一种检测亚硝基酰胺形成的通用方法 体外 细胞色素P450对亚硝胺的代谢

本方法学的总体目标是确定细胞色素P450酶是否可在体外连续氧化N-亚硝胺生成N-亚硝酰胺。该方法通过评估N-亚硝胺是否被直接代谢为N-亚硝酰胺，从而为毒理学领域提供重要信息。由于N-亚硝酰胺在烷基化DNA过程中相对稳定，可能在致癌过程中发挥作用。

该技术的主要优势在于使用了一台高灵敏度的质谱仪，其检测限低于以往类似体外亚硝胺代谢测定所达到的水平。开始此操作时，将一个含有磁力搅拌子的25毫升圆底烧瓶放入烘箱中，在140摄氏度下干燥16小时。

此后，将烧瓶转移至通风橱中，并在氮气流下冷却。向烧瓶中加入 31.8 毫克去可替宁、5 毫升乙酸酐和 1 毫升乙酸，然后开始搅拌。将烧瓶转移至冰水浴中。

加入33.3毫克亚硝酸钠。继续搅拌2.5小时，然后将反应液倒入18毫升冰水中以终止反应。立即将溶液转移至含有18毫升二氯甲烷（DCM）的分液漏斗中，并萃取水相。

用9毫升二氯甲烷（DCM）分别再萃取水相两次。随后将合并的有机相在100毫克无水硫酸镁上干燥2分钟。过滤后，使用旋转蒸发仪在30°C下浓缩溶液，得到粗制的黄色油状物。

按照文本方案所述，使用柱层析法纯化粗产物。随后，将纯化后的化合物溶解于1毫升氘代氯仿中。按照文本方案所述，利用核磁共振（NMR）确认该溶液的结构及摩尔浓度。

将此溶液避光保存于 2 至 8 摄氏度的环境中，直至使用。然后按照文本方案所述，通过高分辨质谱仪直接进样，确认纯 NNC 溶液的准确母离子质量，并测定其产物离子质量。首先，从 -80 摄氏度冰箱中取出所需试剂，在冰上解冻。

解冻后，取0.5倍浓度的反应缓冲液，分别将杆状体在NADPH再生系统中按1-10和1-50的比例稀释，置于1毫升离心管中。然后，在含有97微升0.5倍浓度反应缓冲液的1毫升离心管中加入3微升NADP储备溶液。对于每次孵育，准备一个1毫升离心管，加入40微升用反应缓冲液配制的4微摩尔NNN溶液。

向每支试管中加入含有5皮摩尔P450 2A6的50微升酶溶液。在37摄氏度水浴中预孵育2分钟。然后向每支试管中加入10微升稀释的NADP+溶液。

在37摄氏度下孵育1至30分钟。孵育结束后，先加入10 µL 3.0 N硫酸锌，然后加入10 µL 3.0 N氢氧化钡以终止反应。涡旋混合溶液，形成白色沉淀。

接下来，在8,000 ×g条件下离心4分钟。立即收集上清液，并取2 µL通过液相色谱-正离子纳米电喷雾电离高分辨串联质谱法进行分析。在本研究中，去甲可替宁被亚硝化为NNC，反应干净且产率高，可制备用于体外实验的标准品。

通过光谱分析验证反应的成功，包括高分辨串联质谱分析，结果证实母离子质量与理论值的偏差在百万分之五以内。随后利用 NNC 的串联质谱碎裂来确定最丰富的产物离子质量。如图所示，两个最丰富的产物离子分别为 134 和 162，其精确质量测定可达小数点后五位。

合成的NNC随后用作体外P450代谢测定的标准品。在所用条件下，合成的NNC在约17.5分钟时洗脱，在母离子和产物离子通道中均呈现出分离良好的峰。与阳性对照一致，在1分钟、5分钟和10分钟的孵育中均观察到NNC的生成。

如果操作得当，亚硝胺合成及光谱分析可在大约六小时内完成。同样，包含多次孵育的体外实验不应超过八小时。该技术的应用意义在于烟草相关癌症的风险评估，因为亚硝胺相关生物标志物的检测结果可反映个体对亚硝胺的活化能力。

在进行该实验操作时，需注意快速处理酶孵育步骤。在这些条件下，亚硝胺类化合物会发生水解，因此在质谱分析前不应放置过久。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备亚硝胺标准品，并能够评估在适当的亚硝胺细胞色素P450体系中是否在体外生成了亚硝胺类化合物。

请注意，操作NNN、NNC或相关致癌物可能存在危险。这些化合物必须始终在通风橱中操作，并穿戴实验服、护目镜和手套。此外，所有致癌性废弃物都应妥善储存并明确标识。