Name: 人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学习人视网膜解剖与RPE-脉络膜蛋白质组分析技术，使用四毫米活检工具从黄斑、中央凹及周边视网膜采集组织样本。该方法为神经科学与眼科学研究提供精确的分子分析手段。

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VBM 由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 [K08EY020530、R01EY024665、R01EY025225、R01EY024698 和 R21AG050437]、Doris Duke慈善基金会资助项目编号：2013103，以及防止失明研究基金会（RPB），纽约，纽约州支持。MT 和 GV 由 NIH 资助项目 T32GM007337 支持。

本研究已获得爱荷华大学机构审查委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》中提出的原则。
1. 黄斑和中心凹活检打孔
<ol>
	<li>将人眼打开并展成蝴蝶状，使其形成四个独立的组织瓣，具体操作如先前发表的文献所述。5</li>
	<li>从置于培养皿中的剖开的人眼开始，将4毫米的打孔活检工具对准黄斑中心，下压并轻轻滚动，直至在黄斑周围形成切口。</li>
	<li>接下来，将8-mm皮肤打孔活检工具对准黄斑区血管弓内侧中心并轻轻按压，同时进行滚动，以在黄斑周围制作切口。这将形成围绕第一圈组织的第二个外环状组织。</li>
</ol>
2. 周边视网膜活检穿刺
<ol>
	<li>使用4-mm皮肤打孔活检工具在周边视网膜的弓状结构外侧进行一系列打孔。每个象限瓣膜处制作两个打孔。 
	注意：完成所有打孔后，眼球中央将呈现两个同心圆状打孔，分别代表黄斑和中心凹，每个瓣膜基部各有两个打孔，周边视网膜共8个打孔。</li>
</ol>
3. 黄斑和中心凹活检样本采集
<ol>
	<li>由于组织现已准备就绪，可将所有组织活检样本分别收集于微量离心管中，并使用液氮冷冻，以用于后续处理。所有样品在使用前均应保存在 -80 °C 条件下。</li>
	<li>使用弯曲的 0.12 Colibri 镊子夹住视网膜中央凹透明组织的边缘。采集时，抬起并分离中央凹组织与下方的视网膜色素上皮层-脉络膜。</li>
	<li>同样，使用 0.12 Colibri 镊子夹取透明黄斑区组织的外环部分。如果组织仍与下方或邻近组织相连，可使用 Westcott 剪刀小心修剪边缘，仅获取视网膜成分，并剔除穿孔中可能包含的视神经组织。</li>
</ol>
4. 周边视网膜采集
<ol>
	<li>使用弯曲的 0.12 Colibri 镊子轻轻将周边视网膜组织圆盘从下方的视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜分离，并放入各自的微量离心管中。</li>
	<li>若存在残留的玻璃体凝胶，应在收集视网膜组织前，先用镊子提起并尽可能分离去除凝胶。一旦视网膜被移除，下方仍保留有色素化的视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜。</li>
</ol>
5. 中央凹及黄斑区视网膜色素上皮-脉络膜采集
<ol>
	<li>使用0.12 Colibri镊子夹住位于已切除黄斑区下方的深色RPE-脉络膜组织边缘。小心将其从巩膜上分离并收集。</li>
	<li>使用同一把镊子夹住位于已切除黄斑区域下方的外圈深色RPE-脉络膜组织边缘。通过在环状组织的不同位置夹住边缘并轻轻牵拉，小心地将其从巩膜上分离。最终，该RPE-脉络膜组织环将被剥离，可进行收集。 
	注意：在去除过程中，对侧手使用辅助镊子有助于操作RPE-脉络膜组织。与视网膜组织类似，可使用Wescott剪刀辅助去除 punch工具未能完全切开的组织。</li>
</ol>
6. 周边视网膜 RPE-脉络膜采集
<ol>
	<li>使用0.12 Colibri镊子剥离8个周边穿孔区域的视网膜色素上皮-脉络膜组织。</li>
	<li>同前，将视网膜色素上皮-脉络膜组织置于微量离心管中，并用液氮冷冻以用于后续处理。所有样品在使用前均应保存在-80 °C条件下。</li>
</ol>
7. 剪刀解剖
注意：如果穿刺活检刀片钝化或穿刺活检工具施力不足，可能导致组织周围切口不整齐。
<ol>
	<li>在这些情况下，应尽可能将组织拉开，然后使用Westcott剪刀进行修剪和分离。</li>
</ol>

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<li>Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+protein+profiles+in+tissue+samples%3A+differing+outcomes+with+and+without+heat+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization.</a> J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).</li>
<li>Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Collection+Method+Bias+Effects+in+Quantitative+Phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).</li>
<li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).</li>
<li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405(2011).</li>
<li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li>
<li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

组织采集后，样本的处理与处置是至关重要的考虑因素14。相比化学固定，液氮保存更受推荐，因为后者可能破坏蛋白质结构，从而影响后续分析结果。此外，与不涉及样本冷冻的保存方法相比，液氮保存同样更具优势。值得注意的是，Ferrer et al. 的研究显示，4 °C 或室温下保存的脑组织样本与在 0 °C 保存的样本相比，其蛋白质水平存在显著差异15。此外，在样本处理过程中需格外谨慎，因为在冷冻前进行的特定化学或物理处理可能改变蛋白质含量及翻译后修饰16,17。这一点凸显了在处理样本时需充分考虑其后续分析用途的重要性。另外，组织采集的死后时间也是影响特定蛋白质水平与稳定性的另一因素。样本蛋白质组的降解程度取决于死后时间及储存温度18,19,20...

视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜是复杂的组织，其在蛋白质表达、生理功能及病理易感性方面表现出重要的区域差异1,2。例如，年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性以及中心性浆液性视网膜病变等疾病均分别在黄斑中心凹、黄斑区或视网膜周边部表现出特征性的病变定位1,3,4,6。本文介绍一种可对不同视网膜区域进行独立取样的方法。该方法的总体目标是为从人视网膜及RPE-脉络膜的中心凹、黄斑区和周边区域可靠地采集组织样本以进行蛋白质组学分析提供指导。开发并应用此技术的依据在于，通过对这些特定视网膜区域进行蛋白质组学分析，可获得有关这些区域生理与病理生理功能的重要分子层面的见解。
该方法有望揭示不同区域对疾病易感性的蛋白质组学基础，并有助于发现新的特异性治疗靶点。事实上，对玻璃体及其与视网膜相互作用的蛋白质组学研究已为健康和病变组织的分子组成与功能提供了关键见解5,7,8,9,10,11,12,13。然而，目前尚缺乏对不同视网膜区域进行明确的比较性蛋白质组学分析。本技术将有助于推动这些亟需开展的研究，通过提供一种可靠且可重复的组织采集方法，在与其他方法的比较中展现出优势。更重要的是，该方法具有很高的可及性，利用标准尺寸且易于获取的组织打孔活检工具即可完成。我们的技术强调了组织在蛋白质组学处理过程中的正确采集与储存，充分考虑了蛋白质稳定性与降解问题。因此，该方法最适合计划进行蛋白质组因子下游分子分析的研究人员使用。

<table><tbody><tr><td>4 毫米皮肤打孔活检工具</td><td>Miltex</td><td>REF 33-34</td><td></td></tr><tr><td>8 毫米皮肤打孔活检工具</td><td>Miltex</td><td>REF 33-37</td><td></td></tr><tr><td>0.12 Colibri 镊子</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1145</td><td></td></tr><tr><td>Wescott 剪刀</td><td>Sklar Surgical Instruments</td><td>64-3146</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>#022364111</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Praxair, Inc.</td><td>7727-37-9 [R]</td><td></td></tr></tbody></table>

人视网膜及视网膜色素上皮-脉络膜组织的解剖用于蛋白质组学分析

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

人类视网膜由感觉性神经视网膜和其下方的视网膜色素上皮（RPE）组成，RPE 与血管脉络膜层紧密连接。视网膜的不同区域在解剖结构和分子特征上各不相同，从而支持其独特功能，并表现出对疾病的差异性易感性。对这些区域和层次进行蛋白质组学分析，可为多种疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病和青光眼）的分子机制提供重要见解。然而，在进行定量蛋白质组学分析之前，必须首先分离视网膜的不同区域和层次。本文介绍了一种从人眼中分离和采集黄斑中心凹、黄斑区及周边视网膜区域及其下方 RPE-脉络膜复合体的方法，该方法包括区域性打孔活检以及手工剥离组织层。随后可采用一维 SDS-PAGE 及下游蛋白质组学分析技术（如液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS））鉴定各分离视网膜层中的蛋白质，从而揭示视网膜疾病的分子生物标志物。

视网膜和视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜组织可根据具体研究需求采用多种方式进行处理。采集后，研究人员将获得来自黄斑中心凹区、周边黄斑区和视网膜周边区的视网膜及RPE-脉络膜组织样本（图1）。具体而言，中心凹区打孔样本包含中心凹、旁中心凹以及少量相邻的周边中心凹区域；黄斑区打孔样本则包括剩余的周边中心凹区域以及少量相邻的近周边区域；最后，周边区打孔样本取自中周和远周视网膜区域。在一项代表性实验中，组织样本经胰蛋白酶消化后，采用一维SDS-PAGE分析以观察其蛋白质组成（图2A）。该分析结果表明，视网膜不同区域之间存在差异性蛋白质表达。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）6进一步分析，成功鉴定了视紫红质（rhodopsin）的肽段，该蛋白是视网膜中含量极高且具有特征性的蛋白质。来自黄斑区的一个代表性视紫红质质谱图如图2B所示。对蛋白质组成进行更...

人类视网膜由功能和分子特征不同的区域组成，包括中央凹、黄斑和周边视网膜。本文介绍一种利用打孔活检和手工剥离人眼组织层的方法，以分离并收集这些不同的视网膜区域，用于后续的蛋白质组学分析。

人类视网膜由感觉性神经视网膜和其下方的视网膜色素上皮（RPE）组成，后者与血管层紧密复合……

本视频将演示如何从黄斑中心凹、黄斑区及周边视网膜采集组织活检样本，用于蛋白质组学研究。我们将分多个步骤使用直径为4毫米的皮肤打孔活检工具。在将人眼组织剖开呈蝴蝶状后，将其置于培养皿中。将穿刺活检工具对准黄斑中心凹，向下按压并轻轻滚动，直至在黄斑中心凹周围形成切口。在黄斑血管弓区域内，以轻柔的压力对准并按压8毫米穿刺活检工具进行取样。再次使用4毫米穿刺活检工具，在血管弓外侧的周边视网膜区域进行一系列穿刺取样。每个瓣膜我们取两个组织样本。所有样本取完后，眼睛会呈现类似这样的情形。此时我们即可开始组织采集过程。我们使用弯曲的 0.12 号蜂鸟镊子夹住组织边缘。此处我们夹住黄斑中心凹视网膜的边缘。使用同一把镊子夹住黄斑区环形组织。在这种情况下，组织似乎粘附在圆盘上。可以使用西科特剪刀修剪边缘，以便仅获取视网膜。接下来，我们将注意力转向周边视网膜穿孔样本，使用蜂鸟镊子轻轻提起并将其与下方的视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜分离。在某些情况下可能会残留一些玻璃体凝胶。在捕获组织之前，尝试使用镊子将其分离。这是另一个含有大量玻璃体凝胶的样本。用镊子将其轻轻提起并分离，随后取出视网膜。一旦视网膜被移除，便留下视网膜色素上皮层-脉络膜。我们使用相同的镊子夹住该色素组织的边缘，并小心地将其从巩膜上分离。该组织代表黄斑中心凹下方的视网膜色素上皮层-脉络膜。此处为黄斑区下方的视网膜色素上皮层-脉络膜环状组织。左手使用第二种器械有助于操作该组织。与视网膜类似，RPE-脉络膜复合体也与巩膜盘紧密贴合，此时仍可使用Westcott剪刀将该组织从眼球上分离。使用12号蜂鸟镊子剥离周边穿孔区域的RPE-脉络膜组织。如果穿孔活检刀不够锋利，或施加的压力不足，则可能无法在组织周围形成整齐的切口。在这些情况下，应尽可能将组织拉开，然后使用韦斯特科特剪刀进行修剪和分离。组织样本经胰蛋白酶消化后，采用一维 STS 凝胶电泳分析以观察蛋白质含量。该分析结果表明，视网膜不同取样区域之间存在明显的蛋白质差异。后续实验采用液相色谱串联质谱法，成功鉴定了视紫红质中的肽段，视紫红质是一种高度丰富且独特的视网膜蛋白。图B展示了从黄斑区获得的代表性视紫红质质谱图。对蛋白质成分的进一步分析将有助于揭示视网膜不同解剖区域的分子功能。视网膜和视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜是复杂的组织，其在不同区域的蛋白质表达和病理易感性方面表现出重要的区域性差异。本文介绍了从视网膜不同区域可靠获取组织样本用于蛋白质组学分析的新方法。该技术的重要考虑因素包括采集后对样本的正确处理、处置和储存。组织取材的尸后时间安排，需考虑使用不同皮肤尺寸的环钻活检工具，以调整所获取组织的数量和区域特异性程度。在组织采集过程中，可考虑使用解剖显微镜或放大镜等视觉辅助工具，尤其适用于眼球尺寸较小的情况。

dissection-of-human-retina-and-rpe-choroid-for-proteomic-analysis

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Biochemistry

生物化学

人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。...

斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。...

研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

本视频展示了一种在死后眼球中有效区分和解剖人玻璃体各种半透明结构的技术。...

人眼玻璃体组织成分的分离以进行蛋白质组学分析

小鼠眼球解剖的正式演示，最终获得视网膜色素上皮的完整铺片。...

小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

该解剖技术展示了从小鼠眼球中摘除玻璃体、视网膜和晶状体，通过离心法进行分离，并利用蛋白质检测进行表征。...

小鼠玻璃体和视网膜的摘除用于蛋白质组学分析

本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol...

发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

本方案介绍了两种用于分离小鼠视杆光感受器亚细胞区室以进行蛋白质分析的技术。第一种方法利用活体视网膜和纤维素滤纸分离视杆外节，而第二种方法则采用冻干视网膜和粘性胶带剥离视杆内节与外节层。...

小鼠视网膜感光细胞区室分离的两种剥离方法及其蛋白质分析

我们介绍一种高效分离人眼视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的方法，并制备完整的RPE/脉络膜铺片，用于对RPE进行组织学和形态计量学分析。...

高效且一致地从人眼生成用于组织学分析的视网膜色素上皮/脉络膜平铺标本

小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。...

评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

本研究介绍了一种替代性的视网膜平铺制备方法，通过去除感光细胞胞体，可加快抗体扩散速度，并改善对内层视网膜神经元进行免疫组织化学染色时的膜片钳电极接触条件。 原位 杂交和电生理实验。...

改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

学习人视网膜解剖与RPE-脉络膜蛋白质组分析技术，使用四毫米活检工具从黄斑、中央凹及周边视网膜采集组织样本。该方法为神经科学与眼科学研究提供精确的分子分析手段。

人视网膜及视网膜色素上皮-脉络膜组织的解剖用于蛋白质组学分析

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