Name: 口腔生物膜取样在健康儿童中的微生物分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习使用标准化纸尖采样法从健康儿童龈下沟、口腔黏膜及唾液中采集生物膜样本，用于口腔微生物组分析。该方法可提高儿童口腔微生物研究的数据可靠性，促进跨学科合作。

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作者感谢格拉茨医科大学医学研究中心的 Joachim Theussl 在视频制作过程中提供的出色技术支持，以及格拉茨医科大学研究管理部的 Monica Farrell 担任配音演员。

本方案及视频拍摄已获得格拉茨医科大学伦理审查委员会批准（Votum 27-126ex14/15）。已获得儿童及其家长对该视频发表的书面知情同意。
1. 仪器和材料
<ol>
	<li>将通常用于根管治疗的已校准（ISO 015/02）且无菌的纸尖在第一个环形标记处剪断，以标准化其长度（图1）。</li>
	<li>对纸尖进行260 nm紫外线照射30分钟，以避免DNA和RNA污染（图2）。</li>
	<li>将储存用试管在120 °C、1.2 bar条件下高压灭菌20分钟，并同时进行紫外线照射，或使用预先经γ射线辐照灭菌的试管。</li>
</ol>
2. 受试者的准备
注意：在入组前，已从儿童及其家长处获得书面知情同意。
<ol>
	<li>将可可脂涂抹于嘴唇。</li>
	<li>安装颊部和舌部牵开器，以充分暴露上下牙弓。</li>
	<li>使用菌斑显示剂染色牙菌斑。</li>
	<li>移除隔湿装置。</li>
	<li>用水漱口，直至漱口水变为无色。</li>
	<li>使用电动牙刷以45°角彻底刷牙。仅使用水，不使用牙膏，以免改变口腔生物膜。</li>
	<li>再次安装隔湿装置，包括舌挡，以保持口腔开放和干燥状态。</li>
	<li>用无菌棉签清洁并干燥指数牙，以避免在纸尖取样过程中吸收龈上液体。</li>
</ol>
3. 生物膜取样
<ol>
	<li>龈下沟纸尖取样
	<ol>
		<li>用无菌牙科镊子夹住纸片的尖端。</li>
		<li>将纸尖以切线方向插入，深度不超过4 mm。操作时需特别注意避免损伤结合上皮。图3).</li>
		<li>20 秒后移除纸条。</li>
		<li>将纸尖直接收集到已准备好的试管中：将纸尖末端放入无菌且无DNA的离心管中，并在第三个刻度处剪断，使其长度标准化为4 mm图4).</li>
		<li>如果研究方案中有要求，在同一位置平行且同时插入两根纸尖（图 5A).</li>
		<li>或者，如果研究方案有要求，可从多个位点收集纸尖样本 &#34;混合样本&#34; (图5B).</li>
		<li>移除用于黏膜和唾液采样的干场装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>黏膜纸点取样
	<ol>
		<li>将试纸条贴附于上颊部的前庭皱襞处（图6).</li>
		<li>闭合脸颊并轻轻按摩片刻。</li>
		<li>打开颊部，20秒后取出纸尖。</li>
		<li>在第三个标记处剪断纸尖，并按龈下取样所示将其放入无菌管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>唾液采样
	<ol>
		<li>让孩子将未刺激的唾液吐入无菌采集容器中（图7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 转移与储存
<ol>
	<li>根据研究设计，采集单个、混合或平行的纸尖样本（图8）。</li>
	<li>采用颜色编码的存储系统，以方便后续样本管理（图9）。</li>
	<li>最后，将样本储存于−80 °C，待进行微生物组分析。</li>
</ol>

<ol><li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li>
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</ol>

作者声明本科学视频制作无相关利益冲突。

口腔内的所有部位均存在细菌24,25,26。许多研究聚焦于使用唾液作为取样介质来绘制口腔定植图谱，因为唾液可通过吐唾方式轻松采集27,28,29,30,31,32。然而，唾液生物膜并不能反映龈下生物膜的组成。因此，采用其他取样方法对于构建完整的口腔微生物图景至关重要，并将推动牙科研究领域的新讨论。已有若干研究比较了刮治器与纸尖在牙周病患者龈下取样中的应用8,33,34。然而，目前尚无研究团队专注于标准化取样装置在不同年龄组人群中的应用，尤其是儿童群体19。
本视频展示了对健康儿童口腔中三个生境的口腔生物膜采样方法。
修改与故障排除：
本论文旨在介绍针对健康儿童龈下生物膜采样的临床操作规范。所采用的方法适用于结构完整的龈下龈沟，由于空间有限，此类部位的采样尤为困难。本视频中，该方法应用于早期恒牙列，但同样可适用于混合牙列或成熟牙列，以及儿童和/或成人。我们的采样方法具有可调整性，可采集单个样本或混合样本。后者可能在分子学分析中具有关键意义，因为从健康龈下龈沟中可采集到的DNA量通常较少。指数牙的选择可根据实际情况进行调整；特别是当牙龈上皮受到创伤并出血时，纸尖无法有效使用，此时可选择其他牙齿作为替代采样位点。在同一采样位点同时使用两根纸尖进行平行采样，可一步获得样本重复，同时缩短儿童患者的椅旁操作时间。
经过轻微修改后，也可采集病变牙周袋样本。此处需将纸尖插入牙周袋的全长，深度可达10 mm。纸尖的长度和锥度以及插入深度应根据目标口腔生境进行调整，但材料和尺寸必须保持标准化。也可使用纸尖从黏膜处采集样本。采用相同的实验方案可实现不同口腔生境及各类牙科材料之间的比较。患者准备和样本储存可按照本视频所述方法进行。对于宏转录组研究，可采用相同方法采集RNA。因此，采样后应立即将纸尖插入RNA稳定保存液中。
该技术的局限性：
无论进行何种改进，我们所描述的临床取样方法仅限于健康的龈下沟。其他取样部位，例如牙周病损的牙周袋，并未纳入本研究设计。由于需要采集此类牙周袋的全深度样本，纸尖可能尺寸不足，无法充分收集样本。如果实验目的是比较从健康龈下沟和牙周病损牙周袋获取的数据，则必须意识到不同临床取样方法所固有的偏倚。因此，不建议对这类数据进行直接比较。
本方法的一个局限性在于采样后未使用叠氮单丙啶（propidium monoazide）。在采样后立即加入该试剂，可实现仅对生物膜中活细胞进行特异性分析。本文所述的采样方法反映的是活细胞与死细胞的总数。对于重度牙周炎的研究，可能需要以刮治器取代纸尖，因为深牙周袋内的生物膜形成较为牢固。在此类情况下，纸尖采样可能无法反映完整的微生物谱系，因其表面可能过快达到饱和状态。
相对于现有方法的意义：
本论文是首篇采用纸尖法对健康龈沟进行龈下取样标准化的研究。以往的文献曾提及使用金属刮治器35,36或纸尖37,38,39进行取样，但未详细描述取样前的操作步骤，例如菌斑控制、牙齿清洁、牙齿隔离和干燥处理，也未说明因取样技术及时间点规定不明确而可能导致的操作偏差。
在之前的两篇文章中，我们证明了使用纸尖是一种在儿童中可重复进行龈下生物膜取样的方法22,40。由于设计原因，刮治器对于空间有限的浅龈沟而言过大，且对娇嫩的结合上皮过于锋利。因此，在不损伤上皮组织的前提下进入龈下龈沟至关重要，从而避免因出血造成的偏倚。因此，该区域更推荐使用细长且温和的纸尖。纸尖可用于监测正畸治疗期间生物膜组成的变化21,41。其细长且柔韧的特性使其能够顺利插入固定正畸装置的各个部件之间，这是相较于刮治器等其他取样方法的一大优势。这种无创取样方式操作简便，并可实现微量DNA的采集。
未来应用：
在本视频中，我们展示了针对无疾病、早期恒牙列的取样方法。该方法也可应用于混合牙列或成熟牙列。通过适当调整，还可依据相同方案对患有牙周病的位点（如牙齿或种植体）以及其他因牙科材料形成的生态位进行取样。龋病研究可从这一标准化方案中获益，特别是根面龋的相关研究。我们取样视频最重要的启示在于：必须对操作流程进行标准化，以确保无论采用何种检测方法或检测指标，所得数据均具有可比性。未来的视频演示有望进一步推动临床取样领域的发展。
如视频所示获取的口腔生物膜可用于临床及科学研究。 体内 该方法是对现有技术的一个良好补充 体外 分子技术，例如荧光 原位 杂交与共聚焦激光扫描显微镜技术15下一代测序方法（如本研究展示的焦磷酸测序）应用于采集的生物膜样本，可实现对完整微生物群的分析。通过计算特定细菌物种的相对丰度，可用于辅助治疗决策，或用于不同患者之间及不同治疗方案之间的比较。结合我们先前描述的标准化测序流程与序列分析工作流程40，这种采样方法可实现序列分析至属水平。进一步 &#34;元&#34;宏转录组学或代谢组学研究&#160;根据本视频中介绍的采样方案，可以开展相关研究。
关键步骤：
避免污染是关键步骤：必须在非无菌的体内环境中使用无菌器械。转移过程需由经验丰富的检查者迅速而稳妥地从口腔移至实验台，以尽可能缩短受试者的椅旁时间。本方案中最关键的步骤是将纸尖无创地插入龈下沟。必须绝对避免破坏连接上皮或引起出血。此外，还需特别注意防止纸尖和储存管被外源性DNA或RNA污染。样本储存本身也是一个关键步骤。样本采集后应立即冷冻，最好在−80 °C条件下保存。这可以避免采样后细菌组成发生变化，从而导致测序结果失真。

人类口腔生物膜由一个广泛的微生物群落组成，其中大多数为共生菌和有益微生物1,2,3。这些微生物定植于口腔提供的各种生态位中4,5,6。不同生态位中的生物膜组成差异显著，其多样性与栖息环境本身相当。例如，唾液中的细菌谱与牙菌斑样本存在明显不同。在健康成年人的牙菌斑样本中，放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度超过20%，而在唾液中则低于7%。相比之下，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）在唾液中的数量则显著更高7。因此，为了全面了解口腔微生物群落，必须在口腔的不同部位进行采样。此外，地理与种族差异、年龄、性别以及其他多种因素也使得揭示生物膜形成及疾病发生的一般规律变得困难8,9。多年来，对引起牙周病和龋病的致病性生物膜的研究一直是该领域的核心关注点8,10,11,12,13。
近年来，对健康受试者的研究不仅对于更广泛地理解疾病具有重要意义，而且对于实施预防措施也至关重要14。新技术和分子分析手段进一步阐明了口腔生物膜的形成与功能15,16，并实现了对微生物多样性的全面表征17,18。这有望推动人们对正畸治疗期间微生物变化的全新认识19。同时，也可预见其将对正畸用生物材料的发展产生影响。更深入的研究视角将有助于阐明与生物膜相关的正畸治疗并发症，例如釉质脱矿和牙周疾病12,20,21。为了实现全球范围内的数据比较，标准化数据生成的每一个步骤至关重要。实验操作中的微小差异都可能显著影响研究结果。此外，在数据处理过程中使用不同的计算平台也可能导致数据集之间无法比较。最后，统计检验方法及校正方式的选择同样会影响结果。然而，采样偏差可能早在实验室操作或生物信息分析开始之前就已产生。非标准化的采样方法会导致研究本身存在固有偏差。鉴于当前相关研究的标准化程度较低或中等，关于正畸治疗与微生物组之间关系的证据仍然有限19。因此，建立标准化方法将有助于推动该领域内数据的高质量比较。
本文介绍了标准化的口腔生物膜采样流程。该方案旨在促进生成全球可比的微生物序列数据集。文中提供了一步一步的健康儿童口腔生物膜采样操作步骤。首选方法是将纸尖无创地插入健康的龈下龈沟内。为便于不同生境之间的比较，颊黏膜也按照相同的方案进行采样。本文还展示了平行采样与混合采样方法。此外，介绍了唾液采样的操作。同时提出了一种简单的颜色编码运输与储存系统，以方便样本的管理和后续处理。关于储存介质、宏基因组分析和生物信息学等下游操作的选择，取决于口腔研究不同领域所提出的临床问题。在本论文中，以正畸研究为例，选择了用于下一代测序（NGS）的DNA采样作为可能应用的示例。

<table><tbody><tr><td>纸尖锥度 .02，已灭菌</td><td>VDW Dental</td><td>550 029 015</td><td>http://www.vdw-dental.com/zh/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&amp;amp;cHash=&lt;br/&gt; 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td></tr><tr><td>GC 可可脂，10 克/管</td><td>GC EUROPE N.V.</td><td>000387</td><td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td></tr><tr><td>蓝染料</td><td>直接A型</td><td>隆德尔片</td><td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td></tr><tr><td>大湖诺拉干区系统</td><td>大湖正畸</td><td>300-401</td><td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td></tr><tr><td>牙刷</td><td>Oral-B</td><td></td><td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td></tr><tr><td>micro-Ident plus11</td><td>Hain Lifescience GmbH</td><td>23312</td><td>http://www.hain-lifescience.de/zh/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td></tr><tr><td>ParoCheck</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>460020</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td></tr><tr><td>卡佩根牙周诊断试剂盒</td><td>Carpegen GmbH</td><td></td><td>http://www.carpegen.de/zh/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td></tr><tr><td>试管 Reaktionsgefäße&amp;auml;&amp;szlig;e 1,5 ml</td><td>乳酸菌</td><td>CH77.1&amp;nbsp; 到 CH81.1</td><td>www.lactan</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Henry Schein</td><td>9003182</td><td>www.henryschein.at</td></tr></tbody></table>

健康儿童口腔生物膜取样用于微生物组分析

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

口腔生物膜及其分子分析为研究各类牙科科学问题和临床问题提供了基础。了解生物膜的组成有助于更深入地认识致龋和牙周致病机制。儿童时期口腔内发生的微生物变化之所以受到广泛关注，原因众多。儿童口腔微生物群的演替及其组成变化需要进一步分析，以期理解并可能预防疾病的发生。同时，也需要深入掌握口腔生物膜的自然组成。在恒牙列早期、无龋且牙龈健康的状态下，龈下环境受干扰较少，可作为研究口腔健康与疾病特征的in situ基线。因此，对儿童在不同生命阶段口腔生物膜的分析是该领域的重要研究方向。现代分子分析方法能够全面揭示此类生物膜的细菌多样性。为了实现微生物群数据的可比性，对分子数据生成流程中的每一步进行标准化至关重要。该流程涵盖临床取样、下一代测序（NGS）、生物信息学数据处理以及分类学解读。其中最关键的环节之一是生物膜取样。由于儿童龈下区域空间有限，取样尤为困难。因此，我们重点关注使用纸尖进行龈下取样。本文提供了一套针对儿童龈下沟、黏膜及唾液中口腔生物膜取样的详细操作方案。

在本出版物中，以高通量测序（NGS）的DNA取样为例，展示了其在正畸研究中可能的应用。细菌DNA直接从纸尖样本中提取，所获得的DNA可用于针对临床或科研问题的微生物组成研究（如图10所示）。
现代分子分析方法（如NGS方法454-焦磷酸测序）可提供样本中完整微生物群的概览。通过16S rRNA序列差异，可在不同系统发育水平上同时鉴定数千种细菌的DNA。需要建立生物信息学平台，以将从大量数据集中获取的信息归类成簇。随后可对微生物群数据集进行统计分析。
某些细菌物种的总体相对丰度可进行分析，也可分析由于生境条件变化引起的微生物群落的改变。柱状图（图11) 和热图（图12在门水平或目水平展示龈下细菌组成。可通过描述性统计和推断性统计对不同个体和治疗方式进行比较。 图13 展示了不同分类学水平下两种龈下纸点取样模式的直方图比较。 表1 显示生物膜组成在过程中的变化 体外 一项比较两个时间点（T1 和 T3）的研究。根据 454 焦磷酸测序数据，采用 Wilcoxon 符号秩检验计算具有统计学意义的变化，并进行 Bonferroni 校正。
最后，主坐标分析（PCoA）能够在不同样本中识别出的操作分类单元（OTU）水平上实现直接的三维比较。图14中的PCoA图展示了五名儿童病例系列中龈下微生物组的个体内和个体间差异。图15显示了一项正畸病例-对照研究的结果：粉红色至红色的点代表病例组，浅蓝色至深蓝色的点代表对照组，所有样本均在四个月期间内多次采集。正畸干预后病例组样本（红色点）明显聚集，表明微生物组发生了变化；而代表对照组的蓝色点则呈均匀分布。
<img alt="静态平衡；光学仪器校准；实验室中的镊子和细条。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：制备标准长度的纸尖。 将无菌校准纸尖在第一道环形刻度处剪断，以统一其长度。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在洁净工作台中，培养皿内的植物样品在紫外光下进行无菌培养。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2： 对纸尖进行灭菌并去除DNA污染。 标准化的纸尖在洁净工作台中进行灭菌并接受紫外照射。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="牙签清洁犬齿之间的牙间菌斑；口腔卫生，口腔健康，特写。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：龈下纸尖插入。 将无菌校准纸尖沿切线方向插入龈下龈沟，直至4 mm环形标记处，保持20秒。
<img alt="实验室样品制备，用无菌剪刀切割微量管，分子生物学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：将纸尖切割至管中。 采样后立即在纸尖的第三环标记处（4 mm）将其剪断，放入无菌且无DNA的1.5 mL离心管中。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="牙科正畸关闭牙缝过程；牙齿重新定位；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：汇集式与平行取样。将两个纸尖同时插入一颗牙齿的龈下沟内（A），或将多个纸尖分别插入多颗牙齿的龈下沟内（B）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="口腔内针灸穴位研究；探索下颌口腔组织上的针具以进行治疗效果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：黏膜取样。 将无菌校准的纸尖插入前庭皱襞的黏膜中。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用量杯口服药物剂量，展示精确的液体测量方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：唾液采集。 无刺激性唾液被吐入无菌烧杯中。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="牙弓示意图；样本采集方法：单样本、混合样本、平行样本（置于小瓶中），遗传分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8：采样方案。 样本可采集为单样本（左侧，每颗牙齿一个）、混合样本（多个至全部条带置于一个小瓶中）或平行样本（蓝色条带，同一颗牙齿使用两个纸尖）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样品识别的彩色编码微量管盒，带标签网格以便有序存放。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9： 彩色编码储存。 对板和小瓶采用对应的彩色编码，有助于后续样品处理。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="临床取样至DNA提取和测序流程图；所列测序方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：龈下生物膜分析。 临床生物膜取样（A）、DNA提取（B）及不同高通量测序技术（C）的示意图。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物分类组成；柱状图；分类群分布；厚壁菌门、变形菌门百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 11"> 
图 11：柱状图。 显示使用454焦磷酸测序技术在门水平分析的细菌相对丰度。图像改编自 Santigli et al.22 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物组成热图、细菌分布分析、相对丰度数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图12"> 
图12：热图。 显示使用454焦磷酸测序技术分析的细菌目级分类单元的相对丰度。深红色表示高相对丰度（> 10%）。深蓝色表示相应细菌目的相对丰度极低或无。图像改编自Santigli et al.22 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌多样性分析；柱状图显示模式A和B在门至属水平的数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图13"> 
图13：柱状图。 两种纸尖取样模式（模式A和模式B）在不同分类学水平上的比较。数据通过454焦磷酸测序生成。图片改编自Santigli 等22 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显示三个组分中数据变异模式的PCA图；统计分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图14"> 
图14：二维主坐标分析（PCoA）图。 一项病例系列研究（n=5），展示两种龈下取样方法导致的个体内和个体间差异（一种颜色代表一名受试者）。数据通过454焦磷酸测序获得。图片改编自Santigli et al.22 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示数据点分布和方差的三维主成分分析（PCA）图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图15"> 
图15：三维PCoA图动画的截图。 展示一项正畸病例对照研究中龈下微生物组的变化（n = 16；每组在三个时间点采样；病例组：粉红色至红色，对照组：浅蓝色至深蓝色）。数据通过454焦磷酸测序生成。来自Santigli工作小组的未发表数据。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">分类单元：Bacteriae</td>
			<td colspan="3">时间点 1 [%]</td>
			<td colspan="3">时间点 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Wilcoxon 符号秩检验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">门/属</td>
			<td>第25百分位</td>
			<td>中位数</td>
			<td>第75百分位</td>
			<td>第25百分位</td>
			<td>中位数</td>
			<td>第75百分位</td>
			<td>p 值</td>
			<td>p 值（经#校正）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">其他</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">其他</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1.07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">放线菌门</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">放线菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.30</td>
			<td>0.97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">罗氏菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">拟杆菌门</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">普雷沃氏菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.02</td>
			<td>2.44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">厚壁菌门</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">其他（芽孢杆菌纲）</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">葡萄球菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(孪生球菌科)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(乳杆菌目)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">颗粒链球菌属</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1.59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">乳杆菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">其他（链球菌科）</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(链球菌科)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">链球菌属</td>
			<td>53.42</td>
			<td>61.96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48.44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">其他（毛螺菌科）</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">戴阿利斯特菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">韦荣球菌属</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42.78</td>
			<td>6.69</td>
			<td>13.38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">变形菌门</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">嗜血杆菌属</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.31</td>
			<td>0.84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">#p 值 Wilcoxon 符号秩检验根据 Bonferroni 校正进行调整</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">p &lt; 0.0026 被认为具有显著性</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 统计分析。 健康儿童在两个时间点口腔微生物组的差异。数据由454焦磷酸测序生成。图片改编自Klug et al.23

儿童时期口腔微生物组的变化日益受到关注。不同微生物组研究之间的比较揭示了采样方案缺乏标准化。由于空间有限，对儿童健康的龈下沟进行采样具有挑战性。本文详细介绍了纸尖采样法作为该区域首选的采样方法。

口腔生物膜及其分子分析为研究各类牙科领域的科研与临床问题提供了基础。对生物膜组成成分的了解……

本实验的总体目标是为健康儿童口腔生物膜取样用于微生物组分析提供一种标准化方法。首先准备并灭菌所需器械和材料，随后对儿童进行生物膜取样的准备工作。然后从三个部位采集生物膜样本，分别是龈下沟、前庭皱襞的黏膜以及唾液。最后，系统地保存样本。最终将进行口腔微生物组分析，以回答临床和科学问题。您好，我是Elizabeth，是一名正畸医生。我的研究重点是正畸治疗过程中伴随的口腔微生物组变化。口腔生物膜的取样可能较为复杂。龈下沟的空间有限，尤其在儿童中更为明显。通过将我们的微生物组数据与全球研究进行比较，我们发现目前缺乏标准化的采样方案。通过本视频，我们迈出了填补这一空白的第一步。通常用于根管治疗的已校准且无菌的纸尖需在第一个环形标记处剪断，以标准化其长度。剪裁后，纸尖必须经过紫外线照射，以避免DNA和RNA污染。储存用的试管也将进行高压灭菌和紫外线照射。在采集生物膜样本之前，需要彻底清洁牙齿，首先涂抹可可脂。然后使用菌斑显示剂对牙齿进行染色。染色后，用清水漱口。使用电动牙刷和水正确刷牙。不使用牙膏，因为牙膏会改变口腔生物膜。使用颊部和舌部牵开器保持口腔张开和干燥。放置牵开器需要熟练且稳定的手法，以尽量减少儿童的不适，并使操作过程尽可能缩短。使用无菌牙科镊子，且采样部位在整个操作过程中保持不受影响。牙齿用无菌棉签清洁并干燥，以避免在纸尖采样期间吸收龈上液体。口腔内生物膜取样可采用多种方法。由于儿童龈下沟空间有限，通常首选纸尖取样法。将纸尖以切线方向插入，深度不超过四毫米，留置20秒。必须特别注意避免损伤结合上皮。然后将纸尖在第三个刻度处剪裁至标准长度四毫米。纸尖也可同时插入同一部位，或从多个部位采集的样本进行合并。移除干燥区域装置以进行黏膜和唾液取样。纸尖可采用相同方式用于采集前庭皱襞中的黏膜生物膜。通过吐出非刺激性唾液可收集唾液生物膜。根据研究设计，滤纸样本将被保存为单个样本、混合样本或平行样本。采用颜色编码的存储系统将有助于后续的样本管理。最后，样本将被储存在零下80摄氏度条件下，用于微生物组分析。目前已开发出多种商用试剂盒，用于快速、准确地鉴定牙周致病菌。将纸尖送至专业实验室后，可在三小时内完成DNA提取、制备和分析。该DNA还可用于微生物组研究。例如，新一代测序可获得完整的微生物组数据集。可分析特定细菌物种的总体相对丰度，也可分析因环境变化引起的微生物群落的改变。该柱状图和热图展示了龈下微生物群落在门和目水平上的相对丰度。随时间变化的微生物组成差异，以及个体间或个体内、不同采样方法之间的比较以直方图形式呈现。本图展示了在不同分类学水平上对两种采样方法（方法A和方法B）进行比较的结果。通过新一代测序获得的数值可通过表格形式进行统计分析。如本表所示，可在不同的分类学水平上对不同的时间点进行分析。通过计算 P 值以验证结果的显著性。最后，可以在OTU水平上通过主坐标分析来可视化口腔微生物组。该图展示了五名受试者个体内部和个体之间的差异。某些组别的聚类可以反映微生物组组成的改变。此3D动画展示了病例对照研究的结果。红点代表病例组，蓝点代表对照组。在 T3 时点正畸干预后，病例呈现出明显的聚类，即较大的红色圆点，表明微生物组发生了变化。显示对照组的蓝色圆点则分布均匀。该方法可为健康儿童龈下沟生物膜采样提供临床见解。我们选择纸尖作为这种易损区域最合适的材料。在本视频中，我们仅将该方法应用于恒牙情况，该方法也可应用于混合牙列或乳牙情况。对于部分患者，您也可以根据相同的方案采集患有牙周病的部位样本。大家好，我叫Barbara，是一名分子微生物学家。当我在实验室分析生物膜时，需要依赖一组无偏倚的临床样本库。口腔微生物研究这一跨学科领域的每一步都必须完全标准化。此外，还有一个重要事实：只有在团队中才能取得成功。因此，务必善待你的同事。

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口腔生物膜取样在健康儿童中的微生物分析

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健康儿童口腔生物膜取样用于微生物组分析

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