Name: 阻力动脉的细胞培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学习阻力动脉细胞培养模型，通过共培养内皮细胞和平滑肌细胞建立肌内皮连接。该技术可分离特定连接组分，用于研究心血管信号通路和蛋白质定位机制。

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本工作得到了美国国家心肺血液研究所基金R01088554、T32HL007284以及美国心脏协会博士前奖学金14PRE20420024的支持。我们特别感谢圣犹大细胞成像共享研究中心，包括Randall Wakefield和Linda Horner提供的电子显微镜图像，Adam Straub在代表性免疫荧光图像方面的协助，&#160;以及Pooneh Bagher对本手稿方案提出的宝贵意见。

1. VCCC 细胞铺板
<ol>
	<li>在无菌条件下于 37 °C 培养大量 225 cm2 的内皮细胞（EC）和血管平滑肌细胞（SMC）培养瓶，直至细胞融合度达到 70–90%。确保使用的 EC 数量多于 SMC；若使用原代人源 EC 和 SMC，通常使用 3 瓶 EC 对应 1 瓶 SMC。
	<ol>
		<li>使用较低传代次数的原代细胞，且传代次数不得超过第 10 代。根据共培养的细胞类型选择培养基。对于原代人冠状动脉内皮细胞（EC），使用 EBM-2 内皮基础培养基并添加 EGM2 MV 生长因子；对于原代人冠状动脉平滑肌细胞（SMC），使用 SmBM 平滑肌基础培养基并添加 SmGM-2 生长因子。在用于培养细胞前，需将生长因子加入培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建 VCCC 的第 1 天：用消毒剂（例如，Cavicide）喷洒大号（150 mm）培养皿及其盖子，并用纸巾或无绒布擦拭干净。随后用 70% 乙醇（EtOH）喷洒培养皿，并将其放入生物安全柜中晾干。</li>
	<li>在无菌条件下打开滤膜插件板（见材料表），将纤连蛋白溶液涂布于插件的 SMC 侧（滤膜的底面）。将插件保留在配套的 6 孔板中，通过侧边缝隙加入纤连蛋白溶液至板底部，确保滤膜下半部分被完全覆盖（不超过 1 mL）。</li>
	<li>在细胞培养柜中室温孵育 30 分钟后，取出插件，吸除多余液体，倒置后放入洁净培养皿的底部。暂置一旁。在吸取多余液体时，务必避免扰动滤膜插件的膜面；可通过轻轻倾斜插件板，并从插件边缘吸液来避免损伤。</li>
	<li>用 3 mL 预热的 2× 胰蛋白酶-EDTA 溶液对一个 225 cm2 的 SMC 培养瓶进行胰酶消化，待细胞脱离培养瓶表面后，加入 9 mL SMC 培养基以中和胰酶（培养基与胰酶体积比为 3:1）。将细胞悬液转移至锥形管中，充分混匀，取 10 µL 滴加至血细胞计数板以测定细胞数量。
	<ol>
		<li>计数 5 × 5 个方格（即 18 个大方格）内的细胞数，乘以 10,000 得到每毫升细胞悬液中的细胞数（180,000）。再乘以 12 mL（细胞悬液总体积），得到 SMC 总数为 216 万。确保有足够的 SMC 用于接种目标孔数。 
		注：例如，每孔需接种 75,000 个 SMC，则 18 孔共需 135 万个 SMC。将所需细胞总数 135 万除以每毫升含 18 万个细胞，得出需 7.5 mL 细胞悬液。再计算最终所需体积（18 孔 × 750 µL = 13.5 mL）。因此，取 7.5 mL 细胞悬液，用预热的 SMC 培养基补足至 13.5 mL，充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有约 75,000 个 SMC 的 750 µL 细胞悬液小心接种至每个滤膜插件的底面，注意避免液体溢出。盖上盖子后，小心将含插件的培养皿转移至 37 °C 培养箱中过夜培养。 
	注：其他类型细胞的最佳接种密度需通过实验确定。</li>
	<li>第 2 天，向洁净的 6 孔板中每孔加入 2 mL 新鲜预热的 SMC 培养基。从培养箱中取出培养板，逐个取出插件，用吸液法去除原有培养基，然后将插件放入含 SMC 培养基的 6 孔板中。</li>
	<li>在滤膜的另一侧（EC 侧）加入 1 mL 0.5% 牛血清明胶溶液，于 37 °C 孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>用 3 mL 预热的 2× 胰蛋白酶-EDTA 溶液（用无菌杜尔贝科磷酸盐缓冲液稀释 10 倍）对 225 cm2 的 EC 培养瓶进行胰酶消化，轻轻敲击培养瓶以帮助细胞脱离。 
	注：必要时可将培养瓶放回 37 °C 培养箱中孵育 1–3 分钟。
	<ol>
		<li>待细胞完全脱离后，加入 9 mL EC 培养基中和胰酶（培养基与胰酶体积比为 3:1）。将细胞悬液转移至锥形管中，合并收集，充分混匀，取 10 µL 滴加至血细胞计数板以测定细胞数量。
		<ol>
			<li>计数 5 × 5 个方格（即 60 个大方格）内的细胞数，乘以 10,000 得到每毫升细胞悬液中的细胞数（600,000）。再乘以 12 mL（细胞悬液总体积），得到 EC 总数为 720 万。确保有足够的 EC 用于接种目标孔数。 
			注：每孔约需 360,000 个 EC。例如，18 孔共需 648 万个 EC。将所需细胞总数 648 万除以每毫升含 60 万个 EC，得出需 10.8 mL 细胞悬液。再计算最终所需体积（18 孔 × 1 mL = 18 mL）。因此，取 10.8 mL 细胞悬液，用预热的 EC 培养基补足至 18 mL，并轻轻重悬。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含 360,000 个 EC 的 1 mL 细胞悬液接种至每个插件滤膜的上表面。将细胞在 37 °C 静置培养 24 小时。第 4 天更换培养基，第 5 天收获细胞。</li>
</ol>
2. 从VCCC收集组分
<ol>
	<li>在 4 °C 环境中进行分离操作，并将所有仪器保持在冰上。</li>
	<li>注意正在分离的独立插入物数量，向已标记为 MEJ 的 50 mL 离心管中加入裂解缓冲液（用于分离的滤膜）。然后标记两个 10 mm 培养皿，一个用于内皮细胞（EC），另一个用于平滑肌细胞（SMC）。</li>
	<li>根据所需裂解液的浓度调整裂解缓冲液体积；对于 15 个插入物，建议 MEJ 管中加入 500 µL 裂解缓冲液，每个培养皿中加入 250 µL。</li>
	<li>每次处理一个 6 孔板的插入物。在细胞培养罩中吸除培养基，然后将板置于冰上转移至低温室。 
	注意：以下说明适用于单个插入物的分离。</li>
	<li>用移液器将 10 µL 的 1× PBS 加到插入物的 SMC 侧。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞刮至插入物的一端，并将刮下的细胞从刮刀转移至含有裂解缓冲液的 SMC 培养皿中。</li>
	<li>一旦细胞刮刀接触了培养皿中的裂解缓冲液，除非已在纸巾上彻底擦拭并干燥，否则不得再次接触插入物滤膜。重复刮取 SMC 滤膜至少一到两次，以完全去除残留的 SMC 细胞碎片。</li>
	<li>将插入物翻转，用移液器向插入物滤膜的上层/EC 侧加入 10 µL 的 1× PBS。使用细胞刮刀和 EC 培养皿重复步骤 2.6 和 2.7。</li>
	<li>用移液器收集滤膜 EC 侧残留的细胞和 PBS 悬液，并转移至含有裂解缓冲液的 EC 培养皿中。在刮取滤膜两侧细胞时务必彻底，以尽量减少 EC/SMC 污染进入 MEJ 组分。</li>
	<li>小心使用手术刀将滤膜从塑料插入物上切割下来。先切割掉约 70–80% 的塑料部分，再用镊子将滤膜完全从塑料结构上剥离。将滤膜放入标记为 MEJ 并含有裂解缓冲液的 50 mL 离心管中，确保其浸没在裂解缓冲液中并保持湿润。</li>
	<li>以每组 6 个为单位重复分离步骤，直至处理完所有插入物。</li>
	<li>确保不同处理组分别存放于不同的离心管和培养皿中。</li>
	<li>将 50 mL MEJ 离心管在最大强度下涡旋震荡 15 秒，或直至充分混匀。用镊子从 MEJ 离心管中取出滤膜，沿管壁拖动以尽可能多地保留蛋白质和液体在管内。此后丢弃滤膜。</li>
	<li>当所有滤膜均从 MEJ 离心管中移除后，在离心机中快速离心（最高速约 16,000 × g，10–15 秒），使所有液体和蛋白质沉至管底。将 MEJ 管、EC 和 SMC 培养皿中的内容物分别转移至独立的小型离心管中。</li>
	<li>可选步骤：将 MEJ/SMC/EC 管中的内容物置于冰上，设置为 4 档，进行三次、每次 10 秒的超声处理，或手动轻轻匀浆。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以最高速（约 16,000 × g）离心 15 分钟。吸取上清液，使用二辛可宁酸法（bicinchoninic assay method）测定裂解液的蛋白含量。</li>
</ol>
3. 收集 VCCC 用于 En Face 免疫荧光染色
<ol>
	<li>在VCCC培养的第5天，将插入物从培养箱中取出。在细胞培养罩内操作，吸出插入物滤膜下室的SMC培养基，并用1×PBS冲洗两次。对EC侧重复相同操作。</li>
	<li>保持插入物完整并置于孔板中，在4 °C房间内轻轻摇动条件下加入4%多聚甲醛（PFA）固定10–20分钟。用1×PBS洗涤滤膜两侧，每次5分钟，重复两次。 
	注意：PFA具有毒性，操作时须格外小心。</li>
	<li>在孔板中进行封闭、一抗和二抗孵育，确保滤膜两侧均浸没于抗体与封闭液中（9 mL PBS、25 µL Triton X100、50 mg牛血清白蛋白、500 µL正常血清）。</li>
	<li>将滤膜安装至载玻片时，使用装有刀柄的解剖刀将滤膜从塑料插入物中切下，并将其置于含封片剂的显微镜载玻片上。</li>
</ol>
4. 横向免疫荧光染色用VCCC的收获
<ol>
	<li>在VCCC培养的第5天，从培养箱中取出小室。在细胞培养罩内用移液器吸去小室滤膜两侧的培养基，并用1×PBS将滤膜两侧各冲洗两次。</li>
	<li>保持小室完整并置于6孔板中，加入4% PFA，在4 °C房间内的温和摇床上4 °C过夜孵育。 
	注意：PFA具有毒性，必须小心操作。</li>
</ol>
5. 横向免疫荧光染色用VCCC包埋
<ol>
	<li>将滤膜插入物用4%多聚甲醛固定约24小时后，转移至70%乙醇中保存至少24小时，可保存数周。</li>
	<li>在自动组织脱水机上对滤膜进行长时间（过夜）处理。程序如下：70%乙醇30分钟，85%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇30分钟，100%乙醇45分钟，100%乙醇45分钟，二甲苯30分钟，二甲苯30分钟，二甲苯45分钟，60 °C石蜡30分钟，60 °C石蜡30分钟，60 °C石蜡45分钟。</li>
	<li>处理完成后，将收获的滤膜转移至包埋站的液态石蜡中，保持滤膜处于包埋盒内。</li>
	<li>用镊子小心夹住滤膜边缘，将其从包埋盒中取出。使用剪刀将滤膜切成两半，形成两个半圆形部分。将每半个滤膜放置在包埋站的冷台部分，仅停留足够短的时间以填充包埋模具中的液态石蜡。</li>
	<li>填充液态石蜡后，将包埋模具在冷台上短暂接触一下，然后将滤膜的每一半（切面朝下）嵌入包埋模具中；这可确保在切片时从滤膜中心向边缘进行切割。</li>
	<li>包埋过程中，使用镊子固定滤膜位置，防止两半滤膜在石蜡冷却至足够支撑其自身之前相互倾倒。将包埋模具移至冷台直至完全凝固。 
	注意：使用冰盒上的冷却块有助于防止切片出现皱褶。</li>
</ol>
6. 横向免疫荧光染色用VCCC切片与染色
<ol>
	<li>进行石蜡包埋组织切片和载玻片贴附：切取5 µm厚的切片，将切片放入42 °C水浴中展平，用带正电荷的载玻片捞取切片。然后将载玻片置于42 °C烘箱中过夜干燥。</li>
	<li>开始复水步骤前，先将载玻片在60 °C下烘烤以熔化石蜡，并帮助VCCC切片牢固附着于载玻片上。短暂冷却后，依次通过两次二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、一次70%乙醇以及两次蒸馏水进行复水处理。</li>
	<li>避免使用微波或加热方式进行抗原修复，以免切片从载玻片上脱落。</li>
	<li>室温下进行标准封闭1小时，随后在4 °C下与一抗孵育过夜，接着进行洗涤步骤，并在室温下与二抗孵育1小时。最后用封片剂和盖玻片封片。</li>
</ol>

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<li>Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+protein+on+actin+bridges+between+endothelium+and+smooth+muscle+in+arterioles+demonstrates+heterogeneous+connexin+expression+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).</li>
<li>Biwer, L. A., Isakson, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mediated+signalling+in+cellular+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains.</a> Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

VCCC 在重现 MEJ 方面具有多项优势 体外，但在确定VCCC是否可用于特定应用时，仍有一些需要讨论的方面。例如，若该模型需使用不同类型的细胞，则需要进行优化。我们曾使用原代人源细胞，但也有可能从牛主动脉中分离细胞24，或野生型或基因敲除小鼠，并将其用于VCCC1,5,14.
若使用VCCC进行MEJ分离，最关键的技术是彻底刮取滤膜，以确保MEJ组分的纯度不受过量内皮细胞或平滑肌细胞的影响。我们通过Western blotting证实，α-血红蛋白是MEJ组分最理想的标志物 &#34;纯的&#34; MEJ 分离13，因为它在MEJ组分中的表达应明显强于内皮细胞组分。另一个是PAI-1，它可调控MEJ的形成（图2)<sup...

在小直径阻力动脉中，一层较薄的内弹性膜（IEL）将内皮细胞（EC）与平滑肌细胞（SMC）分隔开。这些细胞可通过该弹性基质上的小孔延伸突起，并通过缝隙连接通道形成直接的胞质连接1,2。这种独特的结构被称为肌内皮连接（MEJ）。MEJ是一种微小的细胞突起（大小约为0.5 µm × 0.5 µm，具体尺寸因血管床而异），主要由内皮细胞构成，但也可能起源于平滑肌细胞3,4。许多研究者已证实，在MEJ处选择性发生的信号转导网络极为复杂，使其成为内皮与平滑肌之间双向信号传递的重要部位5,6,7,8,9,10。
然而，在完整的动脉中对MEJ处的信号通路进行机制性解析十分困难。由于MEJ是一种细胞突起结构，目前尚无法从血管壁中分离出完整的活体（in vivo）MEJ。因此，研究人员开发了VCCC模型1。重要的是，VCCC能够模拟生理状态下的内皮细胞形态11，并再现细胞顶端与MEJ区域之间信号分子的极性分布12。正是利用这一独特的模型，研究人员首次发现α珠蛋白存在于内皮细胞中，并特异性地极化分布于MEJ区域。这与传统培养的内皮细胞形成鲜明对比，后者并不表达α珠蛋白13。对于致力于微血管内皮研究的研究人员而言，若目标是解析小直径阻力动脉中发生的信号通路，采用在VCCC系统中培养的内皮细胞可能更为合适。
使用带有小直径孔隙（0.4 µm）的坚固塑料插入物（含滤膜）进行两种不同细胞类型的共培养，可防止细胞在各层之间迁移。该方法使细胞间保持10 µm的距离，这一距离显著长于 体内，但仍复制了许多 体内 MEJs 的特征，包括蛋白质定位和第二信使信号传导1,14此外，通过向特定细胞区室添加激动剂或拮抗剂，VCCC 可实现对细胞类型特异性信号通路的靶向调控。例如，向胞外室（EC）加载 BAPTA-AM 以螯合钙离子，同时用去氧肾上腺素（phenylephrine）刺激平滑肌细胞（SMC）14与其他共培养模型的描述相比15,16,17,18,19,20,21，本方法提供了分离 mRNA 和蛋白质不同组分的说明，包括滤膜孔内独特的 MEJ 组分。将该技术加入 VCCC 后，可实现对 mRNA 定位或转录变化的特异性研究22蛋白质磷酸化12,23以及蛋白质活性12本文将描述在滤膜上方接种内皮细胞（EC）、下方接种平滑肌细胞（SMC）的方法，尽管也可将这两种细胞类型以其他构型进行共培养。11,18,24.

<table><tbody><tr><td>24 mm 直径，0.4 &amp;micro;m Transwell 聚酯膜滤器插件</td><td>Corning</td><td>3450</td><td>此为一整块6孔板用插件</td></tr><tr><td>225 cm 培养瓶</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板（不含滤器插件）</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>原代人冠状动脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2585</td><td></td></tr><tr><td>原代人冠状动脉平滑肌细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2583</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 EC 基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EC 生长因子（EGM2 MV SingleQuots）</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>使用前加入基础培养基中</td></tr><tr><td>SmBM SMC 基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3181</td><td></td></tr><tr><td>SMC 生长因子（SmGM-2 SingleQuot）</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>使用前加入基础培养基中</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA 10X 溶液</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>用无菌 dPBS 稀释至 2X</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>用于 SMC 接种的大培养皿（150 mm）</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>牛明胶</td><td>Sigma</td><td>G-9382</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>配制成 5&amp;micro;g/mL 的纤维连接蛋白溶液，-20°C 保存</td></tr><tr><td>10x Hanks 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>用无菌水稀释至 1x</td></tr><tr><td>10x Dulbecco 磷酸盐缓冲液（dPBS）</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>用无菌水稀释至 1x</td></tr><tr><td>一次性弯头手术刀（30 mm 刃口）带手柄</td><td>Amazon</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher</td><td>17-467-201</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮铲</td><td>BD Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>35-1008</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNA 裂解试剂</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>用 dPBS 配制成 4% 溶液</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Cavicide 消毒剂</td><td>Fisher</td><td>131000</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 蛋白裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisher</td><td>Model 50</td><td></td></tr><tr><td>用于收集 EC/SMC 及免疫细胞化学的 1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>无需无菌</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;包埋/切片/染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>自动组织处理仪</td><td>Excelsior</td><td>ES</td><td></td></tr><tr><td>包埋台 + 冷却板</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek Accu-Edge 切片机刀片</td><td>VWR</td><td>25608-961 或 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 封片剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;**若溶液用于活细胞，请在无菌条件下操作所有步骤&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>无菌 dPBS</td><td></td><td></td><td>将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 DPBS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X DPBS），混匀后经 0.2&amp;micro;m 滤膜过滤除菌。&lt;br/&gt; 最终浓度：1X</td></tr><tr><td>无菌 HBSS</td><td></td><td></td><td>将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 HBSS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X HBSS），混匀后经 0.2&amp;micro;m 滤膜过滤除菌。&lt;br/&gt; 最终浓度：1X</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白储备液</td><td></td><td></td><td>用 50 mL 无菌水溶解纤维连接蛋白，分装成 1 mL 每份的储备液，冻存备用。&lt;br/&gt; 最终浓度：100&amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>用于包被 VCCC 平滑肌侧的纤维连接蛋白</td><td></td><td></td><td>解冻一份储备液，将 1 mL 纤维连接蛋白（100&amp;micro;g/mL）加入 19 mL 1X HBSS 中，使终浓度为 5&amp;micro;g/mL。&lt;br/&gt; 最终浓度：5&amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>2x 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td></td><td></td><td>将 10X 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 用 1X dPBS 稀释至 2X（40 mL DPBS : 10 mL 10X 胰蛋白酶）。&lt;br/&gt; 最终浓度：2X</td></tr><tr><td>封闭/抗体溶液</td><td></td><td></td><td>（9 mL 1X PBS，25 mL Triton X-100，50 mg 牛血清白蛋白，500 mL 正常血清）</td></tr><tr><td>用于包被 VCCC 内皮细胞侧的牛明胶</td><td></td><td></td><td>将 0.5 g 牛明胶溶于 100 mL 蒸馏水中。首次使用前高压灭菌，室温保存。保持无菌条件。&lt;br/&gt; 最终浓度：0.50%</td></tr><tr><td>用于细胞收集的 1x PBS</td><td></td><td></td><td>无需无菌</td></tr></tbody></table>

一种阻力动脉的细胞培养模型

A Cell Culture Model of Resistance Arteries 

肌内皮连接（myoendothelial junction, MEJ）是小直径阻力动脉中一种独特的信号微区，具有特定蛋白质和信号通路的定位，可调控血管张力和血压。由于其为内皮细胞或平滑肌细胞的突起结构，且体积微小（平均面积约1 µm²），2），MEJ 难以独立研究。然而，我们已开发出一种称为血管细胞共培养（VCCC）的细胞培养模型，可用于 体外 MEJ形成、内皮细胞极化以及阻力动脉血管壁中信号蛋白和过程的解析。VCCC具有多种应用，可针对不同细胞类型进行调整。该模型由两种细胞组成，分别生长在具有0.4 µm孔径的滤膜的两侧 体外 MEJs 可以形成。本文描述了通过细胞铺板以及分离内皮细胞、MEJ 和平滑肌组分来构建 VCCC 的方法，这些组分随后可用于蛋白质提取或活性检测。带有完整细胞层的滤膜可进行固定、包埋和切片，用于免疫荧光分析。重要的是，该模型中的许多发现已在完整的阻力动脉中得到验证，凸显了其生理相关性。

VCCC 所用的滤膜插件具有较小的 0.4 µm 孔 图1A，一个 正面 VCCC滤膜插件的视图，显示了MEJ可形成的孔隙 体外示意图显示，在内皮细胞接种于滤膜对侧的前一天，平滑肌细胞已接种于滤膜的下侧。图1B）。细胞铺板后，可在三天后分离EC、MEJ和SMC组分。示例如下所示 图2A，其中纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）在MEJ组分中的表达显著高于内皮细胞其他部分，这一现象也在 体内 MEJs25这些数据表明，血管腔内皮细胞培养装置（VCCC）在模拟完整的小动脉血管壁方面具有实用价值。
接下来展示了免疫荧光和电子显微镜下的血管周心室脉络丛复合体（VCCC）。VCCC保持...

本文描述了一种阻力动脉的细胞培养模型，可用于解析内皮细胞、平滑肌细胞内或内皮细胞与平滑肌细胞之间（即肌内皮连接）的信号通路。利用该细胞培养模型，可选择性地应用激动剂或进行蛋白质分离、电子显微镜检测以及免疫荧光分析。

肌内皮连接（myoendothelial junction, MEJ）是小直径阻力动脉中一种独特的信号微结构域，具有特定蛋白质的定位特征，并……

该技术的总体目标是将内皮细胞和平滑肌细胞在体外共同培养，以构建出小直径阻力动脉中存在的肌内皮连接结构。该方法有助于回答心血管领域中的关键问题，例如动脉壁内蛋白质的定位及其信号级联的激活情况。该技术的主要优势在于，能够特异性地从内皮细胞和平滑肌细胞中分离出肌内皮连接组分，而这一点在使用真实动脉组织时是无法实现的。石蜡包埋的可视化演示尤为关键，因为若不亲眼观察该过程，包埋步骤可能难以掌握。开始构建血管细胞共培养体系（VCCC）时，先用消毒剂喷洒150毫米的培养皿及其皿盖，然后用纸巾或无尘擦拭布擦拭。接着，用70%乙醇喷洒培养皿，并将其放入生物安全柜中晾干。在无菌条件下打开滤器插件板。通过侧边狭缝将最多一毫升的fiberactin溶液用移液器加入板底部，以在滤膜底面进行包被。确保滤膜的下半部分被完全覆盖，并将插件置于生物安全柜中，同时保留板盖。用纤维作用溶液处理30分钟后，抽吸去除多余溶液，注意不要扰动滤插件。然后将培养板倒置，使滤膜落入洁净培养皿的底部半部分。用3毫升预热的胰蛋白酶EDTA溶液对一个225平方厘米的平滑肌细胞培养瓶进行胰蛋白酶消化处理。待细胞脱落后，加入九毫升 SMC 培养基以中和胰蛋白酶。转移至锥形管中并充分混匀。随后，用移液器吸取 10 微升细胞悬液至血细胞计数板，测定细胞数量。进行细胞计数后，将含有约 75,000 个平滑肌细胞的 750 微升细胞悬液小心地接种到每个滤膜的底面。将培养板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 2 毫升新鲜预热的平滑肌细胞培养基填充洁净的六孔板的每个孔。用吸管吸出插入式培养小室中的培养基，并将其转移至含有 SMC 培养基的六孔板中。向插入式培养小室的上层加入 1 毫升 0.5% 牛明胶溶液，置于 37°C 环境中孵育至少 30 分钟。用 3 毫升预热的胰蛋白酶-EDTA 溶液对一个 225 平方厘米的内皮细胞培养瓶进行胰酶消化处理。轻轻敲击培养瓶，使细胞从培养板上脱落。将细胞在EC培养基中重悬并进行细胞计数后，去除滤膜上的明胶。随后，将360,000个内皮细胞（ECs）以1毫升体积接种至每个滤膜插件的上表面。将细胞在37摄氏度下静置孵育24小时。开始进行组分分离：在细胞培养操作台中，用吸管吸去一个六孔板插入物中的培养基，随后将其置于冰上并转移至冷室。在冷室中，用移液器将10微升PBS滴加到插入物的SMC侧。使用细胞刮刀刮下平滑肌细胞（SMCs）。然后，将细胞从刮刀转移至含有裂解缓冲液的已标记培养皿中。一旦细胞刮刀接触裂解缓冲液，除非已用纸巾彻底擦拭并干燥，否则不得再次接触插入式滤膜。重复刮取 SMC 滤膜一至两次，以彻底去除残留的 SMC 细胞碎片。接着，用移液器将 10 µL PBS 加到插入式滤膜的内皮细胞侧。按照刚刚演示的方法，将细胞刮入已做好相应标记的含有裂解缓冲液的培养皿中。用移液管收集滤膜EC侧的

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医学

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