利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱
October 19th, 2017
巨噬细胞胞外陷阱是一个新描述的实体。这篇文章将集中于共焦显微镜方法和如何他们是可视化的体外和体内从肺部样本。
该方法的总体目标是展示如何使用共聚焦显微镜观察和研究巨噬细胞细胞外陷阱。这种方法可以帮助回答炎症领域的关键问题，例如对感染和其他免疫刺激的反应。该技术的主要优点是它是对已用于研究中性粒细胞胞外陷阱的成熟方法的修改。
演示此程序的是 Roleen Sharma。通过支气管肺泡灌洗或 BAL 从人和小鼠获得肺巨噬细胞后，根据文本方案，使用台盼蓝和血细胞计数器对 BAL 溶液进行活细胞计数。将 500 微升培养基中的 1 到 4 次 10 至第 5 个巨噬细胞移液到 24 孔板孔中的盖玻片上，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜，使细胞粘附。
取出培养基并使用 PBS 洗涤细胞一次。然后加入 2% 多聚甲醛-高碘酸盐-赖氨酸或 PLP 固定剂，并将样品孵育 10 分钟。使用 PBS 短暂洗涤细胞后，在 PBS 中加入 0.2% 吐温 20 并孵育细胞 20 分钟。
接下来，为了封闭细胞，加入 10% 鸡血清的 5% BSA 溶液，用 PBS 稀释，并在室温下孵育样品 30 分钟。然后用 1 比 100 浓度的一抗和同位素对照抗体替换封闭溶液，并在室温下孵育细胞 1 小时。孵育后，在添加相应的二抗之前，使用 PBS 洗涤细胞。
然后将样品在室温下孵育 40 分钟。在 PBS 中洗涤细胞后，用基于 DAPI 的封固剂封固样品，然后使用共聚焦显微镜观察样品。要使用抗原修复溶液预处理 FFPE 样品，请在 60 摄氏度的烘箱下干燥载玻片 60 分钟。
然后将玻片转移到二甲苯溶液中 30 分钟，然后在室温下将样品转移到 70% 乙醇中 5 分钟。使用自来水冲洗玻片后，将它们放在耐热保鲜膜中，并将它们放入 Tris-EDTA pH 9.0 的压力锅中 10 分钟，使其具有更高的抗原修复能力。将样品冷却 20 分钟，然后转移到自来水中。
然后将它们放在摇杆上 5 分钟。重复自来水洗涤，然后在摇杆上的 PBS 中洗涤载玻片一次。要封闭样品，请在 5% BSA PBS 中加入 10% 鸡血清，并在室温下孵育 30 分钟。
然后，为了确定巨噬细胞中的细胞外陷阱或 MET，在 1% BSA PBS 中加入 1 比 100 稀释的一抗，并将载玻片在 4 摄氏度下孵育 16 小时。使用 PBS 在摇床上洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。在 1% BSA PBS 中加入相应的荧光二抗，并在室温下孵育玻片 40 分钟。
PBS 洗涤后，使用含有 DAPI 的封固剂对染色质进行染色并封片样品。使用连接到倒置显微镜的共聚焦激光扫描头，使用 20X 0.1 NA 空气和 40X 1.0 NA 油物镜捕获荧光图像。通过单击 Line Sequential 调平按钮捕获单平面 512 x 512 像素图像。
每个部分至少获得 10 个视野，用于分析和每个结果的数据。要对微量离心管中的切片进行染色，请添加 200 μL 体积的相关一抗，并将样品在 4 摄氏度下孵育 16 小时。在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后加入适当的二抗，并在室温下孵育样品 1 小时。
使用 DAPI 在溶液中对肺切片进行染色，并将样品孵育 20 分钟，然后在 PBS 中将盖玻片添加到显微镜载玻片上的切片上。使用配备 405 纳米、440 纳米、473 纳米、543 纳米和 635 纳米激光器的 40X 1.3 NA 物镜的倒置共聚焦显微镜来捕获图像并记录 0.54 微米厚的 3D Z 堆栈，并具有最佳 Z 切片。最后，根据文本协议分析图像。
此处显示了 BAL 样本中的 MET 示例。第一个可检测到的特征是细胞核向细胞边缘的运动，如早期 MET 所示，它大致呈球形。紧随其后的是细胞外染色质与其他共表达介质，例如 H3Cit 和颗粒蛋白酶，如这种更成熟的 MET 所示。
早期 MET 位于左上角，晚期 MET 位于其下方朝向中心。肺组织 MET 如图所示。当肺部被液体充气以确定肺结构时，MET 将被推向肺泡壁。
MET 的形态也会根据组织在哪个平面上切割而有所不同。用于肺组织样品的标准切片厚度为 4 至 5 微米。较厚的组织切片可以拍摄多张图像，然后可以 3D 形式查看 MET。
这里展示了一个从 25 到 35 微米切片的小鼠肺组织的 3D 图像示例。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两天的染色加成像中完成。在尝试此过程时，重要的是要记住要轻柔地洗涤。
按照此程序，可以执行其他方法（如酶谱）来回答其他问题，例如蛋白酶表达。开发后，该技术可能为炎症性巨噬细胞反应的研究铺平道路。观看此视频后，您应该对如何使用共聚焦显微镜可视化 MET 有了很好的了解。
不要忘记，使用 PLP 可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和护目镜。
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概述
本文聚焦于使用共聚焦显微镜技术可视化巨噬细胞胞外陷阱。本文讨论了应用于肺样本的体外和体内方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 巨噬细胞胞外陷阱是一个新描述的实体。
- 理解它们在炎症中的作用对于免疫反应研究至关重要。
- 共聚焦显微镜是可视化这些结构的强大工具。
- 这种方法建立在已用于中性粒细胞胞外陷阱的既定技术之上。
研究目的
- 展示巨噬细胞胞外陷阱的可视化。
- 探索对感染和免疫刺激的反应。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 通过支气管肺泡灌洗（BAL）从人类和小鼠肺中分离巨噬细胞。
- 使用台盼蓝和血细胞计数板进行活细胞计数。
- 在24孔板中的盖玻片上进行细胞培养。
- 在37摄氏度下孵育细胞以确保其粘附。
主要结果
- 成功可视化了巨噬细胞胞外陷阱。
- 展示了该方法在研究免疫反应中的有效性。
- 协议改进以提高清晰度和可重复性。
- 为理解巨噬细胞在炎症中的功能做出贡献。
结论
- 共聚焦显微镜方法有效用于研究巨噬细胞胞外陷阱。
- 这种技术可以推进炎症和免疫反应研究。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索更多的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
