阻力动脉的细胞培养模型

该技术的总体目标是在体外一起培养内皮细胞和平滑肌细胞，以产生发生在小直径阻力动脉中的肌内皮连接。这种方法可以帮助回答心血管领域的关键问题，例如动脉壁中蛋白质定位和信号级联反应的激活。这种技术的主要优点是您可以从内皮和平滑肌中特异性地分离出肌内皮连接部分，这是使用实际动脉无法做到的。

蜡包埋的视觉演示尤为重要，因为如果不看到过程，可能很难学习包埋步骤。开始构建维管细胞共培养物或 VCCC，方法是用消毒剂喷洒 150 毫米的培养皿和盖子，然后用纸巾或无绒湿巾擦拭。然后，用 70% 乙醇喷洒培养皿，并将其放入罩中风干。

在无菌条件下打开过滤器插件板。通过侧缝将最多一毫升的纤维肌动蛋白溶液移液到板的底部，用纤维肌动蛋白溶液涂布过滤器的底部。确保过滤器的下半部分被覆盖，并将插件留在罩中，保持板盖。

用 fiberaction 溶液处理 30 分钟后，在不干扰过滤器插件的情况下用真空吸尘任何多余的溶液。然后，倒置板，将过滤器放入干净培养皿的下半部分。用 3 mL 预热的胰蛋白酶 EDTA 溶液对 225 平方厘米的平滑肌细胞培养瓶进行胰蛋白酶消化。

细胞脱落后，加入 9 mL SMC 培养基以中和胰蛋白酶。转移到锥形管中并充分混合。然后，将 10 微升移液到血细胞计数器上以确定细胞数量。

进行细胞计数后，小心地将 750 微升含有大约 75， 000 个平滑肌细胞的细胞悬液接种到每个过滤器的底部。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 2 毫升新鲜预热的 SMC 培养基填充干净的 6 孔板的每个孔。

通过抽吸从插件中取出培养基，并将其转移到装有 SMC 培养基的六孔板中。在插件的上侧加入 1 毫升 0.5% 牛明胶溶液，并在 37 摄氏度下放置至少 30 分钟。用 3 毫升预热的胰蛋白酶 EDTA 溶液对 225 平方厘米的内皮细胞培养瓶进行胰蛋白酶消化。

轻轻敲击培养瓶，将细胞从培养板中取出。将细胞重悬于 EC 培养基中并进行细胞计数后，从过滤器中取出明胶。然后，将 360， 000 个 EC 以 1 毫升的体积接种到每个过滤器插件的顶部。

让细胞在 37 摄氏度下不受干扰地孵育 24 小时。通过从细胞培养通风橱中的一个 6 孔板插入片段中吸出培养基，然后运输到冰上的冷藏室中，开始分级分离。在冷藏室中，将 10 微升 PBS 移液到插入物的 SMC 侧。

使用电池提升器刮下 SMC。然后，将细胞从刮擦器转移到含有裂解缓冲液的标记培养皿中。细胞刮擦器接触裂解缓冲液后，在纸巾完全擦拭并擦干之前，不要让它接触插入式过滤器。

再重复 SMC 过滤器的刮擦一次或两次，以完全去除剩余的 SMC 细胞碎片。接下来，将 10 微升 PBS 移液到插入过滤器的内皮细胞侧。如刚才所示，将细胞刮入适当标记的裂解缓冲液培养皿中。

用移液管从过滤器的 EC 侧收集细胞浆液，并转移到适当标记的培养皿中。非常彻底地从过滤器两侧刮除细胞，以确保肌内皮连接部分的细胞污染最小。接下来，小心地使用手术刀从塑料嵌件上切出过滤器。

为此，请从塑料上切下 70% 到 80% 的过滤器，然后使用镊子将过滤器完全从塑料嵌件结构上拉出。将每个过滤器指向含有裂解缓冲液的标记 50 ml 锥形管中。确保过滤器浸入缓冲液中并保持湿润。

从过滤器中收获所有细胞后，将 50 mL MEJ 管全强度涡旋 15 秒或直至混合均匀。用镊子从 MEJ 锥形中取出过滤器，沿着管的侧壁拖动它们，以在管中留下最大量的蛋白质和液体。从 MEJ 锥形管中取出所有过滤器后，在离心机中快速旋转，将所有液体和蛋白质拉到管底部。

离心后，将 MEJ 管以及 SMC 和 EC 培养皿的内容物转移到单独的较小离心管中。然后，将试管以接近 16， 000 x G 的离心力在 4 摄氏度下离心 15 分钟。去除上清液。

然后，使用拜锌石测定法测定细胞裂解物的蛋白质含量。在 VCCC 孵育的第 5 天，向每个含有冲洗过的过滤器插件的孔中加入 4% PFA，并在 4 摄氏度下振荡孵育过夜。大约 24 小时后，将插入片段转移到 70% 乙醇中至少 24 小时。

在自动组织脱水机上长时间处理过滤器。运行后，使用镊子从过滤器盒中取出过滤器，将过滤器固定在边缘，然后用剪刀将过滤器切成两半。将两半分别放在冷板上，并用液体石蜡填充包埋模具。

将填充的包埋模具非常短暂地接触冷板上，然后将过滤器的每一半嵌入包埋模具中，切割面朝下，以确保过滤器从中心切开。使用镊子将过滤器固定到位，以防止两半相互落合，直到石蜡冷却到足以独立站立。然后，将包埋模具移至冷板上，直至完全凝固。

在垂直方向上嵌入和剖切过滤的插入。切片后，可对 VCCC 进行免疫染色以进行横向免疫荧光。该免疫传递电子显微镜图像显示了小鼠动脉，在 MEJ 处表达 α 珠蛋白，金珠标记，金珠显示为黑点。

该蛋白质印迹表明，与 EC 或 SMC 组分相比，纤溶酶原激活物抑制剂 1 在 MEJ 组分中的表达富集。塑料 EC 表示在塑料培养皿上生长的 EC 不会形成 MEJ。免疫染色揭示了 VCCC 模型的紧密区室化。

α-1 肾上腺素能受体 1 仅见于平滑肌细胞层，缓激肽受体仅见于内皮细胞层。F 肌动蛋白染色在体外 MEJ 的两种细胞类型中均存在，如白色箭头所示。在尝试此过程时，重要的是要记住在收获之前保持所有无菌状态，小心地为细胞铺板并彻底刮擦过滤器。

按照此程序，可以执行其他方法，如蛋白质印迹或免疫荧光，以回答其他问题，如蛋白质定位、表达水平或激活。