Name: 面对小鼠血液制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习小鼠主动脉和颈动脉的免疫荧光铺片制备技术，用于研究血管壁蛋白定位与细胞类型。该方法结合共聚焦显微镜实现高分辨率成像，为血管生物学研究提供重要工具。

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作者的研究工作得到了美国国立卫生研究院向Abe博士提供的资助（HL-130193、HL-123346、HL-118462、HL-108551）。

小鼠颈动脉部分结扎以及主动脉和颈动脉的分离以进行内皮面免疫染色的实验方案已获得机构动物护理和使用委员会批准（IBT 2014-9231）。
1. 左侧颈总动脉部分结扎
<ol>
	<li>通过在桌面上放置一个 12 英寸 × 14 英寸的加热垫，并用一张大的无菌手术单覆盖加热垫和桌面，准备手术区域。调整吊臂支架的臂部，使体视显微镜的视野位于加热垫的中心区域。</li>
	<li>打开桌面上的加热垫，将三档控温旋钮调至中等加热档位。在此温度设置下，手术板表面（见 1.6.1）温度将维持在 38–40 °C。
	<ol>
		<li>将一个洁净的笼子放在另一个加热垫上，按上述方法打开加热垫。该笼子将用于术后恢复（见 1.16）以及日常饲养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在手术台上放置一个已高压灭菌的灭菌袋，内含虹膜剪（1 对）、组织镊（1 对）、防滑镊（2 对）、弹簧剪（1 对）、钝性牵开器（1 对；宽 2.5 mm）、圆柄持针器（1 个）、灭菌的 6-0 丝线缝合线、棉签、迷你棉签、手术单，以及 2&#34; × 2&#34; 纱布块。同时在手术台上放置一个装有 70% 乙醇的挤压瓶和另一个装有氯己定外科洗手液的挤压瓶。</li>
	<li>称量小鼠体重。根据体重确定术前应给予的镇痛药剂量，该药物将在手术开始前立即给予。</li>
	<li>将小鼠放入诱导室中。</li>
	<li>打开氧气瓶和麻醉蒸发器，以对诱导室中的小鼠进行麻醉。维持异氟烷浓度为 2%。小鼠通常在 3–5 分钟内停止活动。
	<ol>
		<li>在小鼠麻醉过程中，将一块较小的无菌手术单（24 英寸 × 24 英寸）置于体视显微镜下方，以形成无菌手术面。然后将一块已用 70% 酒精清洁过的丙烯酸手术板放置在铺好的手术单上。因此，手术板应位于加热垫上，但被两层手术单隔开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠在诱导室中停止活动后，将其转移至术前准备区，并将其鼻部置于连接麻醉蒸发器（2% 异氟烷）的鼻罩中。使用电动剃毛器或脱毛膏去除颈部区域的毛发。推荐使用脱毛膏，因为该方法不会产生松散的毛发碎片，而这些碎片很难从手术区域彻底清除。</li>
	<li>保持鼻罩位置不变，将小鼠移至手术板上。
	<ol>
		<li>用胶带将小鼠的左右前肢固定在手术板上。将两只后肢一起用胶带固定在小鼠右侧。这会使小鼠身体轻微旋转，从而使小鼠颈部左侧更有利于手术操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 70% 酒精、氯己定外科洗手液，再用 70% 酒精依次消毒切口区域。除颈部切口区域外，其余部位用灭菌手术单覆盖。</li>
	<li>通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉，并通过腹腔或皮下注射给予镇痛药（卡洛芬 3–5 mg/kg）via。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用手术刀或虹膜剪在颈部区域做一条腹侧正中切口。 
	注：我们通常使用剪刀，因为体视显微镜的工作距离有限，使用手术刀较为困难。</li>
	<li>将覆盖在血管上的唾液腺向动物左侧推开并重新定位，以暴露左侧颈总动脉（LCCA）。</li>
	<li>识别手术视野内的所有血管（图 1）。左侧颈总动脉（LCCA）分为左侧颈内动脉（ICA）和左侧颈外动脉（ECA）。甲状腺浅动脉（STA）起源于 ECA 的内侧。枕动脉（OA）通常起源于 ECA，但在某些小鼠中可能起源于 ICA。</li>
	<li>使用灭菌的 6-0 丝线结扎除 OA 外的所有动脉分支。为此，完成以下两个结扎步骤。
	<ol>
		<li>轻轻去除左侧颈内动脉（ICA）周围及下方的结缔组织。用镊子夹取一段预先剪好的 6-0 丝线（约 2.5 cm），将其从动脉下方穿过。用另一对镊子将丝线拉出约其长度的 1/3，然后结扎该动脉。</li>
		<li>以同样方式去除左侧颈外动脉（ECA）周围的结缔组织，并在左侧甲状腺上动脉（STA）近端进行结扎（图 1）。注意避免损伤手术视野内穿行的神经纤维。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成上述结扎后，将唾液腺复位，并滴加 2–3 滴无菌生理盐水以保持手术区域湿润。使用 6-0 涂层薇乔缝线缝合皮肤。</li>
	<li>手术后，将小鼠放入预热的笼子中（见 1.2.1）。小鼠通常在 5 分钟内苏醒并开始活动。确认小鼠行为正常后，将其笼子转移至动物饲养室。</li>
	<li>术后前 3 天每日观察小鼠。根据实验方案要求，可在不同条件下长期饲养小鼠。手术后任意时间均可制备血管内皮铺片（en face preparations）。</li>
</ol>
2. En Face 免疫染色
<ol>
	<li>通过吸入过量 CO2 对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧位（腹部朝上）固定在解剖板上。</li>
	<li>使用虹膜剪沿腹中线做切口，暴露腹腔。</li>
	<li>沿胸骨两侧剪断肋骨，暴露胸腔。</li>
	<li>在下腔静脉或一侧股动脉上做小切口以排出血液。</li>
	<li>将连接于重力灌注装置（120 cm 水压）的 26 G 针头插入左心室心尖部，用含肝素（40 U/mL）的生理盐水灌注循环系统，持续灌注至流出液体变澄清为止。</li>
	<li>将灌注液由生理盐水更换为含 4% 多聚甲醛的 PBS（磷酸盐缓冲液）固定液，继续灌注 5 分钟。</li>
	<li>使用钝头剪刀和镊子取下主动脉及左右颈总动脉，置于含有固定液的 50 mL 锥形管中，并置于冰上。</li>
	<li>将血管转移至盛有 PBS 的培养皿中，在解剖显微镜下仔细去除附着在主动脉和颈总动脉上的脂肪和结缔组织。沿纵轴纵向分离并剖开主动脉和颈总动脉，以暴露内皮层（图 2）。</li>
	<li>将每根血管分别转移至 12 孔板中的一个孔，每孔加入 0.5 mL 通透液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS），在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟进行通透处理。</li>
	<li>用 PBS 短暂洗涤一次。</li>
	<li>为阻断非特异性抗体结合位点，将血管置于 TTBS（含 2.5% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水）中，加入来源于制备二抗的同种动物的 10% 正常血清，在室温下振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>将血管与适当稀释于含 10% 正常血清的 TTBS 中的一抗（稀释方法如上所述）在 4 °C 下振荡孵育过夜。每种一抗的稀释比例需预先优化确定。</li>
	<li>进行以下对照染色操作。
	<ol>
		<li>用 TTBS 代替一抗孵育血管，随后加入二抗孵育。</li>
		<li>用含有非免疫性（或免疫前）血清或与一抗来源动物（物种）相同的 Ig 的 TTBS 孵育血管，随后加入二抗孵育。</li>
		<li>省略二抗孵育步骤。这些对照样本必须与特异性抗体染色样本同时以相同方式处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 TTBS 在室温下振荡洗涤血管 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入适当稀释于含 10% 正常血清的 TTBS 中的荧光标记二抗，在室温下振荡孵育 1 小时。此步骤可同时加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）进行核染色，方法为加入终体积比 1/5,000 的 DAPI 储存液（含 5 mg/mL DAPI 的 H2O 溶液）。</li>
	<li>用 TTBS 在室温下振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 短暂冲洗一次。</li>
	<li>在盖玻片（22 mm × 50 mm）上滴加一滴抗荧光淬灭剂，将血管置于盖玻片上，使内皮面朝下。</li>
	<li>将载玻片（22 mm × 75 mm）覆盖在血管上，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将载玻片放置于洁净的实验用纸巾（例如 Kimwipe）上，并用两张实验用纸巾覆盖其上。在其上方轻压 3.5 kg 的重物（例如 将一瓶水放在厚书上），持续最多 5 分钟，以压平“内皮面朝下”（en face）的血管样本。</li>
	<li>移除重物，并擦去盖玻片周围的多余液体。</li>
	<li>在盖玻片的四个角涂抹指甲油，将载玻片放入载玻片盒中，盖玻片朝上，于室温（或 4 °C）避光静置过夜。此过程可进一步压平组织，便于高倍显微镜观察。</li>
	<li>用指甲油完全密封盖玻片边缘。</li>
	<li>待指甲油完全干燥后立即进行显微成像。</li>
	<li>如需长期保存，可将载玻片存于 -20 °C。</li>
</ol>

<ol><li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-%27thinned-wall%27+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li>
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<li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li>
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<li>Le, N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li>
<li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li>
<li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21173104">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li>
<li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10623329409024632">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep34331">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

在处理小鼠血管时，需要注意血管内皮非常脆弱，任何过度的机械力都会损伤内皮细胞。例如，若灌注力度过大，内皮细胞会破裂或从血管壁上脱落，而使用手动注射器进行血管灌注时很容易发生这种情况。
为了获得恒定的灌注压力，我们使用重力灌注系统，其水柱高度为120 cm，产生相应的压力。据报道，小鼠的平均动脉压因品系不同而异，范围在130至170 cm H2O之间14。因此，我们所采用的灌注压力略低于测得的动脉压。在对大鼠主动脉进行灌注固定时，使用了90 cm H2O的水柱压力6。
在血管收获、清洗、纵向剖开、免疫染色和封片过程中，如果血管被拉伸，原位内皮细胞也会受到损伤。事实上，机械性损伤是内皮细胞在铺片标本制备过程中丢失的常见原因之一。血管拉伸可能在操作的任何步骤中发生，但最常见于血管收获时。此外，在清除附着于外膜的脂肪组织时也容易导致血管拉伸。
<p class="jove_content"...

在利用光学显微镜进行组织病理学研究时，通常需要将三维的生物组织样本进行石蜡包埋，随后切片和染色。经过石蜡包埋的组织样本在三个维度上可能达到数毫米大小。然而，为了实现光学显微镜观察，必须首先将组织切成薄片，使光线能够穿透，再通过染色增强薄片的对比度，以便成像。由于切片样本的厚度通常仅为5–10 µm，每次在二维平面上仅能观察到整个样本极小的一部分。虽然可以通过连续收集切片，对每张切片单独成像后借助计算机进行三维图像的重建，但这一过程极为繁琐。血管组织病理学研究，尤其是动脉粥样硬化发病机制的研究，面临独特的挑战。动脉粥样硬化是一种局灶性疾病，通常在血流紊乱的局部区域发生。此外，该疾病起始于大动脉的内膜层，内膜是一层由单层内皮细胞及其细胞外基质构成的薄层组织。由于上述原因，利用切片血管来定位和研究早期病变极具挑战性，因为很容易在切片过程中错过病灶。即使某一切片包含了病变区域，观察到的也仅是厚度为5–10 µm的横断面，其中包含内皮细胞以及中膜和外膜中的其他血管壁细胞。
整体封片（en face，发音为än ˈfäs）制备技术使我们能够观察血管表面的大范围区域，例如从主动脉根部一直延伸至髂总动脉的整段主动脉。利用经特异性抗体及其他特异性探针染色的此类标本，可精确定位病变的位置，以及在动脉粥样硬化发生过程中内皮细胞内各种分子事件的发生位置，例如蛋白质表达水平、定位及翻译后修饰的变化。除了研究动脉粥样硬化的发生外，en face 制备标本中观察到的内皮细胞形态还可作为反映局部时间平均血流模式的指标。这类数据对于研究内皮细胞在原位的机械信号转导具有重要意义。而常规的组织学横切标本在此类研究中并不适用。因此，在血管医学与生物学领域，掌握一种能够制备血管 en face 标本的技术尤为重要，该技术需能够观察血管表面的大范围区域，同时也能观察血管更深层的亚表面结构。
正如Jelev和Surchev1所综述的，血管生物学家已开发出多种方法用于观察血管内壁的铺片结构。一些巧妙的方法早在20世纪40年代和50年代就已建立。利用这些方法，研究人员能够研究衬于血管内表面的内皮细胞的基本组织结构。然而，由于这些铺片样本的制备方式（即所谓的Hautchen法2,3,4，或剥离血管表面的方法5）以及染色方法的限制，通常难以从血管表面连续获取至血管壁深层区域的完整形态学信息。将整体铺片（whole mount）血管样本与免疫荧光染色技术相结合，使我们不仅能够研究内皮细胞的形态以及这些细胞中蛋白质的表达与定位，还能将此类研究拓展至血管壁的内皮下区域。使用免疫荧光染色的血管铺片样本进行研究的早期工作始于20世纪80年代6,7。随着激光扫描共聚焦显微镜以及近年来多光子显微镜的出现，现在已能够清晰地获取免疫荧光染色的铺片血管样本中血管壁结构的在焦图像，以及活体动物中血管网络的图像8,9,10,11。这些基于计算机的成像技术可生成在焦的光学切片图像，通过叠加这些图像，可以获得组织中血管壁及血管网络的重建三维图像。此外，还可以生成沿重建图像Z轴方向切面的图像12,13。
本文将介绍一种制备小鼠主动脉和颈动脉内皮面（en face）标本用于免疫荧光染色的方法。即使这些血管经过实验性操作后，仍可制备内皮面标本。例如，颈动脉可先进行部分结扎，术后仍可制备内皮面标本。因此，本文还将详细描述我们进行颈动脉部分结扎的操作方法。与大鼠、兔或人等较大动物的血管标本制备相比，小鼠血管体积较小且更为脆弱，因此在手术分离及后续抗体染色和显微镜观察过程中需格外小心。由于小鼠是目前最常用的基因修饰动物模型，对许多研究人员而言，能够在不损伤血管的前提下妥善处理小鼠血管显得尤为关键。本论文将详细介绍在制备小鼠主动脉和颈动脉内皮面标本时如何操作小鼠血管。为便于演示，我们将使用野生型 C57/b6 小鼠。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠注射液 USP 500 mL 袋装</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 涂层薇乔缝线</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 山羊抗大鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 山羊抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>抗 VCAM-1 (H-276) 兔多克隆 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto 流体系统</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>灭菌包裹布，24 英寸 × 24 英寸</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>钝头牵开器，宽 2.5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬 (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>氯己定擦洗液，2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity 纱布敷料 2 × 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>电热垫，12 × 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>超细 Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片 22 mm × 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛 PBS 溶液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100 mm × 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan 棉签</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan 迷你棉签</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>圆柄持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>丝线 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>斜视剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>防滑镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>透明敷料</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face 小鼠血管制备

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

石蜡包埋组织切片通常用于研究组织的组织学和组织病理学。然而，从这些切片中难以确定组织的三维形态结构。此外，所检测的组织切片可能并不包含研究目的所需的关键区域。这一局限性尤其阻碍了对血管的组织病理学研究，因为血管病变往往呈局灶性发展。因此，需要一种能够从血管壁表面至深层区域对血管壁进行大范围观察的方法。血管的全层平展（en face）制备技术恰好满足这一需求。在本文中，我们将演示如何制备小鼠主动脉和颈动脉的en face标本，并对其进行免疫荧光染色，以用于共聚焦显微镜及其他基于荧光的成像技术。

典型的内皮细胞表面免疫荧光图像如图所示 图3此图像显示了小鼠主动脉在肋间动脉开口附近的一个单个光学切片（较大的深色卵圆形区域）。主动脉经抗VE-钙黏蛋白（绿色）和抗VCAM-1（血管细胞黏附分子-1，红色）双重染色。每个内皮细胞的黏附连接处均可见绿色线性染色轮廓。由于样本存在轻微不平整，部分黏附连接位于该光学切片之外。在肋间动脉开口处，抗VCAM-1染色更强，该区域已知存在紊乱的血流。图4显示了颈总动脉的表面染色结果，使用抗VE-钙黏蛋白（绿色）、抗VCAM-1（红色）和DAPI（紫色）。左侧颈总动脉（LCA）部分结扎，右侧颈总动脉（RCA）未作处理。血管样本于手术后1天制备并染色。注意结扎侧血管中抗VCAM-1染色增强。经不同抗体免疫荧光染色的样本可用于研究目标蛋白的表达水平、翻译后修饰程度，以及各种蛋白在内皮细胞内和血管壁其他细胞中的定位模式。10,11.
<p class="jove_content" fo:...

本文描述了一种制备小鼠颈动脉和主动脉内皮面标本的方法。此类标本经特异性抗体免疫荧光染色后，可通过共聚焦显微镜观察整个血管壁内蛋白质的定位以及细胞类型的鉴定。

En Face 小鼠血管制备

石蜡包埋组织切片通常用于组织学和组织病理学研究。然而，很难确定……

本实验的总体目标是在小鼠左侧颈总动脉结扎后，制备主动脉和颈动脉以进行内皮面免疫染色。该方法使我们能够研究免疫染色中内皮细胞及其他血管细胞的排列结构、每种蛋白质的表达以及可能的状态。内皮面制备技术可实现对血管大范围区域的分析，从而评估不同区域中各种正常及可能的细胞参数表达差异。由本团队的显微外科医生 Dr.Quaico 演示该操作。首先将麻醉后的小鼠仰卧位固定于手术板上。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将其前肢伸展并用胶带固定于手术板上，同时将双侧后肢固定于小鼠右侧，以暴露其颈部左侧。去除颈部区域的毛发并消毒暴露的皮肤。用无菌手术单覆盖小鼠，手术区域对应开孔，并在动物眼睛上涂抹眼膏。将小鼠置于体视显微镜下，在颈部区域做腹侧正中切口。将覆盖血管的唾液腺移至动物左侧，以暴露左侧颈总动脉，该动脉分叉为左侧颈内动脉和左侧颈外动脉。轻柔去除左侧颈内动脉周围及下方的结缔组织，用镊子将一段预先剪好的2.5厘米长6-0丝线从动脉下方穿过，并用第二把镊子将丝线约三分之一长度拉至血管对侧。结扎左侧颈内动脉。然后如前所述，去除左侧颈外动脉周围的结缔组织，并在左侧甲状腺上动脉近端进行结扎。当除枕动脉外的所有动脉均结扎完毕后，将唾液腺复位至原始位置，并用两到三滴生理盐水润湿手术区域。接着使用六针6-0涂层薇乔缝线关闭皮肤，将小鼠置于预热的饲养笼中，持续监测直至完全恢复卧位。实验结束后，将小鼠仰卧位固定于解剖板上，使用虹膜剪沿腹中线切开，暴露腹腔。沿胸骨两侧剪断肋骨，暴露胸腔。随后切开股动脉，将连接于重力灌注装置的26号针头插入左心室心尖处，用含肝素的生理盐水灌注循环系统。继续灌注，直至从切口流出的生理盐水变得澄清。然后将灌注系统从生理盐水切换为含4%多聚甲醛的PBS溶液。五分钟后，将小鼠转移至解剖显微镜下，使用钝头剪刀和镊子取下主动脉以及左侧和右侧颈动脉。接下来，将组织转移至含有 PBS 的培养皿中，仔细去除脂肪和结缔组织，随后分离颈总动脉和主动脉，并沿纵轴切开，以暴露内皮层。制作血管内皮面铺片时最重要的一点是：内皮细胞在操作不当的情况下极易受损。在任何步骤中都不得牵拉血管，尤其是在组织收获和清洗过程中。然后将每个血管转移至含有0.5毫升通透化溶液的12孔板的各个孔中。室温下振荡孵育10分钟以通透血管，随后用PBS短暂洗涤。在TTBS中加入与计划使用的二抗同源物种的10%正常血清，室温振荡孵育30分钟，以阻断非特异性结合。然后将样本在含有10%正常血清的TTBS中，与目标一抗在4摄氏度下避光振荡孵育过夜。次日早晨，在室温下用TTBS振荡洗涤血管三次，每次10分钟，随后在含有10%正常血清和DAPY的TTBS中加入适当的二抗进行孵育。将样本放回摇床，并避光覆盖。在室温下轻轻摇动孵育一小时后，按所示方法用新鲜的TTBS洗涤样品三次，随后用PBS快速冲洗一次，并在每个样本的22 × 50毫米盖玻

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

面对小鼠血液制备

本文介绍了一种标记胚胎皮肤和胸腺血管的方法。...

一种用于胚胎小鼠血管标记的方法

本视频展示了一种从小鼠脑实质中分离血管内皮管的方法。通过酶消化与机械解离相结合，该方法可获得完整保留内皮细胞的血管管状结构。...

从小鼠脑实质微动脉制备脑血管内皮管

我们正在介绍一种用于检测血管通透性的体内实验方法。该方法基于静脉注射染料，随后观察其向间质空间的扩散情况。...

一个 体内 检测血管通透性的实验方法

我们描述了一种Matrigel栓塞实验，通过两种互补的成像方式——超声成像和内窥显微成像，来展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜能。Matrigel是一种模拟细胞外基质（ECM）的凝胶，可用于将癌细胞分泌至条件培养基（C.M.）中的促血管生成因子引入宿主（小鼠）体内。...

监测由快速生长的肿瘤形成细胞分泌因子招募的血管系统的功能与形态

我们描述了从C57Bl/6J对照小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠中分离心脏细胞外基质的方法。同时，我们还描述了对来自C57Bl/6J小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠的离体血管进行的血管舒张研究。...

紧皮小鼠离体血管舒张及细胞外基质的分离

许多威胁视力的眼部疾病与视网膜微血管功能障碍相关。因此，测量视网膜小动脉反应对于研究其潜在的病理生理机制具有重要意义。本文介绍了一种详细的小鼠视网膜小动脉分离与制备方案，用于评估血管活性物质对血管直径的影响。...

小鼠视网膜小动脉反应性测定前的准备步骤 离体

本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。...

利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en...

En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

我们展示了通过化学诱导小鼠大脑大血管扩张，作为研究脑血管功能障碍的模型，该模型可用于血管性痴呆和阿尔茨海默病的建模。我们还展示了通过注射硅橡胶化合物来可视化血管系统，并为测量血管尺寸变化提供清晰的视觉指导。...

一种用于诱导小鼠脑血管扩张以模拟大血管介导的脑血管功能障碍的可视化方法

通过球后注射荧光番茄凝集素后，采用血小板源性生长因子受体β的免疫荧光染色检测视网膜血管中的周细胞。标记后的视网膜经组织透明化处理，并整体封片，以便在共聚焦显微镜下观察围绕视网膜血管的周细胞的三维结构。...

通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

学习小鼠主动脉和颈动脉的免疫荧光铺片制备技术，用于研究血管壁蛋白定位与细胞类型。该方法结合共聚焦显微镜实现高分辨率成像，为血管生物学研究提供重要工具。

En Face 小鼠血管制备

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