面对小鼠血液制备

描述了制备小鼠颈动脉和主动脉的方法。当用特异性抗体进行免疫荧光染色时，这样的制剂使得我们能够研究蛋白质的定位和通过共聚焦显微镜在整个血管壁内鉴定细胞类型。

该程序的总体目标是准备小鼠主动脉和颈动脉，以便在左颈动脉结扎后进行 en face 免疫染色。这种方法使我们能够在免疫染色方法中研究胃窦细胞和其他血管细胞的组织、每种蛋白质表达和可能的状态。En face 制剂允许分析血管中的大面积，以评估各种正常和可能的细胞参数表达的区域差异。

演示该程序的将是我们小组的显微外科医生 Dr.Quaico。首先将麻醉的鼠标以仰卧位放在手术板上。确认对脚趾捏无反应后，将前爪以伸出位置贴在板上，将双后腿贴向鼠标右侧，露出颈部左侧。

去除宫颈区域周围的毛发并对裸露的皮肤进行消毒。用消毒的手术布覆盖鼠标，在手术区域上打一个孔，并在动物的眼睛上涂抹软膏。在解剖显微镜下移动鼠标，并在颈部区域周围做一个腹侧中线切口。

将覆盖血管的唾液腺重新定位到动物的左侧，以露出左颈总动脉，该动脉分叉为左颈内动脉和左颈外动脉。轻轻去除左颈内动脉周围和下方的结缔组织，用镊子将 2.5 厘米长的预剪六 O 丝缝合线穿过动脉下方，使用第二把镊子将缝合线拉出大约三分之一的长度到血管的另一侧。结扎左颈内动脉。

然后如前所述，去除左颈外动脉周围的结缔组织，并在左甲状腺上动脉近端进行结扎。当除枕动脉外的所有动脉都已结扎后，将唾液腺恢复到原来的位置，并用两到三滴生理盐水滋润手术区域。然后使用六条 O 涂层 vicryl 缝合线闭合皮肤，并将小鼠放入预热的笼子中，并进行监测，直至完全卧位。

实验结束时，将小鼠固定在解剖板上的仰卧位，并使用虹膜剪刀通过中线切口露出腹腔。将肋骨横向切到胸骨，露出胸腔。然后在股动脉上划开切口，并将一根 26 号针头插入左心室根部的重力增量装置上，以补充肝素的生理盐水充斥循环系统。

继续大量喷洒，直到从伤口流出的盐水变得清晰。然后将 profusion 系统从 PBS 中的 4% 多聚甲醛切换到 4%。五分钟后，将鼠标移动到解剖显微镜下，并使用钝头剪刀和镊子收获主动脉和左右颈动脉。

接下来，将组织转移到 PBS 培养皿中，小心去除脂肪和结缔组织，然后分离主动脉和颈动脉纵向分裂以暴露内皮。在进行 en face 血管准备时要记住的最重要的一件事是，粗暴处理很容易损坏内皮细胞。任何时候都不要拉伸容器，尤其是在收获和清洁步骤中。

然后将每个容器转移到 12 孔板的单个孔中，每孔含有 0.5 毫升透化溶液。在室温下摇动透化血管 10 分钟，然后在 PBS 中短暂洗涤。在 TTBS 中与计划的二抗相同物种的 10% 正常血清中孵育 30 分钟，并在室温下摇动，以阻断任何非特异性结合。

然后用在 TTBS 中用 10% 正常血清稀释的一抗标记样品，并在 4 摄氏度下摇动过夜。第二天早上，在 TTBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟，在室温下摇动冲洗血管，然后在用 TTBS 和 10% 正常血清和 dappy 稀释的适当二抗中孵育。将样品放回摇杆并盖上盖子避光。

在室温下摇晃 1 小时后，在新鲜的 TTBS 中洗涤样品 3 次，然后在 PBS 中短暂冲洗，并将每个容器滴一滴抗褪色试剂滴到 22 x 50 毫米的盖玻片上。在显微镜下，将一个血管放入每滴试剂中，内皮朝下，每个样品用一个 22 x 75 毫米的载玻片覆盖血管。将载玻片放在干净的实验室抹布上，并用两块实验室抹布和 3.5 公斤的重物覆盖它们，以压平容器。

最多五分钟后，取下重物，擦去盖玻片周围多余的溶液。然后在盖玻片的四个角上涂上指甲油，并将载玻片放入载玻片盒中，盖玻片面朝上。第二天早上，使用更多的指甲油将盖玻片完全密封，并在指甲油干燥后立即对血管进行成像。

这里显示了用抗 VE 钙粘蛋白和抗血管细胞粘附分子 one 抗体双染的内皮的典型正面免疫荧光图像，并说明了在肋间动脉开口附近拍摄的小鼠主动脉的单个光学切片。请注意内皮细胞粘附连接处的绿色线性轮廓染色和强抗血管细胞粘附分子，在已知血流紊乱的肋间动脉开口处有一个染色。在这些图像中，可以观察到手术后一天部分结扎的左颈动脉和对照未结扎的右动脉的 en face 染色，在结扎的血管中明显的抗血管细胞粘附分子增加一个染色。

观看此视频后，您应该对如何进行部分左颈动脉结扎和在小鼠血管中进行面部准备有很好的了解。将此与您的光学设备一起带到其他小动物。en face 制剂的使用现在仅限于免疫荧光染色，但也可以与其他方法一起使用，例如用于研究黄莺染色后的整个区域，或用于离体对抗实验。