Name: 肌网钙储备与细胞内舒张钙在心室肌细胞中的分离评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习使用Langendorff灌流系统和钙成像技术评估心室肌细胞的肌浆网钙储备与舒张期钙清除功能。该方法为研究糖尿病和心力衰竭等病理条件下的钙处理机制提供了便捷可靠的工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了中国国家自然科学基金（编号 81100159，赖东武；81401147，张菊红）、浙江省医药卫生科技计划项目（编号 201646246，赖东武）和杭州市卫生科技计划项目（编号 2013A28，林玎）的资助。

所有动物实验均按照中国中医科学院实验研究中心和浙江大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>按照表1中所述配制所有溶液。</li>
</ol>
2. 左心室（LV）心肌细胞的分离
注意：左心室心肌细胞通过Langendroff灌注系统进行酶解分离，方法如前所述7,8,9,10,11。
<ol>
	<li>安装朗根多夫灌流系统。用正常台氏液（NT）填充灌流系统，将温度设定为 36.5 °C，并排除管路中的所有气泡。</li>
	<li>称重并经腹腔注射（ip）水合氯醛（400 mg/kg）对Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。注射5分钟后，通过评估尾部或脚趾夹捏反应确认麻醉状态。</li>
	<li>在剑突下方用手术剪刀打开腹腔，提起剑突，用剪刀剪开胸腔。去除心包膜，用弯头镊子轻轻提起心脏，辨认主动脉弓，从主动脉根部用剪刀剪下心脏。</li>
	<li>将心脏转移至60 mm培养皿中，并用NT溶液洗涤。用两把显微解剖镊夹住主动脉，将其套在Langendorff灌注插管上，然后使用外科缝合线将主动脉牢固结扎在插管上。 
	注意：熟练的操作人员可在15秒内完成此过程。</li>
	<li>用30 mL NT溶液灌注心脏，以恢复冠状动脉的循环。然后，将灌注液更换为30 mL Ca2+无钙台氏液（10 mM 牛磺酸，1 mg/mL BSA）以停止心跳。随后，将灌注液更换为胶原酶A分离液（0.6 mg/mL）进行酶消化。 
	注意：使用糖尿病大鼠进行实验时，采用胶原酶A；不使用糖尿病大鼠进行实验时，采用胶原酶II。</li>
	<li>消化 20–25 分钟后，迅速将灌流液更换为 Ca2+无钙台氏液以终止进一步消化。随后用镊子夹住心脏，将其从套管上剪下，并置于含有KB溶液的35 mm培养皿中（见 表1).</li>
	<li>用剪刀和镊子解剖左心室壁。剪除心房、右心室及房室交界区域。剩余组织即为左心室，将其转移至含KB溶液的新35 mm培养皿中。将左心室组织剪成小块。</li>
	<li>用带滤膜的塑料移液管轻轻吹打组织块，并重悬于10 mL KB溶液中。</li>
	<li>使用150 µm孔径的不锈钢滤网过滤细胞，并转移至15 mL离心管中。以150 × g离心30 s，弃去上清液。将心肌细胞重悬于10 mL KB溶液中，静置6 min后弃去上清液，再将沉淀重悬于10 mL KB溶液中。 
	注意：所有步骤均在通入100% O₂的溶液中于36 °C下进行2.</li>
</ol>
3. 钙离子再引入
<ol>
	<li>静置20分钟后，弃去KB溶液上清，用钙重灌注溶液A（0.3 mM Ca）重新悬浮心肌细胞2+，4.5 mL Ca2+无Tyrode溶液，1.5 mL NT溶液）孵育10分钟。</li>
	<li>用钙重灌注溶液 B（0.3 mM Ca2+，3 mL Ca2+无Tyrode溶液，3 mL NT溶液。</li>
	<li>用 NT 溶液（1.2 mM Ca）重复上述步骤2+) 以纯化可获取的心肌细胞。将分离出的左心室心肌细胞保存于该溶液中，并在4-6小时内进行实验。</li>
</ol>
4. 灌注系统的设置
<ol>
	<li>将灌流管路与NT溶液连接，用于灌流细胞腔室（图1A）。</li>
	<li>为对目标心肌细胞进行针尖灌流，将固定在显微操作器上的多通道灌流笔尖（例如，灌流笔，下文简称“笔”）连接至由阀门控制的灌流系统。将NT溶液和10 mM咖啡因溶液分别加入灌流笔的各通道中（图1A）。</li>
	<li>排出管路中的所有气泡，以避免气阻。</li>
	<li>计数10秒内灌流笔微管尖端的滴液滴数，并手动调节流速控制器，使流速保持在约每10秒3滴。</li>
</ol>
5. 细胞内 Ca2+ 瞬变和肌节缩短的测量 7,8,9
<ol>
	<li>取10 µL细胞悬液滴加到载玻片上，在显微镜下使用细胞计数器计数细胞数量，并计算密度。将心肌细胞稀释至约50,000 个细胞/mL的浓度。</li>
	<li>将Fura-2乙酰甲酯（AM）储备液（一种钙离子敏感性荧光染料）加入1 mL心肌细胞悬液中，使终浓度达到2 µM。室温避光孵育20分钟。</li>
	<li>以150 g离心30秒，用NT溶液重悬心肌细胞两次。</li>
	<li>关闭光源并保持细胞处于避光状态。将心肌细胞放入灌流腔室中静置15分钟，随后以NT溶液开始腔室灌流（流速1.5 mL/min）。使用刺激器以1 Hz场刺激（波宽4.0 ms，脉冲幅度8.0 V）刺激心肌细胞5分钟。</li>
	<li>在10倍物镜下选择形态良好（杆状、边缘清晰、横纹明显）且受刺激后收缩稳定（无自发性收缩）的心肌细胞。随后切换至40倍物镜，并调整CCD相机方向，使心肌细胞呈水平位置。</li>
	<li>调节细胞定位适配器，使单个心肌细胞位于视野中央。确保背景清晰无干扰。</li>
	<li>使用氙灯发出的光，通过340 nm或380 nm激发滤光片照射心肌细胞，并通过40倍物镜成像。在510 nm处检测荧光信号。同时，观察心肌细胞肌节长度的变化，并使用soft-edge模块同步记录。</li>
	<li>使用双激发荧光光电倍增系统记录荧光信号。运行钙成像系统的记录程序，点击&#34;File/new File&#34;创建新的记录文件，然后点击&#34;start&#34;按钮，同步记录荧光信号和肌节长度。</li>
</ol>
6. SR 钙2+ 储备及舒张期钙2+ 清除功能的评估7,8,9
<ol>
	<li>相互连接 &#34;辅助输出&#34; 刺激器上的端口 &#34;模拟输入&#34; 阀门控制系统上的端口例如，阀门控制器，参见 材料表通过BNC电缆（用于同步TTL信号）。</li>
	<li>预设程序以自动切换灌注阀，方法如前所述8,9操作的详细步骤如下所列。
	<ol>
		<li>根据阀门控制软件中的参数进行预设 表2，然后单击 &#34;下载&#34; 单击按钮以下载程序中加载的序列。单击 &#34;触发&#34; 按钮以启用触发功能。 
		注意：阀门控制系统在接收到TTL信号后可执行该序列。</li>
		<li>将刺激器预设为序列模式，并根据要求设置参数 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将刺激器设置为 &#34;S1 步骤&#34; 以1 Hz的频率起搏左心室心肌细胞。以1.5 mL/min的速度开始针式灌注NT溶液。 
	注意：由于针头灌注流速快于腔室灌注，针头灌注的光线折射与腔室灌注的光线折射不同。这种折射差异指示了有效针头灌注的范围，该范围围绕目标心肌细胞。</li>
	<li>在低倍镜视野下选择一个目标心肌细胞（按从下游到上游的顺序），确保该细胞可被笔状微电极的微尖触及。将显微镜放大倍数调整至400倍。旋转CCD相机方向，使心肌细胞保持水平位置。调节细胞框适配器下的矩形光阑，使其形成一个恰好容纳心肌细胞的合适窗口。确保背景尽可能干净，窗口内不得包含其他心肌细胞或死细胞碎片。</li>
	<li>调整固定在显微操作仪上的铅笔位置，在400倍显微镜放大倍数下，将微尖小心地置于目标心肌细胞视野半径距离处。</li>
	<li>调整针头液流范围，使其主要覆盖目标心肌细胞，并确保心肌细胞不会被针头液流冲走。</li>
	<li>在基础起搏60秒后，将刺激器光标滚动至 &#34;D2 步骤&#34;. 
	注意：其余实验步骤将由刺激器和阀门控制系统自动执行。根据上述设置，该方案可自动运行，如同 图2A，以NT溶液进行1 Hz基础起搏60秒。随后停止起搏并延迟2秒，迅速切换为10 mM咖啡因灌注15秒（以功能性释放Ca2+ 储存于肌浆网（SR）中），然后切换回NT溶液。</li>
	<li>记录结束后，检测单个心肌细胞的背景荧光。点击 &#34;暂停&#34; 暂停文件录制按钮，将显微镜视野移至附近空白区域。单击 &#34;记录&#34; 单击按钮以恢复录制数秒，并记录340 nm和380 nm的强度值用于背景校正。</li>
	<li>打开 &#34;操作/恒定&#34; 对话框，并将数值填入其中 &#34;背景&#34; 分别进行校正；该软件可通过减去背景值来校正Fura 2比率值。</li>
</ol>
7. 数据分析 9
<ol>
	<li>在基础起搏阶段进行钙瞬变和肌节缩短的测量时，需对多个搏动波形进行平均处理，然后利用软件自动分析动态参数，如钙瞬变幅度及钙瞬变衰减时间常数（Tau-1 Hz）。
	 
	注意：若软件对衰减段拟合不佳，可导出下降相曲线进行人工单指数拟合。</li>
	<li>对于咖啡因诱导的钙瞬变波形，仅选择具有陡峭上升支的脉冲用于钙清除功能分析；排除信号干扰、脉冲异常或中途漂出视野的细胞。</li>
	<li>测量咖啡因诱导钙脉冲的振幅（Ca-caffeine，作为肌浆网Ca2+ 储备的指标）。</li>
	<li>通过人工单指数曲线拟合（持续时间为10秒）从软件中获取咖啡因诱导钙脉冲的衰减时间常数（Tau-caffeine）（图2C）。</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肌浆网（SR）释放的钙流是心脏收缩期钙离子（Ca2+）的主要来源。在一定程度上，肌浆网内Ca2+含量的幅度以及从肌浆网中释放的Ca2+比例反映了可用于心肌收缩的肌浆网Ca2+储备量。另一方面，肌浆网的Ca2+储备依赖于肌浆网对Ca2+的再摄取能力、肌浆网的Ca2+泄漏以及舒张期期间两者在肌浆网膜上的动态平衡12,13,14。在本实验中，快速施加10 mM咖啡因旨在通过开放兰尼碱受体（RyR）通道，诱导肌浆网内Ca2+的完全释放并阻止其再摄取。因此，咖啡因诱导的Ca2+瞬变幅度可作为肌浆网Ca2+储备量的一个指标。此外，通过1 Hz和3 Hz的基础起搏刺激，我们还可进一步研究肌浆网Ca2+负荷的频率依赖性特征及其潜在...

细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）再循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用1. 如我们所知，钙诱导的Ca2+ 释放启动兴奋-收缩耦联，将电信号转化为收缩。膜去极化激活肌膜上的L型Ca2+ 通道，可诱导 Ca2+ 通过兰尼碱受体2（RyR2）从肌浆网释放到胞质中的钙离子。 transient升高的胞质Ca2+ 启动肌原纤维收缩。在舒张期，胞质中的 Ca2+ 通过肌质网Ca2+-ATP酶2（SERCA2）并通过Na+-钙2+ 交换体（NCX）2该过程导致心肌细胞的收缩-舒张循环。
心肌细胞的肌浆网（SR）是一种包绕收缩装置的细胞内膜网络结构。它在心肌收缩时作为Ca2+的储存库，并在舒张过程中重新摄取细胞内Ca2+。可用于每次搏动的SR Ca2+储备量决定了心肌的收缩力。同时，细胞内Ca2+的清除对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理状态下，例如糖尿病和心力衰竭，心肌细胞中Ca2+清除能力受损以及SR Ca2+储存减少，可能参与了心脏功能障碍的发生过程2,3,4。
在心肌细胞中测量肌浆网（SR）Ca2+ 释放及舒张期 Ca2+ 清除的常用方法主要有两种：基于膜片钳技术的钠钙交换电流（NCX 电流）完整性分析5,6，以及基于 Ca2+ 荧光成像的咖啡因诱导 Ca2+ 脉冲法7,8,9。前一种方法依赖于肌浆网释放的 Ca2+ 主要通过 NCX 从细胞内泵出这一原理。然而，该方法受限于对高端设备和熟练操作技术的要求。在本研究中，我们描述了一种简便的方法，通过基于 Ca2+ 荧光成像系统检测咖啡因诱导的 Ca2+ 脉冲，来评估心肌细胞中肌浆网的 Ca2+ 储备量及 Ca2+ 清除能力。简而言之，细胞内 Ca2+ 荧光信号由 Fura-2 指示。通过将刺激系统与灌流系统联动，我们建立了一个可自动切换灌流和起搏程序的系统。采用 10 mM 咖啡因快速诱导肌浆网内总 Ca2+ 的释放。钙瞬变和咖啡因诱导钙脉冲的单指数衰减时间常数（Tau）通过单指数曲线拟合获得，分别反映 SERCA 和 NCX 在舒张期 Ca2+ 清除中的作用。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>咖啡因</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff系统</td><td>北京赛特微科技有限公司</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Marchauser</td><td>MM33 links</td><td></td></tr><tr><td>灌流室</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>阀门控制重力灌流系统</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>阀门控制软件</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>精密流量调节器</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>多通道管路灌流笔</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>可更换微米级尖端</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>荧光测量与细胞尺寸分析系统</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>记录软件</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>刺激器</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>SD大鼠</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。心肌肌浆网（SR）作为钙离子的主要储存库，在调节钙瞬变幅度和再摄取过程中发挥核心功能。2+ 收缩过程中钙离子的储存库，负责重吸收细胞内 Ca2+ 舒张期间。肌浆网 Ca2+ 可用于搏动的储备量决定了心脏收缩力，而细胞内Ca²⁺的清除2+ 对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理条件下，如糖尿病和心力衰竭，钙离子清除功能受损以及肌浆网Ca2+ 心肌细胞中的钙库可能参与心脏功能障碍的发生发展。本文介绍了一种评估肌浆网钙含量（SRCa）的实验方案。2+ 储备和舒张期钙2+ 去除。简言之，单个心肌细胞通过酶法分离，细胞内Ca2+ 由钙成像系统记录Fura-2指示的荧光。使用咖啡因诱发肌浆网总钙释放2+ 释放，我们通过联动刺激系统与灌流系统预设了一个自动灌流切换程序。随后，采用单指数曲线拟合方法分析钙瞬变及咖啡因诱导的钙脉冲的衰减时间常数。据此，可评估肌浆网（SR）Ca2+-ATP酶（SERCA）和Na+-钙2+ 通过评估钠钙交换体（NCX）在舒张期钙离子清除中的作用。

此处以链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠（DM）和年龄匹配的Sprague-Dawley（SD）大鼠为例。8周龄雄性SD大鼠（200 ± 20 g）分别通过腹腔注射单次给予STZ（70 mg/kg，ip）建立DM组，对照组则注射柠檬酸盐缓冲液。STZ给药一周后，血糖水平 > 16.7 mmol/L 的大鼠被认定为糖尿病模型。8周后，通过酶法分离左心室（LV）心肌细胞。钙离子恢复后，约有70–80%的心肌细胞保持存活状态。仅选取呈杆状、横纹清晰且收缩稳定的细胞用于记录（图1B）。如图1A所示，我们为心肌细胞设置了浴槽灌流和针式灌流系统。灌流阀门和起搏系统由预设程序自动切换，如图2A所述。细胞内钙荧光信号由钙成像系统记录。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca2+储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩功能和舒张功能的调控中起着关键作用。心肌肌浆网……

本实验的总体目标是评估分离心肌细胞中肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除功能。该方法有助于解答在糖尿病和心力衰竭等某些病理生理条件下细胞内钙处理机制的关键问题。该技术的主要优势在于操作简便，且对技术和设备的依赖性较低。开始此操作时，先设置好朗根多夫（Langendorff）灌流系统。用 NT 溶液填充灌流系统，将温度设定为 36.5 摄氏度，并排除管路中的所有气泡。接着，在剑突下方打开腹腔，提起剑突，用剪刀剪开胸腔。然后去除心包膜，用弯头镊子轻轻提起心脏，辨认主动脉弓，并在主动脉根部切断以取下心脏。随后将心脏转移至60毫米培养皿中，用NT溶液清洗。用两把显微解剖镊夹住主动脉，将其固定在Langendorff灌流套管上。然后使用外科缝线将主动脉牢固地结扎在插管上。随后用 30 毫升 NT 溶液灌注心脏，以恢复冠状动脉的循环。接着将灌注液更换为 30 毫升无钙台氏液，以停止心跳。随后，将灌流液更换为胶原酶A分离溶液进行酶消化。消化20至25分钟后，迅速更换灌流液为无钙Tyrode溶液以终止进一步消化。然后用镊子夹住心脏，从套管上剪下，并将心脏置于含有KB溶液的35毫米培养皿中。随后，找到左心室区域，剪去心房、右心室及房室交界区，将左心室转移至含有KB溶液的新35毫米培养皿中，并将组织剪成小块。使用带滤膜的塑料移液器轻轻吹打组织块。接着，用孔径为150微米的不锈钢滤网过滤细胞，并将其转移至15毫升离心管中。随后，以150 ×g离心30秒，弃去上清液。将心肌细胞重悬于10毫升KB溶液中，静置6分钟。随后弃去上清液，将沉淀物重悬于10毫升KB溶液中，孵育20分钟。在KB溶液中静置20分钟后，弃去上清液，并用钙重引入溶液A重悬心肌细胞。随后使用钙引入溶液B重复上述步骤。最后使用NT溶液重复上述步骤，以纯化可用心肌细胞。将分离的心室肌细胞储存在该溶液中，并在4至6小时内进行研究。然后向铅笔的每列中加入NT溶液和10毫摩尔咖啡因溶液。排出管路中的所有气泡，以避免气阻。现在，将灌流管连接至NT溶液，用于灌流腔室。对于目标心肌细胞的针尖灌流，将多通道灌流管尖端连接至阀门控制的灌流系统。随后，计数铅笔状微管尖端在10秒内的滴数，并手动调节流速控制器，使流速保持在每10秒约3滴的水平。在此步骤中，将fura-2-乙酰氧基甲酯储备液加入1毫升心肌细胞悬液中，使终浓度达到2 µM。室温下避光孵育20分钟。随后，弃去上清液，并用NT溶液重新悬浮心肌细胞两次。接下来，关闭光源并将细胞置于黑暗环境中。将心肌细胞放入灌流室中静置15分钟，然后用NT溶液进行灌流。使用刺激器以1赫兹的场刺激对心肌细胞起搏刺激5分钟。现在，在10X物镜下选择一个形态良好且受刺激后收缩稳定的肌细胞。点击“文件”菜单中的“新建文件”以创建一个新的记录文件。接着，将显微镜放大倍数切换至40X，并旋转CCD相机的方向，使肌细胞保持在水平位置。然后通过调节细胞定位适配器来框定单个心肌细胞，并确保背景清晰。随后，使用氙灯发出的光照射心肌细胞，激发波长选择340或380纳米的激发滤光片，并通过40倍物镜对心肌细胞进行成像。在510纳米处检测荧光信号。单击“开始”按钮，使用双激发荧光光电倍增系统同步记录荧光和肌节长度。注意心肌细胞肌节长度的变化，并同时使用软边缘模块进行记录。在此步骤中，通过 BNC 电缆将刺激器的 aux out 端口与阀控系统的模拟输入端口连接起来。接下来，在阀门控制软件中预设参数，单击下载按钮以下载程序中加载的序列，并单击触发按钮以启用触发功能。然后将刺激器预设为序列模式并设置参数。随后，将刺激器设为S1步，以1赫兹频率起搏左心室心肌细胞。以 1.5 毫升/分钟的速度开始用 NT 溶液进行针头灌流。在低倍显微镜视野下选择一个目标心肌细胞，并确保铅笔状微尖能够到达该细胞。随后，将显微镜放大倍数调整至 400 倍。旋转CCD相机方向，使心肌细胞保持在水平位置。然后调节细胞定位适配器下方的矩形光圈，使其形成一个合适窗口，恰好充满心肌细胞。接着，调节固定在显微操作器上的笔的位置，小心地将微尖置于视野半径距离目标心肌细胞的位置。然后调整针头液流范围，使其主要覆盖目标心肌细胞，并确保心肌细胞不会被针头液流冲走。在进行60秒基础起搏后，将刺激器游标移至D2步骤。其余实验程序将由刺激器和阀门控制器自动执行。单击“暂停”按钮以暂停文件录制，并将显微镜视野移动到附近的空白区域。然后单击“录制”按钮，继续录制数秒，记录340和380纳米波长的背景强度值用于背景校正。随后，打开“运算常数”对话框，将数值填入背景校正表格中。该软件可通过减去背景值来校正fura-2比率。此处展示的是自动切换灌流阀和起搏系统的操作流程示意图。该图显示了糖尿病组和Sprague Dawley组在1赫兹刺激下收缩时肌浆网钙储备及钙释放分数的统计值。糖尿病组的肌浆网钙储备和肌浆网钙释放分数均显著低于Sprague Dawley组。此处，软件面板显示了咖啡因诱导的钙瞬变衰减时间常数的手动单指数曲线拟合。这些柱状图比较了糖尿病组与Sprague Dawley组之间的咖啡因Tau值以及1Hz/Tau咖啡因比值。糖尿病组的Tau-咖啡因值以及Tau-1Hz/Tau-咖啡因比值显著高于Sprague Dawley组。该方法为研究心脏功能障碍中的细胞内钙处理机制提供了一种可行且便捷的工具。在实施该操作时，需注意若干关键点，例如心肌细胞在培养皿上的稳定贴附、通道切换器的包裹、针式灌流流速的控制，以及针尖与目标心肌细胞之间保持适当距离。

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

肌网钙储备与细胞内舒张钙在心室肌细胞中的分离评价

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

本文介绍了在经Langendorff灌注的兔心脏中进行跨膜电位（Vm）和肌浆网内游离钙离子（SR Ca2+）双光学标测所需的详细方案及设备。该方法可实现对完整心脏中Vm和SR...

兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca2+及跨膜电位的光学标测

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

本文介绍了一种用于评估大鼠心脏分离心肌细胞在收缩过程中肌丝对Ca2+敏感性变化的实验方案。该检测方法结合心脏电生理学、收缩期/舒张期胞质Ca2+水平以及收缩/舒张功能，对于揭示健康与病变心脏中心肌兴奋-收缩耦联机制具有重要意义。...

评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca2+的敏感性

本文介绍了一种经过优化的基于兰根多夫（Langendorff）系统的分离方法，用于从与代谢综合征相关且射血分数保留的心力衰竭大鼠模型中分离单个心房心肌细胞。通过手动调节心脏腔室的管腔内压力，可获得功能完整的肌细胞，适用于兴奋-收缩耦联研究。...

从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

本方案旨在逐步描述利用去膜心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。该方法可利用从小块冷冻活检样本中获取的材料，对肌丝功能进行测量和急性调节，这些样本可从不同心脏部位获取，适用于从小鼠到人类的多种物种。...

利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本文介绍了一组通过检测分离大鼠心肌细胞的肌节长度并结合钙离子（Ca2+）瞬变测量来评估收缩功能的实验方案。同时包含了该方法在心力衰竭动物模型研究中的应用。...

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca2+瞬变的分析

本方案描述了一种同时测量细胞质游离钙离子浓度［Ca²⁺］的方法2+]i 以及实时测量收缩性淋巴管的管径，随后计算绝对钙浓度2+ 浓度以及收缩力/节律性参数。该方案可用于研究 Ca2+...

离体加压淋巴管中绝对胞质游离 Ca2+ 浓度与相应收缩力的实时评估

学习使用Langendorff灌流系统和钙成像技术评估心室肌细胞的肌浆网钙储备与舒张期钙清除功能。该方法为研究糖尿病和心力衰竭等病理条件下的钙处理机制提供了便捷可靠的工具。

离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

探索更多视频