Name: 用细胞色素 P450s 检测亚硝胺的体外Nitrosamide 形成的一般方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解细胞色素P450酶体外氧化亚硝胺生成亚硝酰胺的代谢检测方法。该技术利用高灵敏度质谱仪，为毒理学和癌症研究中的DNA烷基化风险评估提供新工具。

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本研究由美国国家癌症研究所资助，项目编号为 CA-81301。我们感谢 Bob Carlson 提供的编辑协助，感谢 Peter Villalta 博士和 Xun Ming 在马森癌症中心分析生物化学共享资源平台提供的质谱分析技术支持，同时感谢 Adam T. Zarth 博士和 Anna K. Michel 博士提出的宝贵讨论与建议。分析生物化学共享资源平台部分由美国国家癌症研究所癌症中心支持基金 CA-77598 资助。

1. 材料与常规操作步骤
<ol>
	<li>按照先前所述方法合成NNN15。从商业来源获取试剂级的去可替宁、P450 2A6 Baculosomes、NADPH再生系统、0.5x&#160;反应缓冲液及其他所有化学品或溶剂。</li>
	<li>在500 MHz波谱仪上记录核磁共振（NMR）谱图。化学位移以百万分之一（ppm）表示。使用残留溶剂峰作为内标：1H-NMR（CDCl3，7.26 ppm）和13C-NMR（CDCl3，77.2 ppm）。 
	注：峰裂分使用以下缩写：s = 单峰，d = 双峰，dd = 双二重峰，dt = 双三重峰，dq = 双四重峰，ddd = 双二重二重峰，m = 多重峰。</li>
	<li>对选定化合物在LTQ Orbitrap Velos上进行高分辨质谱（HRMS）分析，并以m/z形式报告数据。</li>
	<li>使用预涂硅胶聚酰胺薄层色谱板（40 mm × 80 mm，厚度0.2 mm），含254 nm荧光指示剂，进行薄层色谱（TLC）分析。通过紫外灯照射显色TLC板。</li>
	<li>使用60 Å、70–150目硅胶，在1.5 cm × 15 cm玻璃柱上进行快速柱色谱分离。</li>
</ol>
2. 亚硝胺阳性对照物的制备（N′-亚硝基降烟碱，NNC）
<ol>
	<li>干燥一个含有磁力搅拌子的25 mL圆底烧瓶，将其置于烘箱中过夜（16小时，约140 °C）。次日早晨，在N₂气流下冷却烧瓶2 同时使用油封鼓泡器以保持氮气环境2 每秒一个气泡以下的流速。 
	注意：冷却后，无需采取特别措施在氮气氛围下保存烧瓶。2 是必需的。</li>
	<li>在通风橱中，向已冷却的烧瓶中加入去可替宁（31.8 mg，0.196 mmol）、乙酸酐（5 mL）和乙酸（1 mL）。用冰水浴将混合物冷却至 0 °C，并持续搅拌。 
	注意： 乙酸酐和乙酸具有腐蚀性。</li>
	<li>加入 NaNO2 (33.3 mg, 0.483 mmol) 一次性加入，持续搅拌反应混合物 2.5 小时。通过薄层色谱（TLC，100% 乙酸乙酯，Rf = 0.19，参见步骤 1.4。 
	注意：在此期间，混合物将逐渐变为黄色，并偶尔出现气泡。</li>
	<li>通过将混合物倒入冰浴中的 H 中来终止反应2O (18 mL)。立即用18 mL的CH2Cl2 在100 mL分液漏斗中。用CH至少再萃取水相2次2Cl2 （每份9 mL）</li>
	<li>用约100 mg的MgSO₄干燥合并的有机相4 2分钟。通过旋转蒸发过滤并浓缩溶液，得到一种粗制的黄色油状物。蒸发过程中将水浴加热至30 °C，以除去残留的乙酸。 
	注意：如果化合物溶解于 CH2Cl2 并将溶液置于2 - 8 °C避光保存。</li>
	<li>使用硅胶作为固定相，100% 乙酸乙酯作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化粗产物（参见步骤 1.5）16. 
	注意： NNC 及相关亚硝胺类化合物应谨慎操作，因其被认为具有人体致癌性。</li>
	<li>将纯化合物溶解于CDCl₃中3 并使用核磁共振（见步骤1.2）确认该溶液的结构并测定其摩尔浓度17将该溶液避光保存于 2 - 8 °C，直至使用。 
	注意：该溶液将用作阳性对照 体外 检测（步骤3.5）。核磁共振谱图和化学位移数据见支持信息。</li>
	<li>使用纯NNC溶液，在高分辨率质谱仪（HRMS）上通过直接进样，按照步骤1.3和4.3中所述参数确认准确的母离子质量，并测定产物离子质量。 
	注意：将使用产物质量来检测该化合物 体外 代谢检测（步骤 4.3）。</li>
</ol>
3. 一个亚硝胺-P450的例子 体外 孵育
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出 P450 2A6 Baculosomes、Vivid-NADPH-再生系统和 10 mM NADP+ 储存液，置于冰上解冻。解冻后，将 Baculosomes 和 NADPH-再生系统分别按 1:10 和 1:50 的比例用 0.5X 反应缓冲液稀释至同一个 1 mL 离心管中。同样，将 3 μL 的 NADP+ 储存液加入 97 μL 的 0.5X 反应缓冲液中。 
	注意：NADP+ 对光敏感，应将其容器用铝箔包裹以避光保存。酶溶液对冻融循环敏感，冻融次数不得超过两次。根据需要分装储存，以备后续实验使用。</li>
	<li>对于每次孵育，在含有 40 μL 用反应缓冲液配制的 4 μM NNN 溶液的 1 mL 离心管中加入 50 μL 酶溶液（含 5 pmol P450）。将该混合液在 37 °C 水浴中预孵育 2 分钟，然后加入 10 μL 稀释后的 NADP+ 溶液。将完整反应体系在 37 °C 下孵育 1 至 30 分钟。 
	注意：采用 5 分钟间隔的孵育时间（例如 5、10、15 分钟等），可获得充分的亚硝胺生成时间进程数据。</li>
	<li>在设定的孵育时间结束后，首先加入 10 μL 3.0 N ZnSO4，然后加入 10 μL 3.0 N Ba(OH)2 进行淬灭。涡旋震荡该溶液，将形成白色沉淀。在 8000 × g 条件下离心 4 分钟，使沉淀成团。 
	注意：此步骤不可暂停，因为生成的亚硝胺在水溶液中稳定性有限，长时间停顿可能导致假阴性结果。</li>
	<li>立即用移液器吸取上清液，并取 2 μL 进行液相色谱正离子纳米电喷雾电离高分辨串联质谱分析（LC-NSI+-HRMS/MS，见步骤 4.1–4.3）。</li>
	<li>对于阳性对照孵育，将含有 100 fmol 合成 NNC 溶液的等分试样在 N2 气流下蒸发至 1 mL 离心管中。向该管中加入步骤 3.2 中的完整酶反应体系，并按步骤 3.3–3.4 所述操作进行。</li>
	<li>对于阴性对照孵育，按照上述实验步骤（步骤 3.2–3.4）操作，但将 50 μL 酶溶液替换为 0.5X 反应缓冲液。</li>
</ol>
4. 液相色谱-负离子化学电离法检测亚硝胺的示例参数+-HRMS/MS
<ol>
	<li>对于液相色谱组分，在步骤4.2中，将以下多步梯度应用于配备商用手工填充C18（5 μm）、100 mm × 75 μm、15 μm 孔径毛细管柱的超高效液相色谱系统18。</li>
	<li>以5 mM NH4OAc作为流动相A，乙腈（MeCN）作为流动相B，将样品在0–5 min内以5% B、流速1 μL/min上样至色谱柱，随后将流速降低至0.3 μL/min。接着，在4 min内将B相从5%梯度升至20%，再在10 min内升至55% B，最后重新平衡至5% B。</li>
	<li>在LTQ Orbitrap系统上进行液相色谱-纳升电喷雾电离正离子模式-高分辨串联质谱（LC-NSI+-HRMS/MS）分析。通过全扫描和二级质谱（MS2）碎裂监测NNC。全扫描分辨率为60,000，在5 ppm质量偏差范围内提取精确母离子质量（192.07670）。采用MS2碎裂，隔离母离子（2.0 amu），通过碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，碰撞能量为25 eV，分辨率为15,000，扫描时间为30 ms。在5 ppm质量偏差范围内提取NNC产物离子的精确质量（m/z 192 → m/z 134.04739 和 162.07874）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

阐明亚硝胺的代谢过程是理解其致癌性的一个关键环节。由于参与代谢的细胞色素P450酶及其他代谢酶具有多态性，进一步应用这一知识可能有助于识别高风险个体。1,4新的数据表明，α-羟基亚硝胺（被认为是参与DNA结合的亚硝胺主要代谢产物）可进一步氧化为亚硝酰胺，但这一过程尚未在多种底物中得到充分验证。我们已描述了一种用于测定亚硝胺向亚硝酰胺进行连续氧化程度的实验方案。 体外该方法的广泛应用将有助于确定此代谢途径的整体重要性。
该方法首先为感兴趣的亚硝基酰胺制备标准品。在本示例研究中，目标物为NNC，即烟草致癌物NNN的一种假设代谢产物，而NNN是一种存在于烟草制品中的致癌物14,22。如所述，去可替宁的亚硝化反应顺利进行，未观察到明显的副产物。粗产物仅被起始酰胺和乙酸污染，可通过柱层析轻松去除。随后通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRM...

N亚硝胺是一类在饮食、烟草制品及一般环境中存在的致癌物；它们也可在人体内源性形成。1. 超过 300 N-亚硝基化合物已被测试并 &gt;90% 在动物模型中被评估为具有致癌性2,3为了表现出其致癌性，这些化合物必须首先由细胞色素P450酶进行活化。1,2,3研究表明，细胞色素P450可高效地将亚硝胺氧化为α-羟基亚硝胺（图1），这些化合物具有高度反应活性，半衰期约为5秒，随后会自发分解为烷基重氮羟基化合物。后者在失去H后可对DNA进行烷基化修饰2O 和 N2若未被修复，所形成的DNA加合物可引发突变；若突变发生于关键的癌基因或肿瘤抑制基因，则可能导致癌症发生。1因此，人们投入了大量努力以全面了解细胞色素P450氧化致癌性亚硝胺所产生的代谢途径、DNA加合物及下游代谢产物。这些知识在个体癌症风险评估中具有潜在应用价值4.
<img alt="化学反应图解，亚硝胺与DNA结合，P450酶，亚硝酰胺，DNA加合物形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：亚硝胺的一般代谢及本研究提出的代谢途径。 
亚硝胺（1）被P450酶氧化为α-羟基亚硝胺（2），后者可自发分解为烷基重氮羟化物（3）。这些化合物可与DNA结合，形成DNA加合物。据推测，2可进一步被P450酶氧化为亚硝酰胺（4）。这些亚硝酰胺可直接与DNA结合形成新型DNA加合物，或经水解生成3，进而形成已知的DNA加合物。R1和R2代表任意烷基。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管α-羟基亚硝胺假说得到了大量数据的有力支持，但仍存在一些不一致之处；其中主要问题之一是α-羟基亚硝胺的半衰期极短5,6。已知这些化合物在内质网膜上生成，随后对细胞核DNA进行烷基化。鉴于其寿命仅有数秒，这些中间体如何在穿越细胞质的过程中存活并完成必要转运仍令人困惑。一种假说是，部分α-羟基亚硝胺在细胞色素P450活性位点中被保留，并连续氧化为亚硝酰胺7,8，而后者相对更为稳定9。这种氧化过程此前已在尼古丁10、醇类11以及简单的烷基亚硝胺12,13中观察到先例。此外，亚硝酰胺属于直接作用的致癌物2,3。根据其反应活性9，这些化合物被认为可形成与α-羟基亚硝胺完全相同的DNA加合物，同时还会产生新的、尚未被深入研究的DNA加合物（图1）。因此，该假说不仅解释了中间体在细胞质中的转运机制，也阐明了DNA损伤产物的形成过程。
本文介绍了一种评估的通用方案 体外 细胞色素P450介导的亚硝胺转化为亚硝酰胺的过程被描述。此前报道的亚硝胺转化过程 N′-N-亚硝基降烟碱（NNN）至 N′细胞色素P450 2A6催化亚硝基降烟碱（NNC）的反应被用作示例14将本方案应用于多种底物-酶体系，将有助于确定亚硝胺类化合物在整体亚硝胺代谢中的重要性。

<table><tbody><tr><td>去可替宁</td><td>AKoS GmbH (Steinen, Germany)</td><td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431311</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433373</td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ViVid CYP2A6 Blue 筛选试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>PV6140</td><td></td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 圆底烧瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z510424</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 锥形瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4980125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 分液漏斗</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z261017</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 圆底烧瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>500 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-22R 离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液相色谱小瓶</td><td>ChromTech</td><td>CTC&amp;ndash;0957&amp;ndash;BOND</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z127035</td><td></td></tr><tr><td>核磁管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274682</td><td></td></tr><tr><td>P1000、P200 和 P10 移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z691410</td><td></td></tr><tr><td>RSLCnano 超高效液相色谱系统</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振荡水浴锅</td><td>Fisher</td><td>FSSWB15</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit 色谱柱</td><td>New Objective</td><td>PF3607515N5</td><td></td></tr><tr><td>Luna C18, 5 µm</td><td>Phenomenex</td><td>535913-1</td><td></td></tr></tbody></table>

一种检测亚硝基酰胺形成的通用方法 体外 细胞色素p450对亚硝胺的代谢

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N亚硝胺是一类明确的环境致癌物，需经细胞色素P450氧化后方可发挥活性。其公认的代谢活化机制涉及生成α-羟基亚硝胺，后者可自发分解为DNA烷基化试剂。DNA损伤的累积及其引发的突变最终可能导致癌症。最新证据表明，α-羟基亚硝胺可进一步由细胞色素P450连续氧化生成亚硝酰胺。由于亚硝酰胺通常比α-羟基亚硝胺更稳定，且同样具有DNA烷基化能力，因此可能在致癌过程中发挥作用。本报告中，我们描述了一种评估由亚硝胺生成亚硝酰胺的通用实验方案 体外 细胞色素P450催化的亚硝胺代谢。本方案采用了一种通用方法合成相关的亚硝酰胺以及 体外 使用液相色谱-纳米喷雾电离-高分辨串联质谱法检测细胞色素P450代谢活性。该方法可检测 N′作为可替宁的次要代谢产物的亚硝基可替宁 N′在示例研究中检测了N-亚硝基降烟碱（nitrosonornicotine）。该方法由于采用精确质量检测，具有高灵敏度和选择性。将该方法应用于多种亚硝胺-细胞色素P450体系，将有助于确定该转化反应的普遍性。由于细胞色素P450具有多态性且活性存在差异，深入理解亚硝胺类物质的形成机制可为个体癌症风险评估提供支持。

根据 White 的研究 等.19，去甲可替宁被亚硝化为NNC，反应干净且产率高（80 - 92%），用于制备标准品 体外 实验。通过光谱分析获得了反应成功的结构证据，包括 1氢核磁共振（H-NMR）， 13C-NMR、COSY 和 HSQC（支持信息）以及 HRMS，后者确认了母体质荷比 [M + H]+ 理论值的5 ppm范围内（图2）。MS2 通过NNC的碎裂来确定最丰富的产物离子质量。所确定的精确母离子质量和产物离子质量被用于LC-NSI+-HRMS/MS 方法 体外 检测。若在2 - 8℃避光保存 8 °C，NNC 溶液至少可稳定保存 3 个月。由于该反应具有广泛的适用性，因此可用于任何二级酰胺。
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细胞色素P450对致癌性亚硝胺的α-羟基化是公认的代谢途径，可产生导致DNA损伤并引发突变的中间产物。然而，新数据表明可进一步氧化生成亚硝酰胺。本文描述了一种检测由亚硝胺生成的亚硝酰胺的通用方法 体外 细胞色素P450催化的亚硝胺代谢

一种检测亚硝基酰胺形成的通用方法 体外 细胞色素P450对亚硝胺的代谢

N-亚硝胺是一类明确的环境致癌物，需经细胞色素P450氧化后方可发挥活性。目前公认的……

本方法学的总体目标是确定细胞色素P450酶是否可在体外连续氧化N-亚硝胺生成N-亚硝酰胺。该方法通过评估N-亚硝胺是否被直接代谢为N-亚硝酰胺，从而为毒理学领域提供重要信息。由于N-亚硝酰胺在烷基化DNA过程中相对稳定，可能在致癌过程中发挥作用。该技术的主要优势在于使用了一台高灵敏度的质谱仪，其检测限低于以往类似体外亚硝胺代谢测定所达到的水平。开始此操作时，将一个含有磁力搅拌子的25毫升圆底烧瓶放入烘箱中，在140摄氏度下干燥16小时。此后，将烧瓶转移至通风橱中，并在氮气流下冷却。向烧瓶中加入 31.8 毫克去可替宁、5 毫升乙酸酐和 1 毫升乙酸，然后开始搅拌。将烧瓶转移至冰水浴中。加入33.3毫克亚硝酸钠。继续搅拌2.5小时，然后将反应液倒入18毫升冰水中以终止反应。立即将溶液转移至含有18毫升二氯甲烷（DCM）的分液漏斗中，并萃取水相。用9毫升二氯甲烷（DCM）分别再萃取水相两次。随后将合并的有机相在100毫克无水硫酸镁上干燥2分钟。过滤后，使用旋转蒸发仪在30°C下浓缩溶液，得到粗制的黄色油状物。按照文本方案所述，使用柱层析法纯化粗产物。随后，将纯化后的化合物溶解于1毫升氘代氯仿中。按照文本方案所述，利用核磁共振（NMR）确认该溶液的结构及摩尔浓度。将此溶液避光保存于 2 至 8 摄氏度的环境中，直至使用。然后按照文本方案所述，通过高分辨质谱仪直接进样，确认纯 NNC 溶液的准确母离子质量，并测定其产物离子质量。首先，从 -80 摄氏度冰箱中取出所需试剂，在冰上解冻。解冻后，取0.5倍浓度的反应缓冲液，分别将杆状体在NADPH再生系统中按1-10和1-50的比例稀释，置于1毫升离心管中。然后，在含有97微升0.5倍浓度反应缓冲液的1毫升离心管中加入3微升NADP储备溶液。对于每次孵育，准备一个1毫升离心管，加入40微升用反应缓冲液配制的4微摩尔NNN溶液。向每支试管中加入含有5皮摩尔P450 2A6的50微升酶溶液。在37摄氏度水浴中预孵育2分钟。然后向每支试管中加入10微升稀释的NADP+溶液。在37摄氏度下孵育1至30分钟。孵育结束后，先加入10 µL 3.0 N硫酸锌，然后加入10 µL 3.0 N氢氧化钡以终止反应。涡旋混合溶液，形成白色沉淀。接下来，在8,000 ×g条件下离心4分钟。立即收集上清液，并取2 µL通过液相色谱-正离子纳米电喷雾电离高分辨串联质谱法进行分析。在本研究中，去甲可替宁被亚硝化为NNC，反应干净且产率高，可制备用于体外实验的标准品。通过光谱分析验证反应的成功，包括高分辨串联质谱分析，结果证实母离子质量与理论值的偏差在百万分之五以内。随后利用 NNC 的串联质谱碎裂来确定最丰富的产物离子质量。如图所示，两个最丰富的产物离子分别为 134 和 162，其精确质量测定可达小数点后五位。合成的NNC随后用作体外P450代谢测

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用细胞色素 P450s 检测亚硝胺的体外Nitrosamide 形成的一般方法

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Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

了解细胞色素P450酶体外氧化亚硝胺生成亚硝酰胺的代谢检测方法。该技术利用高灵敏度质谱仪，为毒理学和癌症研究中的DNA烷基化风险评估提供新工具。

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