立体定向引导下大鼠听觉皮层消融及脑内病灶定位

本实验的总体目标是描述在立体定位引导下损毁听觉皮层的过程，并利用坐标图将损伤位置精确定位在脑表面图像上。该方法有助于听觉神经科学研究人员探讨皮层在声音感知通路中的作用，以及相关的机制和位置可塑性。

该技术的主要优势在于，它能够利用基本方法对听觉皮层进行手术暴露和损毁，且这些方法可被任何研究人员根据需要进行调整。因此，该方法在听觉神经科学领域具有重要应用价值，也可推广至其他感觉系统，如视觉和体感系统。此外，该方法还可用于研究单侧听觉皮层损毁对其他皮层区域所造成的影响。

该方法的可视化演示至关重要，因为将立体定位坐标准确识别并转换至颞骨位置，是精确定位听觉皮层的关键。开始操作时，将麻醉后的大鼠置于加热垫上以维持其体温。随后使用两个耳杆和一个咬合杆，将动物头部固定在立体定位仪中。

用剃刀剃除头皮毛发，并使用聚维酮碘对手术区域进行消毒。使用手术刀沿中线切开皮肤以暴露颅骨，并剥离覆盖在颅骨表面的骨膜。随后，用无菌棉签轻轻擦去覆盖在颅骨表面的血液。

为了可视化前囟、后囟和耳间线，使用手术刀在颞肌靠近其颅骨背侧附着处进行切口。随后，使用针线材料将肌肉拉开，并将缝线固定在立体定位仪框架上，以暴露颞骨。缓慢降低一根无菌直针，直至其恰好位于颅骨表面的上方，使针尖置于耳间零点位置。

将此点设为零点。随后，使用四个点定位听眦线（AC）。然后将针头下移至颞骨上方附近，以观察这四个点中的每一个。

用记号笔在颞骨上标记各点，并按顺序连接，画出一个矩形。该矩形将作为在骨上开窗的引导。在此操作中，使用电动钻和小型钻头打开骨窗。

以 8,000 rpm 的转速钻取矩形区域的周边，直至骨质松动。通过用冷的无菌生理盐水冲洗钻孔表面以冷却，防止对皮质下结构造成损伤。当骨质松动时，需小心避免继续钻入脑组织。

当骨缘松动后，用精细镊子轻轻提起覆盖的颅骨，置于冷的无菌生理盐水中保存。在手术显微镜下，用显微外科刀片轻柔地切开脑膜，并用两把尖头镊子将其移除。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗手术区域。

接下来，使用连接无菌20号钝头针的外科吸引装置轻柔地吸除大脑皮层（AC）。仅吸除六层皮层结构，避免吸及下方的白质。此步骤至关重要，必须极为谨慎地操作。

当抽吸完成后，用提取的骨组织覆盖手术部位，并应用可吸收止血纱布。让颞肌恢复至原始位置，然后使用伤口夹缝合皮肤。之后，对伤口涂抹抗生素软膏。

随后，在大鼠背部皮下注射布托啡诺作为镇痛剂，分别在手术结束后1小时和8小时各注射一次。将动物留在加热垫上直至其苏醒，并送回饲养笼中恢复。当完成使用AC损毁大鼠的研究后，通过腹腔注射0.1毫升戊巴比妥钠对其进行终末麻醉处死。

在进行林格氏液和甲醛的心内灌注后，去除头部的皮肤和肌肉以暴露颅骨。使用斯宾塞剪刀在眶骨上做横向切口。随后，移除颅骨后部，并使用咬骨钳沿颅骨顶部边缘剪开，以暴露脑组织。

注意不要损伤脑组织。暴露脑组织后，使用尖头镊子小心地去除硬脑膜。用手指轻轻插入脑组织下方并将其抬起。

然后抬起脑组织并切断神经，直至完全游离。随后将脑组织浸入甲醛溶液中，在4°C条件下保存24小时。固定后，小心地将脑组织放入冠状位大鼠脑切片模具中，暴露脑的外侧表面。

使用相机支架将相机置于大脑皮层表面上方21厘米处。然后选择超微距拍摄模式，拍摄脑表面图像。随后，使用图像编辑软件打开图像，并将其尺寸缩小50%。识别前囟（Bregma）、后囟（Lambda）和耳间零点参考位置，并在图像中标记其位置。

在脑部的侧面图像上绘制消融区域的轮廓。将包含听觉皮层初级和次级区域的坐标图导入编辑程序的文件中。然后点击该坐标图并拖动，使其与消融后脑组织的侧面照片叠加对齐。

使坐标图上的前囟（Bregma）和后囟（Lambda）参考点与侧脑图像中识别出的前囟（Bregma）和IA参考点重合。随后，利用外侧沟（Rhinal fissure）作为参考，调整脑图像与坐标图的位置，使其相互对齐。重要的是要确认白质结构完整无损。

这可以通过对脑组织连续切片进行免疫染色来实现。为了验证本方案的有效性，我们将三只听觉皮层切除的大鼠存活一周后处死，收集耳蜗组织，通过qPCR研究成年耳蜗中最重要的AMPA受体亚基GluA2和GluA3表达水平的变化。与假手术对照组动物相比，听觉皮层切除大鼠双侧耳蜗中GluA2转录水平下调，而GluA3转录水平上调，该结果与我们之前的研究一致。

进行手术时，需牢记以下三点：以最低转速和最小压力钻开颞骨，小心去除脑膜以避免损伤血管，以及仅限于吸除灰质组织。若操作得当，掌握该技术后可在45分钟内完成听觉皮层的手术暴露与损毁。通过该方法，后续可进一步采用生理学、行为学和/或免疫细胞化学方法回答更多科学问题，例如听觉皮层缺失如何影响其他感觉系统功能。