Name: 用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解等压标记结合广泛液相色谱与质谱技术进行深层蛋白质组定量分析的方法。该技术可准确鉴定超过10,000种蛋白质，适用于疾病生物标志物发现及药物反应研究。

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作者感谢实验室和设施的其他所有成员提供的有益讨论。本研究部分由NIH基金R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987以及ALSAC资助。质谱分析在圣犹大儿童研究医院蛋白质组学设施完成，该设施部分由NIH癌症中心支持基金P30CA021765资助。作者感谢Nisha Badders在稿件编辑方面提供的帮助。

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
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<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
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<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
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<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种基于10重等重标记策略的高通量蛋白质定量方案，该方法已在多项研究中成功应用12,13,14,32。在此方案中，我们可在一次实验中同时分析多达10个不同的生物学蛋白质样本。通常可高置信度地鉴定并定量超过10,000种蛋白质。尽管等重标记技术是一种有效的蛋白质定量方法，但其定量准确性受限于比值压缩效应。本方案通过多种策略，如优化液相色谱/液相色谱（LC/LC）和串联质谱（MS/MS）参数，并结合基于y1离子的质谱后校正方法，有效消除了大部分干扰效应，从而显著提高了蛋白质定量的精确度。
在蛋白质定量中，JUMP 程序套件可通过多种方式实现。我们对每批购买的试剂均测量了同位素杂质，其值与供应商提供的证书中报告的数值略有差异。在 JUMP 软件中，使用实测的同位素杂质对报告离子的强度进行校正。一种蛋白质...

下一代测序技术的进步为研究生物系统和人类疾病带来了全新的格局。这使得对基因组、转录组、蛋白质组、代谢组及其他分子系统的大量测量成为可能。质谱法（MS）是分析化学中最敏感的方法之一，自人类基因组测序完成以来，其在蛋白质组学中的应用迅速扩展。在蛋白质组学领域，近年来基于质谱的定量分析技术取得了重大进展，包括等重标记和多重检测能力与深度液相色谱技术的结合，以及仪器设备的进步，使得检测速度更快、准确性更高，且所需样品量更少。定量蛋白质组学已成为主流方法，可用于在高度复杂的生物样本中分析数以万计的蛋白质及其翻译后修饰1,2,3,4,5,6。
多重等重标记方法，例如用于相对和绝对定量的等重标签（i.e.，iTRAQ）和串联质谱标签（TMT）质谱技术，已显著提高了样品通量，并增加了单次实验中可分析的样品数量1,6,7,8。与其他基于质谱的定量方法（如无标记定量和细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（i.e.，SILAC））相结合，这些技术在蛋白质组学领域具有巨大潜力9,10,11。例如，TMT方法利用10重试剂，可在一次实验中同时分析10个蛋白质样品。这些结构相同的TMT标签具有相同的总质量，但重同位素在碳或氮原子上的分布不同，导致每个标签在MS/MS碎裂过程中产生独特的报告离子，从而实现10个样品间的相对定量。TMT策略已被常规应用于研究生物通路、疾病进展和细胞过程12,13,14。
在不牺牲定量准确性的前提下，液相色谱（LC）–串联质谱（MS/MS）系统在液相色谱分离和质谱参数方面均取得了显著的技术进步，从而最大限度地提高了蛋白质鉴定能力。在此类鸟枪法蛋白质组学方法中，肽段的第一维分离需采用与第二维具有高度正交性的分离技术，这对于实现最佳分析结果至关重要20。高pH反相液相色谱（RPLC）的性能优于传统的强阳离子交换色谱20。当高pH RPLC与第二维的低pH RPLC联用时，分析动态范围和蛋白质覆盖率均得到提升，从而在进行全蛋白质组分析时能够鉴定出绝大多数表达的蛋白质15,16,17,18。其他技术进步包括使用小粒径C18填料（1.9 µm）和超长色谱柱（约1 m）19。此外，其他显著改进还包括具有更快扫描速度、更高灵敏度和分辨率的新一代质谱仪20，以及用于质谱数据挖掘的先进生物信息学分析流程21。
本文介绍了一种详细的实验方案，结合了最新的方法并进行了改进，以提高检测的灵敏度和通量，同时在整个实验过程中注重质量控制。该方案包括蛋白质提取与消化、TMT 10-plex 标记、碱性 pH 和酸性 pH 条件下的反相液相色谱（RPLC）分级分离、高分辨率质谱检测以及质谱数据处理（图1）。此外，我们引入了多个质量控制步骤，用于故障排查和评估实验变异。本详细方案旨在帮助刚进入该领域的研究人员常规性地从裂解物或组织中鉴定并准确量化数千种蛋白质。

<table><tbody><tr><td>1220 LC 系统</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% 盐酸羟胺</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 匀浆仪</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly Portfolio 加热器</td><td>Phoenix S&amp;amp;T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 小柱</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>馏分收集器</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>纳流 UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 μm</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>自制填充柱</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex 同重同位素标记试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge C18 柱</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18 小柱</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1 cc 50 mg 小柱</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

基于质谱（MS）的蛋白质组学已取得诸多卓越进展，尤其在液相色谱（LC）与串联质谱（LC-MS/MS）联用技术以及同重标记多重检测能力方面取得了显著技术突破。本文介绍一种深度蛋白质组学分析方案，该方案结合了10重串联质谱标签（TMT）标记、高通量的LC/LC-MS/MS平台以及质谱后计算干扰校正方法，以实现对全蛋白质组的精确定量。本方案包含以下主要步骤：蛋白质提取与消化、TMT标记、二维（2D）液相色谱分离、高分辨率质谱分析以及计算数据处理。方案中还设置了质量控制步骤，用于故障排查和评估实验变异。利用该方案可对哺乳动物样本中超过10,000种蛋白质进行可靠定量。通过少量修改，该方案亦可用于翻译后修饰的定量分析。这种多重化、稳健的方法为多种复杂样本（包括细胞培养物、动物组织和人类临床标本）的蛋白质组学分析提供了强有力的工具。

我们采用了一种先前报道过的跨物种肽段混合物，系统分析在3个主要实验步骤中比例压缩效应，包括质谱前的组分分离、质谱参数设置以及质谱后的校正23。质谱前的组分分离通过碱性pH RPLC与酸性pH RPLC联用进行评估与优化。在质谱后的分析中，仅考虑物种特异性的肽段。我们利用该干扰模型考察了LC/LC-MS/MS中的多个参数，包括MS2隔离窗口、在线LC分辨率、在线酸性pH RPLC的上样量以及离线高pH RPLC的分辨率（参见参考文献29中的图3）。
为了在离线液相色谱（LC）过程中调整分辨率，我们将等压标记的肽段分离成320个组分，然后将选定的组分合并，以调节分离能力。通过收集不同数量的组分子集（1、5、10、20、40、80和320）来测试离线LC的分辨率，同时监测干扰水平。我们发现干扰水平从16....

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。

在基于质谱（MS）的蛋白质组学领域已取得诸多卓越进展，其中液相色谱（LC）技术尤为突出……

本实验的总体目标是鉴定并准确定量不同药物处理、时间过程或生物学条件下细胞或组织裂解液中超过 10,000 种蛋白质。该方法有助于回答医学或生物学领域中的关键问题，例如哪些蛋白质在药物或其他生物学刺激作用下发生变化。该技术的主要优势在于，能够在 10 种不同的实验条件下，对超过 70% 的表达蛋白组进行准确定量。该技术的应用可拓展至通过潜在生物标志物的发现来诊断人类疾病。直观展示该方法至关重要，因为最佳的细胞裂解和液体估算是后续消化、标记和分离步骤成功的关键。开始本方案前，需获取目标培养细胞。用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤使用 10 毫升 PBS。用刮刀刮下细胞，并将洗涤后的细胞收集至含有 1 毫升 PBS 的 1.5 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下以 600 × g 离心 5 分钟。移除上清液，并在-80°C下保存，直至准备裂解细胞。解剖后应迅速收集并称量所需组织。随后立即将其置于液氮中，并在-80°C下保存。按照文本方案中的说明，在实验当天配制裂解缓冲液。将裂解缓冲液加入冷冻样品中，使缓冲液与样品的比例为10:1，最终蛋白浓度为每毫升5至10毫克。接着加入玻璃珠，使用匀浆器在4°C、速度8的条件下裂解样品，每次匀浆30秒，随后暂停5秒，重复此过程5次，或直至样品完全均质化。使用标准蛋白定量分析法或以 BSA 作为标准品的考马斯亮蓝染色 SDS 聚丙烯酰胺凝胶测定蛋白浓度。随后加入 100% 乙腈，使终浓度为 10%，并加入 Lys-C 蛋白酶，使其酶与底物的比例为 1:100。室温孵育两小时，以完成蛋白质消化。然后加入DTT，使其终浓度为1毫摩尔。在室温下孵育1小时。接着加入50毫摩尔HEPES，使样品中的尿素浓度稀释至2摩尔。按胰蛋白酶与蛋白质1:50的比例向每个样品中加入胰蛋白酶。室温孵育至少三小时。接着，加入DTT至其浓度再次达到1毫摩尔，并在室温下孵育两小时。加入碘乙酰胺，使其终浓度为 10 毫摩尔/升。室温下避光孵育 30 分钟。随后，加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为 30 毫摩尔/升，以淬灭未反应的碘乙酰胺。室温孵育30分钟。按照文本方案中所述检查胰蛋白酶消化的效率。随后，向每个样品中加入三氟乙酸（TFA），使其终浓度为1%。使用pH试纸测定每个样品的pH值，确认其在2至3之间。如有需要，逐滴加入额外的三氟乙酸（TFA）以达到不理想的 pH 值。在室温下，以 20,000 × g 离心样品 10 分钟。收集上清液，并将样品加载至预先准备好的离心柱中。在100 × g条件下离心三分钟，或直至样品完全通过层析柱，以实现样品的结合。随后，向每根层析柱中加入0.5毫升0.1%三氟乙酸（TFA）。在500 × g条件下离心30秒。此后，向每个柱中加入 125 微升含有 60% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的溶液。以 100 × g 离心 3 分钟，将肽段从柱上洗脱下来。将每个脱盐后的肽段样品重新溶解于 50 微升 50 毫摩尔的 HEPES 溶液中。使用 pH 试纸确认每个样品的 pH 值在 7 到 8 之间。接下来，将 TMT 试剂溶解于无水乙腈中，加入样品，然后在室温下孵育 1 小时。之后，使用嵌入色谱介质的 10 微升移液器吸头对每个样品的 1 微克进行脱盐，并按照文本方案中所述分析标记效率。检测六至十个不同的肽段，以确保在标记样本中未检测到未标记的肽段。然后，将每个样本约两微升混合在一起。使用嵌入色谱介质的10微升移液器吸头对此混合物进行脱盐处理。按照文本方案中所述，通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析样品。首先，将脱盐后的TMT标记肽段混合样品溶于65 µL缓冲液A中。使用pH试纸确认pH值约为8.0。如果样品仍呈酸性，可根据需要使用氢氧化铵调节pH值。接下来，按照文本方案中所述对样品进行分级分离。将馏分收集器设置为每两分钟收集一次馏分（包括上样时间），流速设置为 0.4 毫升每分钟。共收集80个组分。然后，使用真空浓缩仪将每隔一个的样品完全干燥。利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析全部80个组分，以实现超深度的蛋白质组覆盖。首先，将1.9微米C18树脂填充至内径为75微米的空柱中，使柱床体积达到约1.3微升。将色谱柱在蝴蝶式加热器内盘绕两到三圈，以确保整根色谱柱均匀受热。用胶带将色谱柱固定在加热器内部，注意不要遮盖加热器的温度传感器。然后，将色谱柱加热至 65 摄氏度。将 100 纳克大鼠脑肽样品注入 LC-MS/MS 系统，以评估系统性能。重复此评估过程一次。此后，在流过 5% 缓冲液 A 的同时，将约 0.2 微克的重组肽上样至色谱柱。洗脱肽段并按照文本方案所述使用质谱仪进行分析。本研究描述了一种采用 10 重等压标记策略对蛋白质进行高通量定量的方法。通过 LC-MS/MS 分析 TMT 标记的样品及相应的未标记样品，以检测 TMT 标记效率。可以看出，未标记的肽段峰仅出现在未标记的样品中，而TMT标记的肽段峰仅出现在标记的样品中。接下来评估MS2隔离窗口对干扰的影响。所有MS2扫描均被归类为干净扫描或噪声扫描。尽管干净的谱图仅显示赖氨酸的y1离子，但噪声谱图中赖氨酸和精氨酸均出现y1离子。此处展示了利用分别标记三种不同TMT试剂的大肠杆菌肽段进行代表性干扰去除的结果。总相对强度表明，基于y1离子的校正方法在TMT定量中更为准确。一旦掌握，若操作得当，该方案可在四到五周内完成。在实施该过程时，必须确保所有质量控制步骤均完整执行，以保证最终数据集的准确性达到最高水平。将该方法调整用于研究翻译后修饰，可回答其他科学问题，例如泛素化、磷酸化或乙酰化在疾病进展或药物处理过程中如何发生变化。该技术问世后，为产品领域研究人员探索细胞和组织中的蛋白质变化开辟了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何从哺乳动物细胞或组织中鉴定并精确量化超过 10,000 种蛋白质。请注意，操作高压 UPLC 和少数硅胶柱时可能存在极高风险，因此在执行该实验流程时，务必采取佩戴护目镜等安全防护措施。当我们开始着手解决等压标记中已知的比例压缩问题时，首次提出了该方法的想法。我们意识到，大规模分级是一种不仅能够有效缓解这一问题，而且还能增加蛋白质和肽段鉴定数量的极佳策略，从而进一步提升和优化蛋白质组分析。

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科研

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用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 15N标记 拟南芥...

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

对癌细胞蛋白质组的深入分析有助于发现新的药物靶点和诊断生物标志物。本文描述了一种实验流程，用于定量分析源自液体和实体肿瘤的癌细胞亚群中的（磷酸化）蛋白质组。该方法通过将细胞富集策略与基于定量Super-SILAC的质谱技术相结合而实现。...

源自液体和实体肿瘤的癌细胞蛋白质组的定量质谱分析

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

我们提出了一种优化的串联质量标签（TMT）标记实验方案，其中包含以下各个步骤的详细信息：蛋白质提取、定量、沉淀、消化、标记、提交至蛋白质组学平台以及数据分析。...

TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

了解等压标记结合广泛液相色谱与质谱技术进行深层蛋白质组定量分析的方法。该技术可准确鉴定超过10,000种蛋白质，适用于疾病生物标志物发现及药物反应研究。

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

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