粉扑诱导的全细胞电流在脑切片中的应用

我们描述的粉扑技术, 其中的药理试剂可以在整个细胞膜片钳记录, 并突出了各方面的特点, 这是至关重要的成功。

这种 puff 技术的总体目标是在全细胞膜片钳记录中进行药理学给药。这种方法可以帮助回答电生理学领域的关键问题，例如药物管理。该技术的主要优点是记录位点周围的药物浓度迅速增加，从而防止膜受体脱敏。

一般来说，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为急性前额叶皮层切片的准备和粉扑微量移液器的位置相对困难。要开始此过程，请将冷冻的切割溶液压碎以获得雪泥。将泥状溶液放在冰上，用 95% 氧气、5% 二氧化碳鼓泡。

接下来，将解剖后的头部放入装满冰冷切割溶液的烧杯中，几秒钟后取出。用细剪刀沿中线沿尾喙方向剪下头骨，并去除头骨的侧面部分。然后，用细刮刀去除大脑，并将其放入冰冷的切割溶液中。

然后，将大脑放在装满冰的 9 厘米培养皿的盖子上。用冰冷的切割溶液冲洗大脑。然后，用剃须刀片切掉小脑和嗅球。

随后，将氰基丙烯酸酯胶涂在 Vibratome 样品架上。小心地将脑块放在胶水滴上，嘴部朝上，并立即将其浸入冰冷的切割溶液中。将刀架相对于水平面调整到 15 度角。

将脑组织切成 350 微米的冠状切片。然后，将玻片转移到装有 ACSF 的回收室中，并在 95% 氧气、5% 二氧化碳的持续鼓泡中孵育 1 小时。在我们的实验中，急性前额叶皮层切片的制备在手术中也至关重要。

健康的脑切片意味着可以紧密修补的活跃神经元。在此过程中，制作玻璃硼硅酸盐微量移液器，用作记录电极或粉扑微量移液器。对于记录电极，吸头电阻在 4 到 6 兆欧的范围内，而粉扑微量移液器的吸头直径在 2 到 5 微米的范围内。

向 ACSF 中添加钠离子通道阻滞剂以阻断快速钠离子通道，从而阻断动作电位，并在记录室中保持该溶液每分钟 2 至 3 毫升的恒定流速。不断用 95% 氧气、5% 二氧化碳鼓泡 ACSF 以确保切片的活力。使用巴斯德移液器将脑切片转移到记录室，其细尖端切割以适合切片的大小。

接下来，在切片上方放置一个铂金切片锚点，以将其固定在平台上。之后，用内部溶液填充记录微量移液器，并用 10 微摩尔、50 微摩尔和 100 微摩尔的 GABA 填充粉扑微量移液器，或 ACSF 作为载体控制。为防止碎屑堵塞，在将记录电极浸入 ACSF 之前，请使用 1 毫升注射器施加轻微的正压。

在显微镜下，放置记录电极和吹扫微量移液器，使尖端出现在显示器的中心。然后，确定目标神经元。调整显微镜焦距，同时逐渐降低粉扑微量移液器，并将其以 45 度角放置在记录神经元上方。

将 puff 微量移液器尖端与目标神经元之间的距离保持在 20 至 40 微米的范围内。用记录电极缓慢而小心地接近神经元，然后释放正压。通过连接到电极支架的管道进行微弱而短暂的抽吸，以形成千兆级密封。

将电压保持在零毫伏。形成千兆级密封后，手动或自动补偿快速和慢速电容。然后，通过管道进行短暂而有力的抽吸，以进入全细胞模式。

随后，在电压钳模式下记录诱发的 IPSC 电流。通过由 Master-8 电压步进发生器控制的粉扑微量移液器输送单个或成对的 GABA 粉扑。改变抽吸持续时间以获得最佳的诱发 IPSC 电流结果，并在 LPS 诱导的抑郁模型中测量诱发的 IPSC 电流。

此处显示的是 10、50 和 100 微摩尔 GABA 诱导的样品 IPSC。这是 puff 持续时间响应曲线。此处显示了 GABA 以 50 微摩尔泡吸以 1 秒、2 秒或 3 秒的间隔喷出的重复电流。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住获得健康的脑切片。该技术发展后，为药理给药领域的研究人员探索药物在电生理学中的作用铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何在全细胞膜片钳记录中进行药物给药有一个很好的了解。不要忘记，使用 TTX 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。