2017年12月31日
我们介绍了一个在体内成像方法使用两种不同的荧光染料跟踪动态脊髓血管变化后, 挫伤脊髓损伤成人大大鼠。
这种体内双色双光子成像方法的总体目标是监测挫伤性脊髓损伤后发生的急性脊髓血管动力学变化。这种方法可以帮助回答有关这些动态血管变化如何影响脊髓损伤后发生的病理进展和功能缺陷的关键问题。与使用亲现代样本的传统技术相比,该技术的主要优点是它为活体动物体内脊髓损伤的急性血管动力学提供了证据。
这项技术的影响延伸到脊髓损伤的治疗,因为这种方法使我们能够检查旨在早期血管修复的潜在神经保护策略。当我们发现连续注射对比鲜明的荧光颜色使我们能够可视化脊髓损伤后破裂的血管时,我们首先想到了这种双色成像方法。在开始手术之前,通过对 6 周龄雌性 Sprague Dawley 大鼠的脚趾捏无反应来确认适当的镇静水平,然后皮下注射镇痛剂和抗炎剂。
在动物乳房一侧的颈椎区域和颈部区域给大鼠剃毛,并用 Betadine 手术擦洗剂和 70% 酒精湿巾擦拭裸露的皮肤。将药膏涂在动物的眼睛上,将大鼠仰卧放在无菌手术垫上,在无菌显微镜下,将 37 摄氏度加热垫的顶部放在上面。找到锁骨附近的脉搏点,定位颈外静脉,用一把无菌小弹簧剪刀在右下颌骨尾支、肱骨大结节和柄的交点处做一个垂直切口。
使用弹簧剪刀和细镊子隔离颈静脉,并使用无菌手术缝合线结扎血管远端。接下来,用一把微型剪刀在血管壁上做一个小切口,然后将一根由 21 号针头制成的专用导管滑入血管,该针头连接到装满盐水的 1 毫升注射器上。如果有少量血液进入针头,则插入成功。
将针头固定在其近端和远端。为了稳定脊柱,将动物切换到俯卧位,并使用 15 号手术刀刀片沿中线在所需的脊柱水平切割皮肤。通过肩胛骨之间的尖刺找到第二胸椎,并从 T2 向上计数以找到 C7 椎骨。
解剖双侧颈椎第五至第七的肌肉层,露出外侧小关节,并在外侧椎骨两侧切开一道口。将改进的稳定装置的不锈钢臂滑到暴露的横向工艺刻面下,并拧紧螺钉以稳定脊柱。然后小心地取下 C5 到 C7 薄片,将一小块浸泡过盐水的凝胶泡沫放在裸露的硬脑膜上,以保持其水分。
要创建双光子成像窗口,请将小块凝胶泡沫放入肌肉和椎骨之间的间隙中,并在脊髓和椎骨之间放置一条细线凝胶泡沫。然后用组织胶水密封周围的肌肉骨骼区域。准备成功成像窗口的最关键步骤是确保窗口内没有任何轻微的出血。
让胶水干燥约 5 分钟后,在无菌的 1 毫升注射器中加入温热的 4% 琼脂,并沿窗口边缘分配一壁琼脂。琼脂会迅速凝固,同时保持柔韧性。要获得基线图像,首先去除凝胶泡沫并在窗口内添加浸入液。
将稳定的动物放入双光子显微镜暗室中,双光子成像窗口直接位于低放大倍率物镜下方,然后小心地将镜头降低到窗口中。用 0.5 毫升新鲜制备的罗丹明 B 异硫氰酸酯葡聚糖溶液填充 1 毫升无菌注射器,并将注射器连接到导管。非常缓慢地按下柱塞以使用目镜输送染料以识别感兴趣区域,并使用电荷耦合器件相机获取表面血管模式的标志性明场图像。
接下来,打开双光子成像软件打开电源并选择合适的激光激发波长。然后选择与注射荧光团实验相对应的适当双光子激光功率、HV 水平和荧光通道,并通过成像窗口对组织进行成像以收集图像和线扫描数据。要引入 C7 中线挫伤,请将大鼠放在 Louisville Injury System Apparatus 设备上,并选择 0 点设置。
然后调整组织位移,然后单击 Run experiment 以触发冲击或释放造成损伤。接下来,将一小块浸泡过盐水的凝胶泡沫放在暴露的硬脑膜上,以保持其水分,并使用相同的成像参数通过成像窗口打开新图像。将动物转移回暗室,将 0.5 毫升新鲜制备的异硫氰酸荧光素葡聚糖注入导管中。
然后将动物放回显微镜暗室并在两个荧光团通道中获得图像。罗丹明葡聚糖荧光染料注射液可以捕获具有里程碑意义的图像,用于在基线时绘制血管网络图谱。在产生中度严重的 C7 中线挫伤后,FITC-葡聚糖的引入有助于在损伤诱导的第一染料渗漏到周围实质后检测血管结构。
损伤前后血管的成像还可以量化血管直径的变化和对损伤的反应,以及计算损伤前后红细胞通过血管的速度变化。综上所述,这些数据可用于将成像血管分类为静脉或动脉。在尝试此过程时,请务必记住避免明显的呼吸伪影,并尝试限制图像窗口内的任何轻微出血。
该程序也可以在转基因动物上进行,以回答有关脊髓损伤后发生的神经血管相互作用的其他问题。观看此视频后,您应该对如何使用双光子显微镜监测活体动物挫伤性脊髓损伤后的急性血管动力学变化有很好的了解。
本研究引入了一种体内双色双光子成像方法,用于追踪Sprague-Dawley大鼠挫伤性脊髓损伤后的动态血管变化。该技术旨在提供洞见,了解这些血管变化如何影响损伤的进展和针对早期血管修复的潜在治疗策略。
Monitoring acute vascular dynamics in vivo provides critical insights into early pathophysiological mechanisms following spinal cord injury, enabling mechanistic de-risking of vascular-targeted therapeutic strategies. This approach supports predictive confidence in evaluating neuroprotective interventions by quantifying vascular leakage, blood flow, and structural changes in real time. The method enhances translational continuity by linking early vascular events to functional outcomes in preclinical models.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing dynamic vascular readouts that inform lead identification and risk-adjusted advancement decisions.