Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

该程序的总体目标是鉴定活细胞中的 RNA 结合蛋白，并使用 UV 介导的光交联然后进行质谱分析来绘制其 RNA 结合区域。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如哪些表观遗传调节因子与 RNA 结合以及相互作用需要哪些蛋白质区域。该技术的主要优点是它不涉及蛋白质 RNA 复合物的纯化，因此需要的材料很少，并且可以识别与任何类型 RNA 结合的蛋白质。

如前所述，该方法侧重于核蛋白，因为这是我们的科学兴趣，但只要对分级分离步骤进行微小的修改，它就可以用于研究 RNA 和其他 stu-nu-lar 区室中的结合蛋白。根据文本方案培养和扩增小鼠 ESC 后，将细胞扩增至所需数量的 10 厘米板。在板达到汇合之前，将 4 个 SU 直接添加到培养基中，最终浓度为 500 微摩尔。

不要处理 4sU 对照皿。轻轻摇动板，使 4sU 均匀分布在整个培养基中，然后将板放回同一组织培养箱中 2 小时。4sU 掺入的效率因细胞类型而异，因此可能需要优化其浓度和孵育时间，以确保有效交联并最大限度地降低毒性。

接下来，将板转移到冰桶中并丢弃培养基。然后，使用 5 毫升冰冷的 PBS 轻轻冲洗板。加入 2 毫升冰冷的 PBS，将没有盖子的板放入配备有 UV-B 发射灯泡的交联剂中。

以每平方厘米 1 焦耳的能量设置照射板。高效的 UV 交联至关重要。我们建议使用 UV-B 光，但也可以使用 UV-A。

在任何情况下，应优化紫外线能量的使用量，并可通过 PAR-CLIP 或 ChIRP 进行监测。使用细胞提升器收集细胞并将其转移到锥形管中的冰冷 PBS 中。然后，将细胞在 2000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。

去除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 毫升含 2 毫摩尔 EDTA 和 0.2 毫摩尔 PMSF 的冰冷 PBS 中。用血细胞计数器对细胞进行计数。预计 10 厘米和 15 厘米板分别有 5 到 10 到 1000 万个细胞，以及 10 到 2000 万个细胞。

然后，将细胞在 2000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。要从细胞中分离细胞核，请按照文本方案中的概述准备冰冷的缓冲液 A。使用前，将 0.5 毫摩尔 DTT 和 0.2 毫摩尔 PMSF 添加到所需量的缓冲液中 A.向细胞中加入 2 毫升冷缓冲液进行洗涤，然后在 2500 倍 g 和 4 摄氏度下旋转细胞 5 分钟。

弃去上清液，加入补充有 0.2% 非离子、非变性去污剂的缓冲液 A，然后将样品在 4 摄氏度下旋转 5 分钟。将细胞以 2500 次 g 离心 5 分钟后，去除上清液。该沉淀由没有细胞质的完整细胞核组成。

要裂解细胞核，请在试管中加入 200 μL 裂解缓冲液。使用 1/8 英寸探针对样品进行超声处理，以 50% 的振幅设置剪切染色质 5 到 10 秒。以 12000 次 g 离心样品 5 分钟，仅收集 175 μL 上清液以避免沉淀。

接下来，通过 Bradford 测定或类似技术测量蛋白质浓度。然后，使用裂解缓冲液将不同样品中的蛋白质稀释至 1 毫克/毫升或最低样品浓度。向细胞核裂解物中加入 5 毫摩尔 DTT 溶液，并在室温下孵育样品 1 小时。

然后，从新鲜储备液中加入 14 毫摩尔碘乙酰胺，并在室温下避光孵育裂解物 30 分钟。用 5 倍体积的 50 毫摩尔碳酸氢铵稀释裂解物，然后加入胰蛋白酶。将样品在 37 摄氏度下孵育过夜。

要为每个样品准备一个定制的阶段吸头，请将一盘固相萃取 C18 材料放入 200 微升移液器吸头的底部。在 C18 盘顶部加入 50 μL Oligo R3 反相树脂，然后将载物台尖端放入离心适配器内，并将适配器放入 1.5 mL 微量离心管内。在尖端中加入 100 微升 100% 乙腈以清洗它们。

然后将吸头以 1000 倍 g 离心 1 分钟以去除溶剂。用 50 微升 0.1% 三氟乙酸或 TFA 平衡吸头。然后，再次旋转它们。

向消化的蛋白质样品中加入 100% 甲酸，将 PH 值降低到 2 到 3。然后，将样品加载到定制的载物台吸头上，并以 1000 次 g 离心样品 1 分钟，直到所有样品都通过吸头。用 50 μL 0.1% TFA 洗涤结合的肽。

然后，将样品以 1000 次 g 离心 1 分钟后，向载物台吸头中加入 50 μL 洗脱缓冲液洗脱肽，并以 1000 次 g 离心 1 分钟，以迫使洗脱缓冲液从吸头中排出。使用设置为 150 倍 g 和 1 至 3 千帕的真空离心机干燥样品 1 小时。要从样品中去除交联 RNA，请将沉淀重悬于 50 μL 2x 核酸酶缓冲液中。

在 280 纳米处测量肽浓度，假设每毫升肽 1 毫克，A280 为 1。使用 2x 核酸酶缓冲液将所有样品调整至 1 毫克/毫升或最低浓度，然后制备 50 微升水和 1 微升高纯度核酸酶的预混液。将 50 μL 肽样品与 50 μL 水加核酸酶预混液混合。

然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。最后，根据文本方案进行纳米液相色谱、质谱和数据处理。该图显示了小鼠 ESC 的 RBR id 结果的火山图。

与 RNA 识别基序结构域重叠的肽为蓝色，显示出高度一致的去除水平。来自 HNRNPC 的 RNA 结合肽以红色突出显示。此处显示的是 RBR id 分数的热图，该分数计算为蛋白质区域 RNA 结合可能性的估计值。

该分数投影在剪接体亚基 U1-70k 的表面上。由晶体结构决定的 RNA 接触点附近的亮红色表明蛋白质 RNA 相互作用的正确鉴定。在该图中，TET2 表示为一种新的 RBP，并且通过沿蛋白质一级序列绘制 RBR id 分数，将 RNA 结合活性映射到 C 末端区域。

最后，可以通过使用野生型序列执行 PAR-CLIP 并将信号与缺乏预测 RBR 的突变体的信号进行比较来验证对这种新型 RBR 的要求。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内在 7 到 8 小时内完成。在交联之前，可以用各种处理刺激细胞，以回答其他问题，例如分化如何开始或细胞周期如何调节 RNA 蛋白相互作用。

观看本视频后，您应该对如何生成包含交联蛋白 RNA 复合物的额外物质有很好的了解，以识别蛋白质 RNA 与质谱相互作用的位点。