用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

本实验的总体目标是在不同药物治疗、时间进程或生物条件下鉴定并准确定量细胞或组织裂解物中的 10， 000 多种蛋白质。这种方法可以帮助回答医学或生物学领域的关键问题，例如哪些蛋白质会因药物或其他生物刺激而发生变化。该技术的主要优点是它能够在 10 种不同的实验条件下准确定量超过 70% 的表达蛋白质组。

这项技术的影响可以通过潜在的生物标志物发现扩展到人类疾病的诊断。该方法的可视化演示至关重要，因为最佳细胞裂解和液体估计在下游消化、标记和分离程序中起着关键作用。要开始此协议，请获得感兴趣的培养细胞。

每次洗涤使用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次。将洗涤后的细胞刮擦并收集在含有 1 毫升 PBS 的 1.5 毫升管中。以 600 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。

去除上清液并储存在零下 80 摄氏度，直到准备好裂解细胞。解剖后快速收集并称重所需的组织。在此之后，立即将它们储存在液氮中并储存在零下 80 摄氏度。

如文本方案中所述，在实验当天准备裂解缓冲液。向冷冻样品中加入裂解缓冲液，使缓冲液与样品的比例为 10 比 1，最终蛋白质浓度在 5 至 10 毫克/毫升之间。接下来，加入玻璃珠，用搅拌机在 4 摄氏度下裂解样品，然后加速 8 次，混合 30 秒，然后静置 5 秒，重复 5 次或直到样品均质化。

使用标准蛋白质定量测定法或以 BSA 为标准品的考马斯染色 SDS 聚丙烯酰胺凝胶测量蛋白质浓度。在此之后，加入 100% 乙腈，使最终浓度为 10%，并且 Lys-C 蛋白酶的酶与底物比例为 1：100。在室温下孵育 2 小时，以便进行蛋白质消化。

然后加入 DTT，使最终浓度为 1 毫摩尔。在室温下孵育 1 小时。接下来，加入 50 毫摩尔 HEPES，直到样品中的尿素浓度稀释到两摩尔。

以胰蛋白酶与蛋白质的比例为 1：50 的比例向每个样品中加入胰蛋白酶。在室温下孵育至少三个小时。接下来，加入 DTT 直至其浓度再次达到 1 毫摩尔，并在室温下孵育 2 小时。

加入碘乙酰胺，使其最终浓度为 10 毫摩尔。在室温下避光孵育 30 分钟。在此之后，通过添加 DTT 淬灭任何未反应的碘乙酰胺，使其最终浓度为 30 毫摩尔。

在室温下孵育 30 分钟。检查文本方案中概述的胰蛋白酶消化效率。接下来，向每个样品中添加 TFA，使最终浓度为 1%使用 pH 试纸，测量每个样品的 pH 值，以验证其在 2 到 3 之间。

如果需要，逐滴添加额外的 TFA 以达到不可接受的 pH 值。将样品在 20， 000 倍 g 和室温下离心 10 分钟。收集上清液并将样品加载到制备的离心柱上。

以 100 x g 离心 3 分钟，或直到样品完全通过色谱柱以结合样品。接下来，向每根色谱柱中加入 0.5 mL 0.1% TFA。以 500 倍 g 离心 30 秒。

之后，向每根色谱柱中加入 125 μL 含有 60% 乙腈和 0.1 TFA 的溶液。以 100 次 g 离心 3 分钟，以洗脱柱上的肽。在 50 μL 的 50 毫摩尔 HEPES 中重构每个脱盐肽样品。

使用 pH 试纸，验证每个样品的 pH 值是否在 7 到 8 之间。接下来，将 TMT 试剂溶解在无水乙腈中，加入样品中，然后在室温下孵育 1 小时。在此之后，使用嵌入色谱介质的 10 微升移液器吸头对每个样品进行 1 微克脱盐，并按照文本方案中概述的标记效率进行分析。

检查 6 到 10 种单独的肽，以确保在标记样品中未检测到未标记的肽。然后，将每个样品大约 2 微升混合在一起。使用嵌入色谱介质的 10 微升移液器吸头对该混合物进行脱盐。

按照文本方案中的概述，通过 LC-MS/MS 分析样品。首先，将脱盐的混合 TMT 标记的肽样品溶解在 65 微升缓冲液中 A.使用 pH 试纸验证 pH 值约为 8.0。如果样品仍然是酸性的，请根据需要使用氢氧化铵调节 pH 值。

接下来，按照文本协议中的概述对样品进行分级分离。将馏分收集器设置为每两分钟收集一次馏分，包括加载时间。将流速设置为 0.4 mL/min。

总共收集 80 个馏分。然后，使用真空浓缩器完全干燥所有其他样品。使用 LC-MS/MS 分析所有 80 个馏分，以实现超深蛋白质组覆盖。

首先，将 1.9 微米 C18 填料填充到 75 微米内径的空柱中，柱床体积约为 1.3 微升。在蝶形组合加热器内将色谱柱盘绕 2 到 3 次，以确保整个长度都被加热。将色谱柱用胶带粘在加热器的内部，确保不要用胶带粘住加热器的温度传感器。

然后，将色谱柱加热至 65 摄氏度。通过 LC-MS/MS 系统运行 100 ng 大鼠脑肽，以评估系统的质量。再重复一次此评估。

在此之后，在色谱柱上加载大约 0.2 μg 重构的肽，同时流出 5% 缓冲液 A.将肽从色谱柱上洗脱出来，并按照文本方案中的概述使用质谱仪进行分析。在本研究中，描述了一种使用 10 重同量异位标记策略定量蛋白质的高通量方法。使用 LC-MS/MS 检查 TMT 标记效率，以分析 TMT 标记样品和相应的未标记样品。

可以看出，未标记的肽峰仅在未标记的样品中发现，而 TMT 标记的肽峰仅在标记的样品中发现。接下来，评估 MS2 隔离窗口对干扰的影响。所有 MS2 扫描都指定为干净扫描或嘈杂扫描。

虽然干净扫描仅显示赖氨酸的 y1 离子，但有噪声扫描同时显示赖氨酸和精氨酸的 y1 离子。此处显示了使用三种不同 TMT 试剂单独标记的大肠杆菌肽去除干扰的代表性。相对强度求和表明，基于 y1 离子的校正对于基于 TMT 的定量更准确。

一旦掌握，如果作得当，该协议可以在四到五周内完成。在尝试此过程时，确保完全完成所有质量控制步骤以确保最终数据集尽可能准确非常重要。调整该程序以专注于翻译后修饰可以回答其他问题，例如泛素化、磷酸化或乙酰化如何响应疾病进展或药物治疗而变化。

该技术开发后，为产品领域的研究人员探索细胞和组织中的蛋白质变化铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何从哺乳动物细胞或组织中鉴定和准确定量 10， 000 多种蛋白质有很好的了解。不要忘记，使用高压 UPLC 和少量硅胶色谱柱可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜。

当我们开始解决同量异位标记中出现的已知比率压缩问题时，我们首先有了这种方法的想法。我们已经意识到，广泛的分级分离不仅是缓解这个问题的好方法，而且可以增加蛋白质和肽的鉴定，这可以进一步增加和适应蛋白质组分析。