Name: 小鼠骨骼肌形态及纤维型成分的半自动化分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学习使用免疫组织化学染色结合半自动化算法对小鼠骨骼肌纤维类型进行快速鉴定与形态分析的方法。该技术可高效区分I型、IIA型、IIX型和IIB型肌纤维，为肌肉生物学研究及疾病机制探索提供可靠工具。

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我们感谢博特彻基金会和肌萎缩侧索硬化协会（#17-II-344）对本研究的支持。

所有涉及小鼠的实验程序均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理与使用委员会批准（编号：91813(05)1D）。
1. 第1天：使用牛血清白蛋白（BSA）封闭的初级（1°）免疫染色
<ol>
	<li>风干小鼠后肢肌肉的冰冻切片（例如，胫骨前肌，腓肠肌）置于带电载玻片上约 30 分钟11使用疏水性屏障PAP笔在切片周围画出边界。</li>
	<li>放置约 ~ 250 &#181;L 每张载玻片上加入5% BSA/磷酸盐缓冲液（BSA/PBS）以封闭非特异性抗体结合位点，室温孵育1小时。</li>
	<li>封闭期间，将1以1:50的比例稀释&#176; 5% BSA/PBS 中的抗体上清液（均为小鼠单克隆抗体；参见 表16,12）；准备 250 &#181;L 每张载玻片加入适量溶液。保持 1&#176; 抗体储备液及稀释液置于冰上。</li>
</ol>
<img alt="表1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> 
表1：用于区分MyHC的初级抗体。
<ol start="4">
	<li>吸除5% BSA/PBS封闭液后，加入 250 &#181;L 1 的&#176; 将抗体稀释液加入相应的载玻片。添加 250 &#181;L 5% BSA/PBS 的二抗2&#176;) 仅抗体阴性对照切片。</li>
	<li>孵育于 4 &#176;C 在湿润环境中孵育24 - 48 h。 
	注意：用铝箔包裹并铺有湿润滤纸的培养皿可作为合适的培养环境。</li>
</ol>
2. 第2天：使用荧光抗体进行二抗免疫染色
<ol>
	<li>吸去一抗溶液或对照 5% BSA/PBS 溶液。用 5% BSA 将所有切片洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>洗涤的同时，用 5% BSA/PBS 配制纯化的荧光素偶联二抗的 1:200 稀释液（见表 2，均为山羊抗小鼠抗体）。每张切片准备 250 µL 溶液。将荧光素偶联的二抗置于冰上并避光保存。</li>
</ol>
<img alt="表2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> 
表2：用于可视化初级抗体对MyHC识别的荧光素偶联二抗。
<ol start="3">
	<li>第三次加入5% BSA/PBS封闭液并吸出后，向所有载玻片中加入250 µL二抗稀释液。在避光、湿润的环境中室温孵育90分钟。</li>
	<li>吸除二抗溶液。用5% BSA/PBS对所有载玻片洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>用PBS冲洗。干燥10分钟。</li>
	<li>使用非永久性、低粘度的水溶性封片剂封固盖玻片。</li>
	<li>干燥后，用指甲油密封载玻片边缘。完全干燥后置于避光的载玻片盒中保存。</li>
</ol>
3. 使用落射荧光显微镜对载玻片进行成像
<ol>
	<li>用少量浸有70%乙醇的实验室擦拭纸清洁载玻片。</li>
	<li>使用配备摄影装置的落射荧光显微镜获取免疫染色肌肉切片的数字图像（参见材料表）。
	<ol>
		<li>选择约1 mm2的区域（10倍物镜，1.4 NA）。</li>
		<li>通过505 nm长通滤光片观察Alexa 488标记的二抗荧光信号，通过595 nm长通滤光片观察Alexa 594标记的二抗在激发下产生的荧光信号。使用配备兼容成像软件的PC计算机对图像进行数字化处理，并从成像软件中添加标尺，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用 Fiji 分析图像
注意：在进行分析之前，必须通过 https://imagej.net/Fiji/Downloads 安装Fiji（可从美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院免费获取）。此外，本流程中使用的宏文件包含在补充文件中。请将宏文件放置于一个易于访问的目录中。
<ol>
	<li>在 Fiji 中加载选定切片的明场图像。导航至 插件 &#8594; 分割&#160;&#8594; 可训练的 Weka 分割</li>
	<li>为了界定切片的细胞区域，在纤维上画一条线，然后单击 &#34;加入班级 1&#34;然后，在纤维之间的空隙处画一条线，然后单击 &#34;添加到第二类&#34; 标记细胞外结构域。重复操作，直至每一类中均有5-10个标记。
	<ol>
		<li>点击“训练分类器”。在生成的红色和绿色叠加图像上，如有必要，手动添加更多标签至分割错误的图像区域（参见步骤 4.2）。重复此过程，直至纤维（红色）与纤维间间隙（绿色）被正确分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 &#34;获取概率&#34; 并将图像保存到新命名的文件夹中。</li>
	<li>重复上述步骤（4.2 - 4.3），使用同一视野下拍摄的荧光图像。将免疫染色的纤维标记为 &#34;1类&#34; 以及所有非荧光区域作为 &#34;2类&#34;将生成的概率图保存到与处理后的明场图像相同的文件夹中。</li>
	<li>在 Fiji 中打开一个先前保存的概率图。在成像软件提供的比例尺上绘制一条直线。转到 分析&#160;&#8594; 设定比例尺。更改参数（即，已知距离，长度单位）设置为比例尺所示的相应数值，然后检查 &#34;全球&#34; 使用标尺框对每幅图像的尺度进行标准化。</li>
	<li>导航至插件&#160;&#8594; 宏&#160;&#8594; 运行&#160;&#8594; 泰亚吉 等 纤维定量宏文件.ijm（参见 补充文件）。此时将立即出现一个导航窗格。打开该图像所在的文件夹，此时会弹出一个对话框。对于每个对话框，更改 &#34;背景&#34; 下拉值至 &#34;光。&#34; 
	注意：文件夹中将自动生成纤维轮廓的图像以及包含结果数据的电子表格文件（横截面积和Feret直径是量化纤维形态最关键的参数；测量参数可在“Analyze Set Measurements”中调整）。Fiji软件的孔隙分析功能生成的纤维形态数据将自动导出至电子表格文件，适用于荧光图像和明场图像。</li>
	<li>通过将视野中表达特定MyHC的荧光纤维数量除以相应明场图像中的总纤维数量，计算该视野中表达给定MyHC的纤维比例。</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文为骨骼肌纤维类型的鉴定提供了实用的指导，并介绍了一种用于数据分析的新算法。
由于我们的结果在很大程度上证实了先前研究报告5,8,10的结论，并且与我们自身的手动测量结果一致，因此该算法似乎是准确的。尽管如此，我们仍遇到了一些不常见的实验陷阱，包括因切片伪影导致的纤维边界不清。通过仔细切片并在分析前对处理后的切片进行仔细检查，可将这些伪影的影响降至最低。特别是，可通过在同一图像上进行多轮重新分类，以获得更清晰的对比度，从而避免图像分割效果欠佳的问题。
本方案中最关键的步骤是第4.2步，即通过在特定纤维上绘制线条来界定该切片的细胞内和细胞外区域，从而区分出&#34;1类&#34;或&#34;2类&#34;区域。显然，这种人工区分至关重要，因为它决定了肌纤维的边界；此步骤中的任何误差都将对纤维尺寸的评估产生不利影响。
<p class=...

长期以来人们已知骨骼肌由多种类型的单根肌纤维组成1。最初，根据收缩特性将肌纤维分为两类，并相应地命名为慢缩纤维（I型）和快缩纤维（II型）。随后又根据纤维的代谢特征进一步区分这两类纤维。由于I型纤维富含线粒体且依赖氧化代谢，因此通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-四唑盐还原酶（NADH-TR）脱氢酶2或琥珀酸脱氢酶（SDH）3染色可观察到强阳性反应。相比之下，II型纤维的NADH-TR脱氢酶或SDH染色较弱且程度不一，根据其相对氧化能力粗略地分为两个快缩亚型（IIA型和IIB型）。这些纤维类型之间的差异可通过肌球蛋白-ATP酶染色更清晰地显示：在pH 4.0条件下预孵育后，I型纤维染色较深；而在pH 10.0条件下预孵育后，IIB型纤维沉淀物吸收明显，IIA型纤维则呈中等染色4。
最近，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分肌纤维类型的方法5I型、IIA型和IIB型肌纤维可根据其MyHC表达谱被精确区分。此外，还鉴定出另一种快速收缩、代谢特征介于中间的肌纤维类型，即IIX型。6表达多种MyHC的混合纤维也已得到证实5,7,8一些物种（如猫和狒狒）已知不表达IIB型肌球蛋白重链6尽管肌球蛋白重链（MyHC）免疫染色目前是评估肌肉组成的先进技术，但若缺乏自动化辅助，通过该技术获得数据的分析过程繁琐且耗时。为此，已开发出若干种半自动化方法用于分析此类数据。5,9,10在此，我们介绍一种用于免疫组织化学鉴定肌纤维类型的相对标准方案5,7,8,10, 以及一种新型半自动算法，可准确快速地分析纤维类型和纤维形态。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 倒置荧光与明场显微镜</td><td></td><td>已停产</td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 一抗</td><td>爱荷华大学发育研究杂交瘤库</td><td></td><td>单克隆小鼠 IgG2b；1:50</td></tr><tr><td>SC-71 一抗</td><td>爱荷华大学发育研究杂交瘤库</td><td></td><td>单克隆小鼠 IgG1；1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 一抗</td><td>爱荷华大学发育研究杂交瘤库</td><td></td><td>单克隆小鼠 IgGM；1:50</td></tr><tr><td>6H1 一抗</td><td>爱荷华大学发育研究杂交瘤库</td><td></td><td>单克隆小鼠 IgGM；1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>山羊抗小鼠；1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>山羊抗小鼠；1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>山羊抗小鼠；1:200</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>用液氮冷却</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x，稀释至1x</td></tr><tr><td>Kim擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠骨骼肌形态及纤维类型组成的半自动分析

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

多年来，骨骼肌纤维类型的区分主要依靠肌球蛋白ATP酶染色法进行观察。近年来，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分纤维类型的方法。目前，可根据MyHC表达谱精确识别I型、IIA型、IIX型和IIB型纤维；然而，这些数据的手动分析可能十分耗时且极为繁琐。因此，快速、准确地评估纤维类型组成及纤维形态成为一种非常理想的工具。本文介绍了一种先进的实验方案，结合对小鼠后肢肌肉冷冻切片进行MyHC免疫组织化学染色，并配合一种新型的半自动分析算法，以加速纤维类型和纤维形态的分析。正如预期，腓肠肌主要显示I型和IIA型纤维的染色，而无IIX型或IIB型纤维的染色。相反，胫骨前肌主要由IIX型和IIB型纤维构成，含有少量IIA型纤维，几乎不含或完全不含I型纤维。我们采用了多种图像转换方法生成概率图，用于测量纤维形态的不同参数（即横截面积（CSA）、最大和最小Feret直径）。所获得的这些参数值与手动测量结果进行了比较，两种分析方法在CSA、最大Feret直径和最小Feret直径方面均无显著差异（所有p &#62; 0.05），表明本方法具有良好的准确性。因此，本免疫染色分析方案可广泛应用于多种衰老和肌病模型中肌肉组成变化的研究。

后肢肌肉（即，从一只年龄不详的雄性C57BL/6小鼠中分离出的胫骨前肌、比目鱼肌，被置于盛有OCT包埋剂的塑料模具中，浸入液氮冷却的异戊烷进行速冻。随后，使用冷冻切片机切取8-10 &#181;m 连续切片在 -20 &#176;C 并转移至不同的带正电荷的玻璃载片上12.
我们选择胫骨前肌和比目鱼肌，是因为这些肌肉分别主要由快肌纤维和慢肌纤维组成13,14在对I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC分别进行免疫组织化学染色后，采集了明场和荧光图像。左侧面板的 图1 用所列的I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC特异性抗体对腓肠肌进行免疫染色后的切片展示 表1.
<...

肌球蛋白重链同工型的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维类型鉴定的先进技术即，I型、IIA型、IIX型、IIB型）。本文介绍了一种染色方案，并提供一种新型半自动算法，可促进对肌纤维类型及肌纤维形态的快速评估。

多年来，骨骼肌纤维类型的区分主要通过肌球蛋白-ATP酶染色来直观显示。近年来，通过针对……的免疫组织化学染色

本实验方案的总体目标是利用先进的免疫组织化学技术，准确且快速地鉴定骨骼肌纤维类型。该方法有助于解答肌肉生物学领域的一些关键问题，例如纤维类型的变化是否由功能性蛋白的缺失所引发。尽管该方法可为多种肌肉疾病模型提供深入见解，但它也可应用于基因敲入和基因敲除模型等系统，以揭示单个分子对基础肌肉功能所产生的更广泛影响。首先，将小鼠肌肉的冷冻切片置于带电荷的载玻片上，室温下空气干燥约半小时。干燥后，使用疏水性屏障PAP笔在每张载玻片上的切片周围画出边界。接下来，为阻断非特异性抗体结合，在所画边界内加入约250 µL含5% BSA的PBS溶液，并将载玻片在室温下孵育1小时。同时，用5% BSA PBS缓冲液将一抗稀释1至50倍。每张载玻片准备约250微升稀释抗体溶液，并将稀释后的抗体溶液置于冰上保存。封闭结束后，吸去载玻片上的封闭液，每张载玻片加入250微升稀释的一抗溶液。作为阴性对照，在 PBS 中加入 5% BSA，不加一抗。接着，将培养皿中放入润湿的滤纸，并用铝箔包裹，以形成孵育室。然后将载玻片置于孵育室或具有相同湿度的类似环境中，在 4°C 下孵育 24 至 48 小时。一抗孵育后，吸去切片上的溶液，并将切片洗涤三次。每次洗涤时，加入约 250 µL 含 5% BSA 的 PBS，孵育约 10 分钟。在洗涤切片的同时，配制纯化的荧光素标记二抗，稀释比例为 1:200。每个载玻片至少准备 250 微升溶液，并将溶液置于避光和冰上保存。第三次洗涤后，向载玻片加入 250 微升的二抗稀释液。然后在室温下的避光湿盒中孵育 90 分钟。孵育结束后，吸去抗体溶液，并如前所述将玻片洗涤三次。洗去所有未结合的二抗后，用 PBS 冲洗玻片，室温静置晾干 10 分钟。最后，使用非永久性低黏度水溶性封片剂封片。待培养基干燥后，用指甲油密封盖玻片边缘，并将载玻片转移至不透明的储存盒中。成像前，用70%乙醇清洁盖玻片，然后使用落射荧光显微镜获取数字图像。在低倍镜下选择一个一平方毫米的感兴趣区域。观察Alexa 488标记的抗体时，使用505纳米长通滤光片；观察Alexa 594标记的抗体时，使用595纳米长通滤光片。在正确设置滤光片后，开始采集数字图像。务必包含比例尺，以便后续分析。进行分析时，需安装本出版物提供的宏，并在 Fiji 中运行。将宏文件存储在易于访问的目录中。现在加载所选切片的明场图像，并导航至可训练的 WEKA 分割选项。为了界定切片中的细胞区域，在纤维上绘制一条线，然后单击“添加到类别一”。然后标记细胞外区域，在纤维之间的空隙处画一条线，然后单击“添加到类别二”。重复此过程，直至每个类别定义出5到10个标签。标记间质边界可能会有困难。使用缩放功能可以更精确地标记这些边界。接下来，选择“训练分类器”选项。在生成的红色和绿色叠加图像上，手动为自动化分割过程中被错误分割的图像区域添加更多标签。重复此操作，直至红色标记的纤维与绿色标记的间隙区域得到适当分离。然后点击“获取概率”，并将图像保存至新的文件夹中。接着，使用同一视野下采集的荧光图像，重复整个过程。将免疫染色的纤维标记为一类，所有无荧光区域标记为二类。最终，将生成的概率图保存至已处理的明场图像所存储的同一文件夹中。接着，在 Fiji 中打开一个先前保存的概率图。在成像软件提供的比例尺上画一条直线。选择“设置比例尺”并根据比例尺输入正确的数值。然后启用全局选项，将比例尺标准化至每幅图像。现在，运行 Tyagi 宏以进行纤维定量，导航窗格将会出现。然后打开图像的主文件夹。在关联的对话框中，将背景下拉菜单的值更改为浅色。可以使用设定测量功能来定义应测量的参数。横截面积（CSA）和纤维直径是量化纤维形态最相关的测量指标。运行宏后，文件夹中将生成包含纤维轮廓的图像以及由分析功能生成的测量数据表格。采用所述方法分析了胫骨前肌和比目鱼肌，因为这些肌肉主要由快肌或慢肌纤维组成。使用特异性抗体鉴定了多种不同的肌球蛋白重链。比目鱼肌的大量肌纤维表达Ⅰ型和ⅡA型肌球蛋白重链，其余部分肌纤维中有相当数量对ⅡX型呈阳性。相比之下，几乎未见ⅡB型纤维。相比之下，染色的胫骨前肌主要由表达ⅡB型和ⅡX型肌球蛋白重链的肌纤维组成，表达ⅡA型肌球蛋白重链的纤维占比较小，几乎未检测到表达Ⅰ型肌球蛋白重链的纤维。使用靶向ⅡA型肌球蛋白重链的SC-71抗体对胫骨前肌进行形态计量分析，通过多种图像转换生成概率图。该自动化分析方法简便，所得数据与传统繁琐的手工计算结果完全具有可比性。总计，该分析获得了约 6,000 根单根肌纤维的数据。高通量的数据采集使统计分析变得更加可行。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对肌肉切片进行免疫染色，并利用所提供的半自动化软件辅助分析肌纤维类型及其组成。在进行该操作时，需注意肌肉组织可能存在区域性异质性，因此必须分析多个肌肉区域，才能对肌纤维类型及组成进行严谨评估。结合本实验方法，还可开展其他检测方法，如三色染色（Trichrome staining），以进一步探讨纤维化是否伴随肌纤维类型组成的变化而发生。

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准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy...

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

本方案展示了如何从冻干的人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并利用点印迹技术根据肌球蛋白重链（MHC）同工型进行纤维类型分类。鉴定出的MHC...

人类骨骼肌纤维类型鉴定

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

一套直接有效的方法，用于分离并鉴定骨骼肌中表达量最高的蛋白质。从10...

基于蛋白质组学的骨骼肌性别二态性研究

学习使用免疫组织化学染色结合半自动化算法对小鼠骨骼肌纤维类型进行快速鉴定与形态分析的方法。该技术可高效区分I型、IIA型、IIX型和IIB型肌纤维，为肌肉生物学研究及疾病机制探索提供可靠工具。

小鼠骨骼肌形态及纤维类型组成的半自动分析

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