生物相容性液晶弹性体泡沫的合成及其作为三维空间细胞培养细胞支架的应用

本实验的目的是制备基于生物相容性侧链液晶弹性体的可生物降解、三维泡沫状细胞支架。该方法有助于解答液晶材料与生物医学领域中的关键问题，例如液晶弹性体的性质对细胞增殖和取向的影响。这种二维细胞支架方法的主要优势在于，它能够研究在二维宏观环境中难以实现的空间细胞-细胞相互作用。

通常，初次接触该方法的人会在触觉压缩测试方面遇到困难。我们最初是在不得不更换数百个培养皿中的培养基后，萌生了这一方法的想法。我们当时考虑，是否可以利用液晶弹性体构建三维网络来支持肌肉细胞生长，从而避免使用大量培养皿。

该方法的可视化演示至关重要，因为某些步骤需要对化学品进行精细操作。此外，金属泡沫模板的塑形可能具有挑战性。首先，取一个20毫升的安瓿瓶，加入体积分数为2%的PFOTES甲苯溶液。

在安瓿瓶中搅拌溶液24小时，以硅烷化安瓿瓶内表面。用异丙醇冲洗硅烷化后的安瓿瓶，并在140 °C下干燥30分钟。将3.64 g蒸馏的ε-己内酯、0.5 gα-氯代-ε-己内酯和0.25 mL甘油加入干燥的安瓿瓶中。

将混合物涡旋震荡一分钟。然后，向混合物中加入4.90克DL-丙交酯，并用氮气吹扫安瓿瓶内的气氛一分钟。用铝箔覆盖安瓿瓶开口，将混合物在120摄氏度加热约两小时，使DL-丙交酯熔化。

涡旋混合物以破坏任何未熔化的固体，然后向安瓿中加入66微升的10-2-乙基己酸酯，并再次涡旋。用铝箔封闭安瓿，将混合物在120摄氏度加热10分钟，使DL-丙交酯重新熔化。一旦DL-丙交酯再次熔化，剧烈涡旋混合物，并用氮气吹扫安瓿内的气氛。

用橡胶隔垫密封安瓿瓶。将连接至真空管线的针头插入隔垫，启动真空。用火焰密封安瓿瓶的颈部，注意不要熔化橡胶塞。

颈管密封后，将反应混合物在140摄氏度加热48小时。然后让混合物冷却至室温。打开安瓿瓶，将黏稠的反应混合物溶于10毫升二氯甲烷中。

将混合物转移至分液漏斗中。取一个烧瓶，加入100毫升甲醇，并将其置于干冰和丙酮浴中，使甲醇冷却至约负78摄氏度。待甲醇冷却后，将分液漏斗固定在烧瓶上方。

以每秒两滴的速度将反应混合物加入冷甲醇中。用滤纸收集生成的白色沉淀。在50至60摄氏度的真空烘箱中干燥该沉淀，得到三臂α-氯代SBC产物。

为了制备α-胆固醇基三臂SBC，需将侧链上的氯原子替换为叠氮基团。通过与胆固醇-5-己炔酸酯发生点击反应，生成带有胆固醇基团的侧链，作为液晶基元。开始制备液晶弹性体支架时，将0.75克α-胆固醇基三臂SBC与0.25毫升HDI及0.24毫升蒸馏的ε-己内酯混合。

向其中加入 60 µL 的 10-2-乙基己酸酯，并涡旋混合。然后，裁剪一块 1 厘米 × 4 厘米的镍金属泡沫。将镍金属泡沫卷成一个直径为 1 厘米、高为 1 厘米的圆柱体，用作液晶弹性体泡沫支架的模板。

将模板放入玻璃小瓶或铝箔包裹中，倒入液晶弹性体混合物，直至完全覆盖模板。让模板在液晶弹性体混合物中静置两分钟，然后用移液器除去多余的混合物。将混合物和模板在80摄氏度下加热过夜。

然后，揭去铝箔，或击碎玻璃。使用剃刀刀片去除多余的液晶弹性体，以暴露镍金属模板。将泡沫放入烧瓶中，并加入70毫升饱和的三氯化铁水溶液。

在室温下将泡沫在溶液中搅拌三天，以溶解镍模板。每24小时，将泡沫在去离子水中搅拌30分钟，然后继续在新鲜的三氯化铁溶液中搅拌。在第二天搅拌结束后，对液晶弹性体泡沫进行触觉压缩测试。

对触压的阻力表明泡沫中仍存在镍模板。第三天后，所有镍模板均已去除，所得泡沫显得非常柔软，易于完全压缩。必须彻底去除镍模板。

在进行触觉压缩测试时，需用氯化铁充分冲洗液晶弹性体泡沫，直至其触感柔软。此时，液晶弹性体泡沫支架已准备就绪，可用于表征和使用。一旦液晶弹性体泡沫变软，需用70%乙醇冲洗以实现灭菌。

开始接种程序时，先用一毫升70%乙醇将液晶弹性体泡沫支架再清洗两次，以对弹性体表面进行灭菌。然后，用紫外光照射支架10分钟。再用另一份一毫升70%乙醇清洗支架。

用无菌水和磷酸盐缓冲液各一毫升冲洗支架。将灭菌后的液晶弹性体支架装入24孔细胞培养板中。在含有青霉素和链霉素的适当细胞生长培养基中制备并计数目标细胞的悬浮液。

用培养基将细胞悬液稀释至每100微升含1.5 × 10⁵个细胞。将一滴稀释后的细胞悬液滴加至每个液晶弹性体支架表面。将接种了细胞的液晶弹性体支架在37°C、5% CO₂气氛条件下孵育两小时。

向每个支架中再添加 0.5 毫升培养基，继续孵育。每 48 小时，用 1 毫升 PBS 清洗接种后的支架，并更换新鲜培养基。持续孵育支架，直至细胞准备好进行显微镜观察。

这些近晶相液晶可实现对复杂组织结构的构建研究，同时促进细胞的生长与增殖。为维持细胞活性，必须对泡沫材料进行灭菌处理，并始终确保培养环境的洁净。为进行显微镜观察，需使用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定支架上的细胞，作用时间为15分钟。

将样品在 3 毫升 PBS 中浸泡三次，每次 5 分钟。取一个支架样品放入一个 Eppendorf 管中。用 500 微升 PBS 中含 0.1% DAPI 的溶液对样品染色 10 分钟。

将样品在1毫升PBS中浸泡两次，每次五分钟。随后立即使用共聚焦显微镜对样品进行成像。获取跨越样品的图像序列，并在图像处理程序中分析数据。

以HDI为交联剂，将含液晶基团的三臂SBC浇铸在镍泡沫模板上。通过刻蚀去除镍模板，得到液晶弹性体泡沫。定期进行压缩形变测试以监测刻蚀过程。

镍完全溶解后，压缩变形测试显示其压缩时尺寸减小了70%。释放压力后，液晶弹性体泡沫 consistently 恢复至原始尺寸和形状。这种行为归因于液晶基团，因为缺乏胆固醇ε-己内酯基团的类似弹性体泡沫无法从压缩状态恢复。

内部泡沫形貌的扫描电镜图像显示，中空泡沫支柱形成了相互连通的网络结构。这种规则的形貌归因于镍泡沫的结构，表明通过选择合适的金属模板可以控制孔径大小和整体形状。该泡沫被接种了神经母细胞瘤细胞，细胞在两天内即附着于网络的壁上。

接种后30天，共聚焦显微镜显示，细胞在液晶弹性体网络上延伸，并在弹性体泡沫中形成多层分散结构。观察到细胞核发生伸长，且与细胞排列方向相关。若操作得当，该技术掌握后可在三到四周内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和制备具有特定孔径大小和形貌的液晶弹性体细胞支架。在尝试该操作过程中，对每种产物进行全面表征，并监测细胞活力与增殖情况至关重要。此外，正确的染色技术对于顺利获取共聚焦显微镜图像也十分重要。

采用此方法后，还可将液晶弹性体暴露于外部刺激（如应力、磁场和电场）下，以进一步探究液晶弹性体的各向异性分子取向如何影响细胞反应。该技术的应用意义在于疾病过程的研究，因为它提供了一个可动态研究外部因子对模拟疾病活动及其后续修复过程影响的平台。尽管这种近晶相液晶弹性体泡沫可为细胞间相互作用提供见解，但它也可与其他材料（如半导体或金属纳米结构）联合使用。

该技术问世后，为生物医学领域的研究人员设计可长期运行、模拟生命系统的实验平台铺平了道路。