Name: 利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱的方法，该方法适用于肺泡灌洗液样本，可研究感染与免疫刺激反应。此技术基于成熟的中性粒细胞胞外陷阱检测方案改进而来，为炎症与免疫应答研究提供可靠工具。

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本工作由蒙纳士大学、国家健康与医学研究理事会以及蒙纳士肺与睡眠研究所的资助项目支持。作者感谢莫纳什医疗中心临床免疫学部门的工作人员，以及朱迪·卡拉汉（Judy Callaghan）、亚历克斯·富尔彻（Alex Fulcher）、克尔斯滕·埃尔加斯（Kirstin Elgass）和 Camden Lo（莫纳什显微成像中心，MMI）在共聚焦显微成像方面提供的帮助，并感谢蒙纳士大学MMI设施的支持。作者同时感谢蒙纳士组织学平台提供的设施及其在科学与技术方面的协助。

本方案遵循以下批准的实验：（1）由莫纳什医疗中心伦理委员会批准的人类实验；（2）由墨尔本大学伦理委员会批准的动物实验。
1. 支气管肺泡灌洗（BAL）巨噬细胞
<ol>
	<li>通过以下方法获取肺泡灌洗液（BAL）中的肺巨噬细胞：(1) 通过支气管镜检查从人体受试者获取6；(2) 通过气管内抽吸法从小鼠获取13。 
	注意：巨噬细胞的获取通常会导致这些细胞发生一定程度的活化。巨噬细胞来源于因疑似医学问题而需接受支气管镜检查的患者，并非所有受试者均适用于METs分析（需根据各个独立项目具体确定）。
	<ol>
		<li>取BAL溶液，离心（500 × g，10分钟）形成细胞沉淀，用培养基（含5%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基）在室温下洗涤两次，然后将细胞重悬于4 mL培养基中。</li>
		<li>如有需要，可申请进行正式的细胞分类计数；大多数细胞（通常&#62;80%）为巨噬细胞6。 
		注意：该步骤通常由临床组织学服务部门通过观察不同类型细胞的形态学特征完成6。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板对BAL溶液中的巨噬细胞进行活细胞计数。 
		注意：BAL溶液如步骤1.1所述，来源于人和小鼠。</li>
		<li>将1 - 4 × 105个巨噬细胞加入含500 µL培养基的24孔板中的盖玻片上，于37°C孵育过夜；细胞将贴附于盖玻片。对于人源样本，需添加抗生素（例如，青霉素和链霉素，104 U/mL），以防止细菌污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 支气管肺泡灌洗液巨噬细胞的免疫荧光标记/显微镜检测
注意：细胞已如上所述贴附于盖玻片上。
<ol>
	<li>移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。用含2%多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）的固定液固定细胞10分钟。</li>
	<li>用PBS短暂洗涤细胞，然后在含0.2% Tween 20的PBS中透化处理20分钟。</li>
	<li>用含10%鸡血清和5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭细胞，室温孵育30分钟。</li>
	<li>加入一抗及同型对照抗体，室温下孵育1小时，稀释比例为1:100（更详细信息见材料表），或在37 °C进行孵育。 
	注意：对于支气管肺泡灌洗（BAL）样本，通常无需使用巨噬细胞特异性标记物。</li>
	<li>加入一抗后，用PBS洗涤细胞，再与相应的二抗在室温下孵育40分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤样本，然后使用含DAPI的封片剂封片，通过共聚焦显微镜（如上所述）在405、488、561和647 nm激光激发下，使用40倍、1.0 NA油镜进行观察。</li>
</ol>
3. 肺组织样本
注意：对于肺组织的体内研究，应在相关暴露后研究样本（例如，如 O'Sullivan 等7所述）。本实验最相关的暴露为传染性微生物，尤其是细菌。可用于本方法的小鼠品系包括 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠，年龄 10 - 12 周，体重 25 - 30 g，雄性。
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）和赛拉嗪（40 mg/kg）处死小鼠。使用手术镊和剪刀打开胸腔，暴露肺和心脏。
	<ol>
		<li>使用21号针头将温热的PBS经右心室灌注30秒以冲洗血管中的血液，随后将10 mL 2% PLP固定液经右心室灌注30秒。</li>
		<li>用温热的PBS（42 °C）冲洗开放的胸腔。使用21号针头和一段裁剪合适的0.8 mm导管对气管进行插管，并注入800 µL预热至42 °C的3%低熔点琼脂糖溶液。</li>
		<li>用编织丝线（4.0 USP）结扎气管。将丝线环绕气管，在套管插入点稍下方打一个简单的单结固定。为使琼脂糖凝固，将冰冷的PBS施加于肺周围。使用剪刀和钝性分离技术将肺和心脏整体从胸腔中取出。分别取出每侧肺组织，随后在4 °C条件下用2% PLP或福尔马林固定16小时。</li>
		<li>将标本保存在4 °C的PBS中，直至进行组织切片。上述获取肺组织的方法此前已有描述13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤准备肺组织样本。
	<ol>
		<li>将步骤3.1中切除的肺组织在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时（室温）。转移至75%乙醇，并放入组织处理机中进行12小时循环处理（75%乙醇中2.5小时，无水乙醇中3小时，溶剂3B中3.5小时，石蜡中3小时）。</li>
		<li>将组织包埋于标准石蜡中，制成福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织块，并在室温下保存。 
		注：在此阶段，通常可方便地将肺组织切片用于常规载玻片制备。</li>
		<li>使用切片机将FFPE肺组织切成4–5 µm厚度的切片，并如O'Sullivan et al.7此前所述，将切片贴附于带电荷的涂层载玻片上。</li>
		<li>进行封片时，在60 mm × 24 mm盖玻片（1.5号）上滴加3滴封片介质，将载玻片倒置在盖玻片上并挤出多余介质。用指甲油密封边缘，于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肺组织样本的制备/显微观察
<ol>
	<li>对FFPE肺组织样本进行脱蜡、复水，并用抗原修复液进行预处理。
	<ol>
		<li>将FFPE切片在60 °C下烘烤60分钟。然后将切片放入二甲苯溶液中30分钟，转移至70%乙醇溶液中室温孵育5分钟。用自来水冲洗。</li>
		<li>用耐热塑料膜包裹，在压力锅中使用 10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 9.0 溶液进行 HIER 抗原修复，加热 10 分钟。室温冷却 20 分钟。在摇床上用自来水洗涤两次，每次 5 分钟，再在摇床上用 PBS 洗涤一次。</li>
		<li>用含10%鸡血清的5% BSA/PBS溶液在室温下封闭30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组织进行染色。
	<ol>
		<li>为了定义巨噬细胞中的METs，在4 °C条件下，将一抗（MMP-9、H3Cit和F4/80）以1/100稀释度溶于1% BSA/PBS中孵育16小时（有关抗体用量的具体信息列于 材料表用PBS在摇床上洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>在室温下，用含1% BSA的PBS缓冲液稀释的相应二抗孵育40分钟，实现荧光检测。所用抗体为：（1）鸡抗小鼠488（绿色），（2）鸡抗山羊594（红色），（3）驴抗小鼠647（远红）。</li>
		<li>用 PBS 清洗切片，然后使用含 DAPI 的封片剂封片，以进行染色质染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用安装在倒置显微镜上的共聚焦激光扫描头获取荧光图像。
	<ol>
		<li>使用405、488、561和647 nm激光激发样本。点击逐行扫描并调平按钮（2次行平均），以20X物镜采集单层512 × 512像素的图像。&#160;0.1 数值孔径空气和 40倍&#160;1.0 NA 油浸物镜</li>
		<li>每个切片至少获取十个视野进行分析，并为每个结果提供相应数据即对照组10个高倍视野（HFOV），刺激样本组10个高倍视野 等等。，每只小鼠。 
		注意：为了获得整个视野的代表性样本，可采用矩阵系统，即将视野划分为不同的区域，并对每个不同样本使用相同的矩阵来选择视野。例如，该区域可分为9个部分，并从中心和4个角各采集两个HFOV。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. METs 的三维（3-D）成像
注意：由于 METs 是三维结构，通过获取多个 z 轴层析图像并进行重建，可能提供有价值的信息。
<ol>
	<li>使用振动切片机从石蜡包埋块中切取肺组织样本，设置振幅为1.8 mm，切片速度为0.1–0.5 mm/s，切片厚度为200 µm。</li>
	<li>用相应血清（10%胎牛血清和10%鸡血清）的20%溶液封闭肺组织，随后在含有3.75% Triton-X 100的PBS中于室温下轻柔振荡透化7小时。</li>
	<li>将切片置于微量离心管中，加入200 µL体积的相关一抗（MMP-9、H3Cit 和 F4/80），于4 °C孵育16小时（抗体浓度详见材料表）。</li>
	<li>用PBS清洗切片，每次10分钟，共清洗3次，然后在室温下与相应的二抗孵育1小时。</li>
	<li>将肺组织切片在DAPI溶液（1:5,000）中染色20分钟，随后将盖玻片加盖至含PBS的显微镜载玻片上。</li>
	<li>使用配备405 nm、440 nm、473 nm、543 nm和635 nm激光器的倒置共聚焦显微镜（40x 1.3 NA）获取荧光图像。</li>
	<li>使用40x 1.3 NA油镜，以最优z轴步进采集厚度为0.54 µm的三维z轴层扫图像。 
	注：所用软件因显微镜型号而异。在补充文件1中提供了某一显微镜软件操作示例。</li>
</ol>
6. 图像分析
注意：样本分析需要使用特定的成像分析软件，相关示例列在材料表中。虽然结果分析将取决于所使用的具体程序，但以下列出的要点至关重要。
<ol>
	<li>支气管肺泡灌洗样本分析
	<ol>
		<li>通过选择DAPI的蓝色通道并设定细胞的最小尺寸来确定巨噬细胞的数量（例如, &#62; 直径为18 µm。使用相应软件，测量每视野中巨噬细胞的总数。</li>
		<li>通过DAPI检测到的细胞外染色质，并结合其他标志物的共表达，计数具有MET特征的细胞数量例如MMP12、PAD2 和 H3Cit。 
		注意：可分析的标记物数量取决于可用激光器的数量，但理想情况下除DAPI外，还应至少包括另外两种标记物。其他关于MET表达的特异性较低的参数（例如，具有细胞外染色质和核增大的细胞数量）可用于评估。</li>
		<li>为比较支气管肺泡灌洗（BAL）样本中MET的表达水平（对照组、烟雾暴露组及烟雾暴露/DNase处理组之间），每份样本需分析至少100个BAL巨噬细胞。</li>
		<li>为了测量荧光的二抗及同型对照水平；每个样本至少测量100个细胞的荧光强度。测定每种标记物的背景荧光平均水平例如，H3Cit）使用标准软件进行分析。</li>
		<li>为定义MET表达，计数具有典型表型的细胞（例如，共表达 H3Cit 和 MMP9 的细胞外染色质）并对每个 MET 测量标记物的荧光强度水平（例如，H3Cit 和 MMP9）。如果细胞产生 METs 的染色信号未高于背景值且与同型对照无差异，则排除这些细胞。</li>
		<li>对于人BAL样本，每个样本至少分析100个细胞，以确定形成METs的巨噬细胞百分比。对于小鼠样本，由于细胞较小且METs较难界定，应分析每个样本中更多的细胞数量。例如，200个巨噬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺组织样本分析
	<ol>
		<li>为确定肺组织中 METs 的存在，可使用 F4/80 等特异性巨噬细胞标记物。</li>
		<li>通过检测表达细胞外染色质且共定位F4/80的细胞与其他参数（如6.1节所列）来确定肺组织中METs的存在。</li>
		<li>测定仅使用二抗和同型对照的样本中的背景荧光水平。排除未超过背景水平的METs进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
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<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
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<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

作者就本研究无任何披露事项。

本综述中所述方法基于用于确定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的方法14肺泡灌洗液样本中，巨噬细胞迄今为止是占主导地位的细胞类型，该采集方法特别适用于研究巨噬细胞外陷阱（METs）。若肺泡灌洗液中存在红细胞，应使用氯化铵裂解这些细胞。肺泡灌洗操作通常会激活巨噬细胞，因此在未刺激的样本中也预期会有METs的存在。肺泡灌洗巨噬细胞通常具有很强的贴壁性。由于这类细胞占主导地位且可通过形态学特征加以区分，一般无需使用特异性标记物进行识别。通常情况下，肺泡灌洗液中超过80%的细胞为巨噬细胞（中性粒细胞比例低于5%），经过多次洗涤后，一般仅剩贴壁的白细胞即，巨噬细胞）保持6如果对人类样本中巨噬细胞与中性粒细胞的区分存在疑问，可使用中性粒细胞标志物（如中性粒细胞弹性蛋白酶）进行鉴别。在肺组织中，可使用特异性巨噬细胞标志物（例如，F4/80）是必需的，因为巨噬细胞难以与其他细胞类型区分。巨噬细胞具有自发荧光，因此使用背景对照和同型对照非常重要；对于经刺激的样本尤其如此。
<p class="jove_conten...

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）最初由 Brinkmann et al.1 描述。它们主要在感染（尤其是细菌感染）刺激下产生，在宿主防御中发挥重要作用1,2。此外，NETs 也被报道可在非感染性疾病中形成，包括血管炎和系统性红斑狼疮（SLE），以及在佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）这一有丝分裂原的刺激下产生2,3。近年来人们认识到，其他类型的细胞也可能产生胞外诱捕网，例如巨噬细胞。然而，巨噬细胞胞外诱捕网（macrophage extracellular traps, METs）在现有文献中尚未被明确定义4,5。我们近期已建立了在体外（in vitro）和体内（in vivo）检测 METs 的方法6,7。本文将描述利用共聚焦显微镜检测 METs 的实验方法。
NETosis 区别于其他细胞通路（如凋亡8）的关键特征包括染色质的释放，并伴随以下三个特征：（1）组蛋白瓜氨酸化（H3Cit）9，（2）颗粒蛋白酶的共表达10，以及（3）肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）4 的参与11,12。巨噬细胞同样表达 H3Cit、颗粒蛋白酶和 PAD，这些特征可用于界定 METs 的存在。
微囊泡（METs）在肺部可能具有特别重要的作用，因为肺泡和气道中主要存在的细胞是巨噬细胞，而巨噬细胞在启动针对感染或炎症的细胞免疫反应中起首要作用。此外，尽管肺部大部分区域为空腔（例如，肺泡内部），METs 能够向可用空间扩展，这与实体器官形成对比。
目前定义中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的最常用方法是共聚焦显微镜技术。目前尚无明确定义的方法用于检测巨噬细胞胞外诱捕网（METs）。本方案中已将检测NETs的技术改进并用于检测METs的存在。该方法的主要要求是能够使用共聚焦显微镜以及配备适当的图像分析软件。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;人源样本：一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗人 H3Cit（瓜氨酸 R26）</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 µg/mL</td></tr><tr><td>兔抗人 MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 浓度无法量化</td></tr><tr><td>小鼠抗人 MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 腹水，未提供浓度</td></tr><tr><td>兔抗人 PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 µg/mL</td></tr><tr><td>小鼠抗人 PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 µg/mL</td></tr><tr><td>羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 µg/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠样本：一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 µg/mL</td></tr><tr><td>兔抗小鼠 H3Cit（瓜氨酸 R26）</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 µg/mL</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 F4/80</td><td>本实验室（杂交瘤）</td><td>本实验室</td><td>20 µg/mL</td></tr><tr><td>羊抗人 Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 µg/mL</td></tr><tr><td>小鼠抗人 &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 µg/mL</td></tr><tr><td>Super-frost plus 载玻片</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100（Triton-X 100）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡抗兔 AF 488</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗兔 AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗山羊 AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗小鼠 AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>驴抗羊 AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗小鼠 AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>驴抗羊 AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>同型对照</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>本实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>本实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>本实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>羊 IgG</td><td>本实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件程序&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光强度平均值可使用 Microsoft Excel 等标准办公软件进行计算</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 共聚焦扫描显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 共聚焦扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织来源&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自莫纳什医疗中心（Monash Medical Centre）支气管镜检查室的人支气管肺泡灌洗（BAL）样本</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自墨尔本大学药理学系的小鼠 BAL 样本及肺组织</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏丹黑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）固定液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>天然甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>溶剂 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 12 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 60 × 24 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57 黑色 6</td><td>莫纳什动物研究平台（Monash animal research platform, MARP）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用共聚焦显微镜观察巨噬细胞外陷阱

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

定义中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的一种主要方法是共聚焦显微镜技术。我们对已建立的共聚焦显微镜方法进行了改进，以用于可视化巨噬细胞胞外诱捕网（METs）。这些胞外诱捕网的特征是存在胞外染色质，并共表达其他组分，如颗粒蛋白酶、瓜氨酸化组蛋白和肽基精氨酸脱亚氨酶（PAD）。METs的表达通常在细胞经刺激后进行检测，并与未刺激样本进行比较。实验中还包含背景对照和同型对照样本。细胞通过明确定义的图像分析软件进行分析。共聚焦显微镜可用于检测METs的存在，既可用于体外实验，也可用于体内样本分析。 体外 和 体内 在肺组织中。

可通过支气管肺泡灌洗（BAL）样本、肺组织以及较厚的肺组织切片中的三维图像观察到髓系细胞外陷阱（METs）。图1展示了在BAL样本中观察到的METs示例。METs的形态会因其成熟阶段的不同而有所变化。显微镜下最早可观察到的特征是细胞核向细胞边缘移动。随后出现细胞外染色质，以及共同表达的其他介质，如H3Cit和颗粒蛋白酶。在早期阶段，细胞仍大致保持球形，并表达出细胞外陷阱结构；而在后期阶段，MET的形成则表现为细胞体的伸长。
肺组织的METs如图2所示。当肺组织被液体充盈以显示其结构时，METs通常会被推至肺泡壁上。METs的形态也会因组织切片平面的不同而有所差异。肺组织样本的标准切片厚度为4-5 µm。较厚的组织切片可进行多张图像采集，从而实现METs的三维观察。抗体在肺组织中的渗透深度有限，因此25-50 µm的切片厚度最为理想。<...

巨噬细胞胞外诱捕网是一种新近描述的结构。本文将重点介绍共聚焦显微镜技术及其可视化方法 体外 和 体内 来自肺组织样本。

定义中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的主要方法是共聚焦显微镜技术。我们对已建立的共聚焦显微镜方法进行了改进……

本方法的总体目标是展示如何利用共聚焦显微镜对巨噬细胞胞外诱捕网进行可视化和研究。该方法有助于解答炎症领域中的关键问题，例如对感染及其他免疫刺激的反应。该技术的主要优势在于，它是在一种已被广泛用于研究中性粒细胞胞外诱捕网的成熟方法基础上进行的改进。本实验操作由 Roleen Sharma 演示。根据文本方案，通过支气管肺泡灌洗（BAL）从人和小鼠获取肺泡巨噬细胞后，使用台盼蓝和血细胞计数板对 BAL 液进行活细胞计数。将 1 至 4 × 10⁵ 个巨噬细胞溶于 500 µL 培养基中，用移液器接种至 24 孔板内盖玻片上，每孔加样一次至四次，随后将细胞在 37°C 条件下孵育过夜，使细胞充分贴壁。移除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。然后加入 2% 多聚甲醛-高碘酸盐-赖氨酸（PLP）固定液，孵育样品 10 分钟。用 PBS 短暂洗涤细胞后，加入含 0.2% TWEEN 20 的 PBS，孵育细胞 20 分钟。接下来，为了封闭细胞，将10%鸡血清用PBS稀释至5% BSA中，加入样本并在室温下孵育30分钟。然后将封闭液替换为1:100浓度的一抗和同型对照抗体，于室温孵育1小时。孵育结束后，使用PBS洗涤细胞，再加入相应的二抗。然后在室温下孵育样品 40 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，使用含 DAPI 的封片剂封片，随后用共聚焦显微镜观察样品。如需对 FFPE 样品进行抗原修复预处理，先将载玻片在 60 摄氏度的烘箱中干燥 60 分钟。然后将切片转移至二甲苯溶液中处理30分钟，再将样本转移至室温下的70%乙醇中处理5分钟。用自来水冲洗切片后，将其置于耐热塑料膜中，并在压力锅中使用pH 9.0的Tris-EDTA缓冲液进行高温抗原修复10分钟。样本冷却20分钟后，转移至自来水中。然后将它们置于摇床上5分钟。重复用自来水冲洗，再在摇床上用PBS冲洗载玻片一次。为封闭样品，加入含10%鸡血清的5% BSA PBS溶液，室温孵育30分钟。然后，为了鉴定巨噬细胞的细胞外陷阱（即巨噬细胞外陷阱，METs），将一抗用含1% BSA的PBS溶液按1:100稀释，加入后于4°C孵育切片16小时。用PBS在摇床上洗涤样本两次，每次5分钟。加入相应荧光标记的二抗（溶于含1% BSA的PBS溶液），室温孵育切片40分钟。经过 PBS 洗涤后，使用含 DAPI 的封片剂对染色质进行染色并封片。利用倒置显微镜连接的共聚焦激光扫描头，采用 20X 0.1 NA 干镜和 40X 1.0 NA 油镜采集荧光图像。通过点击“逐行顺序扫描”按钮，获取单层 512 × 512 像素的图像。每个结果至少获取每张切片10个视野用于分析和数据采集。在微量离心管中对切片进行染色时，加入200微升体积的相关一抗，并在4摄氏度下孵育样品16小时。加入相应的二抗之前，用PBS洗涤切片3次，每次10分钟，然后在室温下孵育样品1小时。使用 DAPI 对溶液中的肺组织切片进行染色，然后在 PBS 中的载玻片组织切片上加盖盖玻片前，将样品孵育 20 分钟。使用配备 405 纳米、440 纳米、473 纳米、543 纳米和 635 纳米激光器的倒置共聚焦显微镜，采用 40X 1.3 NA 物镜采集图像，并以最佳 Z 轴步进厚度（0.54 微米）记录三维 Z 层叠图像。最后，根据文本方案分析图像。此处展示的是支气管肺泡灌洗（BAL）样本中 MET 的一个示例。最早可检测到的特征是细胞核向细胞边缘移动，如该早期阶段的 MET 所示，其形状大致呈球形。随后出现细胞外染色质及其他共表达的介质，例如 H3Cit 和颗粒状蛋白酶，如该更成熟的 MET 所示。早期阶段的MET位于左上方，较晚阶段的MET位于其下方靠近中心位置。本图展示了肺组织中的MET。当肺部被液体充盈以显示肺部结构时，MET会被推至肺泡壁上。METs 的形态也会因组织切片的切面不同而有所差异。用于肺组织样本的标准切片厚度为四到五微米。较厚的组织切片可进行多次成像，从而实现 METs 的三维观察。此处展示了一例从小鼠肺组织切取25至35微米切片获得的三维图像。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成染色及成像。在进行该实验过程中，需特别注意洗涤步骤应轻柔操作。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如明胶酶谱法）来探究蛋白酶的表达等问题。该技术建立后，可能为研究炎症性巨噬细胞反应提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用共聚焦显微镜观察METs。请注意，使用PLP可能存在危险，因此在进行此操作时，应始终采取佩戴手套和护目装备等预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

本文描述了一种利用与旋转盘显微镜耦合的光镊对活体病原体进行单独选择、操控和成像的方法。光镊可对生物体实现空间和时间上的精确控制，并将其定位在宿主细胞附近。荧光显微镜则能够在对细胞干扰最小的情况下，捕捉动态的细胞间相互作用。...

使用光镊技术进行活细胞动态成像研究宿主-病原体相互作用

在本视频中，我们介绍了一种用于小鼠肺组织中巨噬细胞胞外诱捕网（METs）免疫染色及基于共聚焦显微镜的可视化检测方案。组织驻留型巨噬细胞通过表达巨噬细胞特异性的F4/80表面糖蛋白标志物进行鉴定，而METs则通过标记其相关分子基质金属蛋白酶9、瓜氨酸化组蛋白H3以及胞外染色质来实现可视化。...

小鼠肺组织样本中巨噬细胞胞外诱捕网的表征

本视频展示了如何对支气管肺泡灌洗液中支气管肺泡巨噬细胞的巨噬细胞胞外诱捕网（METs）进行免疫标记，并利用共聚焦显微镜对其进行可视化观察。...

人支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞外陷阱的可视化

体外刺激与巨噬细胞外陷阱的可视化

我们描述了一种实验装置，利用全内反射荧光显微镜，在活体巨噬细胞中以前所未有的高分辨率三维可视化吞噬体的形成与闭合过程。该方法可实时监测吞噬杯底部、延伸的伪足，以及吞噬体断裂的精确位点。...

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由活化的中性粒细胞释放的三维结构。近年来的研究已明确，NETs 参与多种疾病的病理过程。在组织中检测 NETs 可能具有诊断价值，因此需要标准化的标记 NET...

石蜡包埋组织中人和小鼠中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光标记

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外...

由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与多种疾病相关，通常使用免疫荧光法对其进行可视化观察。然而，目前存在多种染色方案，且多数情况下仅针对单一类型的组织进行检测。本文中，我们建立了一种适用于小鼠和人类组织中NETs染色的通用方案。...

人和小鼠组织中中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光成像

了解利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱的方法，该方法适用于肺泡灌洗液样本，可研究感染与免疫刺激反应。此技术基于成熟的中性粒细胞胞外陷阱检测方案改进而来，为炎症与免疫应答研究提供可靠工具。

使用共聚焦显微镜观察巨噬细胞外陷阱

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