶弹性体（LCEs），可在外部刺激下通过各向异性的分子取向产生响应6,7液晶弹性体（LCEs）是一类对外界刺激响应的材料，兼具弹性体的力学与弹性特性以及液晶的光学功能和分子有序性。8,9. 液晶弹性体（LCEs）可在外界刺激下发生形状变化、力学形变、弹性行为及光学性质的改变即., 热、胁迫、光 等等。)10,11,12,13,14,15,16早期研究表明，液晶（LCs）能够感知细胞的生长和取向4,17因此可以推测，液晶弹性体（LCEs）可能适用于具有生物学和医学意义的应用，包括细胞支架和定向排列。我们此前已报道过层状生物相容性、可生物降解、浇铸成型且厚度较薄的LCE薄膜的制备方法，该薄膜具有 &#34;瑞士奶酪型&#34; 多孔形态6,18我们还制备了具有球状形态的向列相生物相容性液晶弹性体，用作细胞生长的支架19,20我们的研究旨在调节材料的力学性能，以匹配目标组织的力学特性21此外，这些研究还致力于理解弹性体与细胞之间的相互作用，以及当弹性体受到外部刺激时细胞的响应。
主要挑战部分在于调整LCEs的孔隙率，以促进细胞附着并使细胞穿透弹性体基质，从而改善传质效果。这些薄膜的孔隙率6虽允许细胞穿透基质整体，但并非所有孔隙都完全相互连通，且孔径大小不够均匀（均一性较差）。随后，我们报道了具有球状形貌的生物相容性向列相LCE弹性体。这些向列相弹性体支持细胞的附着与增殖，但其孔径范围仅为10–30 µm，限制了这类弹性体在更广泛细胞系中的应用19,20。
Kung 等此前关于使用&#34;牺牲性&#34;金属模板制备石墨烯泡沫的研究表明，所得石墨烯泡沫具有高度规整的多孔形貌，其结构由所选金属模板决定22。该方法可完全控制孔隙率和孔径大小。同时，金属模板良好的延展性和柔韧性允许在泡沫制备前形成不同的模板形状。其他技术，如材料沥滤23、气体模板法24或静电纺丝纤维25,26也可用于制备多孔材料，但这些方法耗时更长，且在某些情况下孔径仅限于几微米。利用金属模板制备的类泡沫三维液晶弹性体（LCE）可实现更高的细胞负载量、更优的增殖速率、共培养能力，以及最重要的是，更佳的物质传输管理（即营养物质、气体和代谢废物的传输），从而确保组织的充分发育27。类泡沫三维LCE还表现出改善细胞取向的能力；这很可能与液晶侧链感知细胞生长和取向有关。LCE内部液晶基元的存在似乎增强了细胞在支架内特定位置的取向性。细胞沿LCE的支柱结构排列，而在支柱交汇处（连接点）则未观察到明显的取向性27。
总体而言，我们的液晶弹性体（LCE）细胞支架平台作为一种细胞支撑介质，能够调控弹性体的形貌和弹性特性，并可特异性引导（单个）细胞类型的排列，从而构建出类似于生物系统的有序空间细胞结构。该支架不仅能支持并引导细胞长期生长与增殖，LCE材料还支持动态实验，可在实验过程中实时调节细胞的取向与相互作用。

<table><tbody><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-八氟辛基三乙氧基硅烷</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16606</td><td>硅烷化试剂</td></tr><tr><td>2-双(4-羟基环己基)丙烷</td><td>TCI</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tcichemicals.com/eshop/zh/cn/commodity/B0928/&quot;&gt;B0928&lt;/a&gt;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2-氯己酮&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18613</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2-庚酮&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W254401</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>2-丙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>间氯过氧苯甲酸，m-CPBA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>273031</td><td>试剂</td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13016</td><td>试剂</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>核染色</td></tr><tr><td>5-己炔酸&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25132-06</td><td>试剂</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>VWR</td><td>36289</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34850</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>酒精 200 proof ACS 级&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>71001-866</td><td>试剂</td></tr><tr><td>苯</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA33290</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>&amp;epsilon;ε-己内酯&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10299-0E</td><td>试剂</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8503</td><td>试剂</td></tr><tr><td>六氧化铬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232653</td><td>试剂</td></tr><tr><td>碘化亚铜</td><td>Strem Chemicals</td><td>100211-060</td><td>试剂</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-L-丙交酯&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09026</td><td>试剂</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>乙醚&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0190</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基，DEME&amp;nbsp;</td><td>康宁 Cellgo</td><td>10-013</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>33361</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>甲醛&amp;nbsp;</td><td>SIGMA生命科学</td><td>F8775</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>胎牛血清，FBS&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td>媒体组分</td></tr><tr><td>滤纸，415号，定性，皱纹</td><td>VWR</td><td>28320</td><td>过滤</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>中心节点（三臂）</td></tr><tr><td>六亚甲基二异氰酸酯，HDI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52649</td><td>交联剂</td></tr><tr><td>氯化铁(III)&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>12357</td><td>蚀刻剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>VWR</td><td>BDH1133</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13255</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;二环己基碳二亚胺</td><td>Aldrich</td><td>D80002</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>镍金属模板</td><td>American Elements</td><td>Ni-860</td><td>泡沫模板</td></tr><tr><td>神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>聚乙二醇 2000，PEG</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>试剂</td></tr><tr><td>叠氮化钠&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>试剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>AMRESCO</td><td>865</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-374</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Alfa Aesar</td><td>41819</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>AMRESCO</td><td>393</td><td>干燥盐</td></tr><tr><td>锡(II) 2-乙基己酸盐</td><td>Aldrich</td><td>S3252</td><td>试剂</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Alfa Aesar</td><td>22903</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>细胞脱离</td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生物相容性液晶弹性体泡沫的合成及其作为三维空间细胞培养细胞支架的应用

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

在此，我们介绍一种三维、可生物降解、泡沫状细胞支架的逐步制备方法。这些支架通过交联带有胆固醇单元作为侧链悬挂基团的星形嵌段共聚物制备而成，形成近晶-A（SmA）液晶弹性体（LCEs）。利用金属模板制备的泡沫状支架具有相互连通的微通道，适合作为三维细胞培养支架。金属泡沫的规则结构与弹性体特性的结合，使该三维细胞支架不仅相较于传统的多孔模板薄膜能够促进更高的细胞增殖，还能更有效地调控物质传输。即， 营养物质、气体、废物 等等。）。金属模板的性质使得泡沫形状易于操控（即， 卷材或薄膜）以及制备具有不同孔径、用于不同细胞研究的支架，同时保持模板固有的相互连通的多孔结构。蚀刻过程不影响弹性体的化学性质，从而保留其生物相容性和可生物降解特性。我们证明，这些层状液晶弹性体在长时间培养条件下，能够支持临床相关且复杂的组织构建物的研究，同时促进细胞的生长与增殖。

本报告展示了利用镍金属模板制备多孔三维液晶弹性体（LCE）作为细胞培养支架的方法。所获得的三维LCE具有复杂的相互连通的通道网络，有利于细胞的充分浸润以及更高效的物质传输27。研究发现，细胞能够完全穿透该相互连通的通道网络，并在LCE内部实现定向排列。本实验选用金属镍泡沫（99% Ni，密度为860 g/cm2），其选择依据类似于Kung et al.22此前报道的石墨烯泡沫制备方法。通过在金属泡沫上进行聚合物浇铸，确保所有金属支柱均被完全包覆。金属泡沫的尺寸和密度选择至关重要，因其将决定LCE的最终形貌，并有助于模拟特定目标组织的微环境。
聚合物铸模的制备基于以甘油为基底的三臂星型嵌段共聚物（SBC）通过开环聚合（ROP）进行交联。单体包括ε-己内酯、改性ε-己内酯（为引入后续可被液晶基团取代的卤素原子而合成）以及 ...

本研究介绍了一种基于生物相容性侧链型液晶弹性体（LCEs）制备三维可生物降解泡沫状细胞支架的方法。共聚焦显微镜实验表明，泡沫状LCEs能够支持细胞黏附、增殖，并促进C2C12成肌细胞的自发性排列。

在此，我们介绍一种三维、可生物降解、泡沫状细胞支架的逐步制备方法。这些支架通过星型嵌段共聚物交联制备而成……

本实验的目的是制备基于生物相容性侧链液晶弹性体的可生物降解三维泡沫状细胞支架。该方法有助于回答液晶与生物医学领域中的关键问题，例如液晶弹性体的性质对细胞增殖和排列的影响。相较于二维细胞支架，该方法的主要优势在于能够研究空间上的细胞-细胞相互作用，而此类相互作用在二维宏观环境中极难实现。通常，初次接触该方法的研究人员在进行触觉压缩测试时会遇到困难。我们在不得不更换数百个培养皿中的培养基后，首次萌生了这一方法的想法。我们当时在思考，是否可以利用液晶弹性体在三维网络上支撑肌肉细胞，从而避免使用如此多的培养皿。该方法的可视化演示至关重要，因为某些步骤需要对化学品进行精细操作。此外，金属泡沫模板的成型可能具有挑战性。首先，取一个20毫升安瓿瓶，加入体积分数为2%的PFOTES甲苯溶液。在安瓿瓶中搅拌溶液24小时，以硅烷化安瓿瓶内表面。用异丙醇冲洗硅烷化后的安瓿瓶，并在140°C下干燥30分钟。向干燥的安瓿瓶中加入3.64克蒸馏的ε-己内酯、0.5克α-氯代-ε-己内酯和0.25毫升甘油。将混合物涡旋震荡一分钟。然后，向混合物中加入 4.90 克 DL-丙交酯，并用氮气吹扫安瓿瓶内的气氛一分钟。用铝箔覆盖安瓿瓶开口，将混合物在 120 摄氏度下加热约两小时，使 DL-丙交酯熔化。涡旋混合物以破坏任何未熔化的固体，然后向安瓿中加入66 µL的10-2-乙基己酸酯，并再次涡旋。用铝箔封住安瓿，将混合物在120 °C加热10分钟，使DL-丙交酯重新熔化。待DL-丙交酯再次熔化后，剧烈涡旋混合物，并用氮气吹扫安瓿内的气氛。用橡胶隔垫密封安瓿瓶。将连接至真空管线的针头插入隔垫，启动真空。小心地用火焰密封安瓿瓶瓶颈，注意避免熔化橡胶塞。颈管密封后，将反应混合物在140摄氏度下加热48小时。然后让混合物冷却至室温。打开安瓿瓶，将黏稠的反应混合物溶于10毫升二氯甲烷中。将混合物转移至分液漏斗中。取一个烧瓶，加入100毫升甲醇，并将其置于干冰和丙酮浴中，使甲醇冷却至约负78摄氏度。待甲醇冷却后，将分液漏斗固定在烧瓶上方。以每秒两滴的速度将反应混合物加入到冷甲醇中。用滤纸收集生成的白色沉淀物。在50至60摄氏度的真空烘箱中干燥该沉淀物，得到三臂α-氯代SBC产物。为了制备α-胆固醇三臂星型嵌段共聚物（SBC），需将侧链上的氯原子替换为叠氮基团。通过与胆固醇-5-己炔酸酯进行点击反应，引入作为液晶基元的侧链胆固醇。开始制备液晶弹性体支架时，将0.75克α-胆固醇三臂SBC与0.25毫升HDI及0.24毫升蒸馏的ε-己内酯混合。加入60微升10-2-乙基己酸酯并涡旋混合。然后，裁剪一块一厘米乘四厘米的镍金属泡沫。将镍金属泡沫卷成一个直径一厘米、高一厘米的圆柱体，作为液晶弹性体泡沫支架的模板。将模板放入玻璃小瓶或铝箔容器中，倒入液晶弹性体混合物，直至完全覆盖模板。让模板在液晶弹性体混合物中静置两分钟，然后用移液器除去多余的混合物。将混合物和模板在80摄氏度下加热过夜。然后，揭开铝箔或击碎玻璃。使用剃刀刀片去除多余的液晶弹性体，以暴露镍金属模板。将泡沫放入烧瓶中，并加入70毫升饱和的三氯化铁水溶液。在室温下将泡沫在溶液中搅拌三天，以溶解镍模板。每24小时，将泡沫在去离子水中搅拌30分钟，然后继续在新鲜的三氯化铁溶液中搅拌。在第二天搅拌结束后，对液晶弹性体泡沫进行触觉压缩测试。触压阻力表明泡沫中仍残留镍模板。第三天后，所有镍模板均已被完全去除，所得泡沫显得非常柔软，易于完全压缩。必须彻底消除镍模板。在进行触觉压缩测试时，需用氯化铁充分冲洗液晶弹性体泡沫，直至其触感柔软。此时，液晶弹性体泡沫支架已准备就绪，可用于表征和使用。一旦液晶弹性体泡沫变软，需用70%乙醇冲洗以进行灭菌。开始接种程序时，先用一毫升70%乙醇将液晶弹性体泡沫支架清洗两次，以对弹性体表面进行灭菌。然后，用紫外光照射支架10分钟。再用另一份一毫升70%乙醇清洗支架。用无菌水和磷酸盐缓冲液分别冲洗支架各1毫升。将灭菌后的液晶弹性体支架放入24孔细胞培养板中。在含有青霉素和链霉素的适当细胞生长培养基中制备并计数目标细胞悬液。用培养基将细胞悬液稀释至每100微升含1.5 × 10⁵个细胞。将稀释后的细胞悬液滴加到每个液晶弹性体支架表面。将接种了细胞的液晶弹性体支架置于37°C、5%CO₂气氛中孵育2小时。向每个支架中再添加0.5毫升培养基，继续培养。每48小时，用1毫升PBS洗涤接种后的支架，并更换新鲜培养基。持续培养支架，直至细胞准备好进行显微镜观察。这些近晶相液晶能够实现对复杂组织结构的构建研究，同时促进细胞的生长与增殖。为维持细胞活性，必须对泡沫材料进行灭菌处理，并始终保证培养环境的洁净。为进行显微镜观察，需使用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定支架上的细胞，作用时间为15分钟。将样本在 3 毫升 PBS 中浸泡 3 次，每次 5 分钟。取一个支架样本放入 Eppendorf 管中。用含有 0.1% DAPI 的 PBS 溶液 500 微升对样本染色 10 分钟。将样品在1毫升PBS中浸泡两次，每次5分钟。随后立即使用共聚焦显微镜对样品进行成像。获取跨越样品的图像序列，并在图像处理程序中分析数据。以HDI为交联剂，将含液晶基团的三臂SBC浇铸在镍泡沫模板上。通过刻蚀去除镍模板，得到液晶弹性体泡沫。定期进行压缩形变测试以监测刻蚀过程。镍完全溶解后，压缩变形测试显示其压缩时尺寸减小了70%。释放压力后，液晶弹性体泡沫始终恢复至原始尺寸和形状。这种行为归因于液晶基团，因为缺乏胆固醇-ε-己内酯基团的类似弹性体泡沫在压缩后无法恢复。内部泡沫形态的扫描电镜图像显示，泡沫支柱形成了相互连通的中空网络结构。这种规则的形态归因于镍泡沫的结构，表明通过选择合适的金属模板可以控制孔径大小和整体形状。将神经母细胞瘤细胞接种于该泡沫支架上，细胞在两天内即附着于网络的壁面上。接种30天后，共聚焦显微镜显示，细胞在液晶弹性体网络上延伸，并在整个弹性体泡沫中形成多层分布结构。观察到细胞核发生拉长，且与细胞排列方向相关。若操作得当，掌握该技术后可在三至四周内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和制备具有特定孔径尺寸与形貌的液晶弹性体细胞支架。在实施该实验流程时，需对每种产物进行全面表征，并监测细胞活力与增殖情况。此外，正确的染色技术对于顺利获取共聚焦显微镜图像至关重要。采用该方法后，还可将液晶弹性体暴露于外部刺激（如应力、磁场和电场）下，以进一步探究液晶弹性体的各向异性分子取向如何影响细胞反应。该技术的应用意义在于疾病过程的研究，因为它提供了一个可动态研究外部因子对模拟疾病活动及其后续修复过程影响的平台。尽管这种层状液晶弹性体泡沫可为细胞间相互作用提供见解，但也可与其他材料（如半导体或金属纳米结构）联合使用。该技术问世后，为生物医学领域的研究人员设计模拟生命系统的长期实验平台铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

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生物工程

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细胞外基质，脱细胞组织，生物支架，冷冻干燥，组织工程，泡沫材料

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