利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱

该方法的总体目标是展示如何使用共聚焦显微镜观察和研究巨噬细胞细胞外陷阱。这种方法可以帮助回答炎症领域的关键问题，例如对感染和其他免疫刺激的反应。该技术的主要优点是它是对已用于研究中性粒细胞胞外陷阱的成熟方法的修改。

演示此程序的是 Roleen Sharma。通过支气管肺泡灌洗或 BAL 从人和小鼠获得肺巨噬细胞后，根据文本方案，使用台盼蓝和血细胞计数器对 BAL 溶液进行活细胞计数。将 500 微升培养基中的 1 到 4 次 10 至第 5 个巨噬细胞移液到 24 孔板孔中的盖玻片上，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜，使细胞粘附。

取出培养基并使用 PBS 洗涤细胞一次。然后加入 2% 多聚甲醛-高碘酸盐-赖氨酸或 PLP 固定剂，并将样品孵育 10 分钟。使用 PBS 短暂洗涤细胞后，在 PBS 中加入 0.2% 吐温 20 并孵育细胞 20 分钟。

接下来，为了封闭细胞，加入 10% 鸡血清的 5% BSA 溶液，用 PBS 稀释，并在室温下孵育样品 30 分钟。然后用 1 比 100 浓度的一抗和同位素对照抗体替换封闭溶液，并在室温下孵育细胞 1 小时。孵育后，在添加相应的二抗之前，使用 PBS 洗涤细胞。

然后将样品在室温下孵育 40 分钟。在 PBS 中洗涤细胞后，用基于 DAPI 的封固剂封固样品，然后使用共聚焦显微镜观察样品。要使用抗原修复溶液预处理 FFPE 样品，请在 60 摄氏度的烘箱下干燥载玻片 60 分钟。

然后将玻片转移到二甲苯溶液中 30 分钟，然后在室温下将样品转移到 70% 乙醇中 5 分钟。使用自来水冲洗玻片后，将它们放在耐热保鲜膜中，并将它们放入 Tris-EDTA pH 9.0 的压力锅中 10 分钟，使其具有更高的抗原修复能力。将样品冷却 20 分钟，然后转移到自来水中。

然后将它们放在摇杆上 5 分钟。重复自来水洗涤，然后在摇杆上的 PBS 中洗涤载玻片一次。要封闭样品，请在 5% BSA PBS 中加入 10% 鸡血清，并在室温下孵育 30 分钟。

然后，为了确定巨噬细胞中的细胞外陷阱或 MET，在 1% BSA PBS 中加入 1 比 100 稀释的一抗，并将载玻片在 4 摄氏度下孵育 16 小时。使用 PBS 在摇床上洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。在 1% BSA PBS 中加入相应的荧光二抗，并在室温下孵育玻片 40 分钟。

PBS 洗涤后，使用含有 DAPI 的封固剂对染色质进行染色并封片样品。使用连接到倒置显微镜的共聚焦激光扫描头，使用 20X 0.1 NA 空气和 40X 1.0 NA 油物镜捕获荧光图像。通过单击 Line Sequential 调平按钮捕获单平面 512 x 512 像素图像。

每个部分至少获得 10 个视野，用于分析和每个结果的数据。要对微量离心管中的切片进行染色，请添加 200 μL 体积的相关一抗，并将样品在 4 摄氏度下孵育 16 小时。在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后加入适当的二抗，并在室温下孵育样品 1 小时。

使用 DAPI 在溶液中对肺切片进行染色，并将样品孵育 20 分钟，然后在 PBS 中将盖玻片添加到显微镜载玻片上的切片上。使用配备 405 纳米、440 纳米、473 纳米、543 纳米和 635 纳米激光器的 40X 1.3 NA 物镜的倒置共聚焦显微镜来捕获图像并记录 0.54 微米厚的 3D Z 堆栈，并具有最佳 Z 切片。最后，根据文本协议分析图像。

此处显示了 BAL 样本中的 MET 示例。第一个可检测到的特征是细胞核向细胞边缘的运动，如早期 MET 所示，它大致呈球形。紧随其后的是细胞外染色质与其他共表达介质，例如 H3Cit 和颗粒蛋白酶，如这种更成熟的 MET 所示。

早期 MET 位于左上角，晚期 MET 位于其下方朝向中心。肺组织 MET 如图所示。当肺部被液体充气以确定肺结构时，MET 将被推向肺泡壁。

MET 的形态也会根据组织在哪个平面上切割而有所不同。用于肺组织样品的标准切片厚度为 4 至 5 微米。较厚的组织切片可以拍摄多张图像，然后可以 3D 形式查看 MET。

这里展示了一个从 25 到 35 微米切片的小鼠肺组织的 3D 图像示例。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两天的染色加成像中完成。在尝试此过程时，重要的是要记住要轻柔地洗涤。

按照此程序，可以执行其他方法（如酶谱）来回答其他问题，例如蛋白酶表达。开发后，该技术可能为炎症性巨噬细胞反应的研究铺平道路。观看此视频后，您应该对如何使用共聚焦显微镜可视化 MET 有了很好的了解。

不要忘记，使用 PLP 可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和护目镜。