肿瘤 PD-1 的多路免疫荧光分析及量化研究+ Tim-3+ CD8+ T 单元格
2018年2月8日
研究肿瘤微环境可以确定预后或预测的标志物的临床反应免疫治疗。本文介绍了一种基于原位荧光多光谱成像的创新方法, 对 CD8+ T 细胞的各种亚群进行自动分析和计数。这种可重现和可靠的技术适用于大型队列分析。
这种多重免疫荧光分析的总体目标是根据细胞的表型自动计数细胞。该方法允许多荧光和自动细胞计数，以分析肿瘤微环境中肿瘤免疫细胞的表型和功能。这项技术有助于产生两种类型的复合预后，由直接来自肿瘤微环境的标志物预测。
通常，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为表型分型过程很长，并且生成的原始数据需要进一步处理。当我们试图表征 Annhodge miranty 细胞的表型和免疫相互作用时，我们首先想到了这种方法。解冻后，用纸巾小心擦干组织切片周围的载玻片，然后用疏水屏障笔圈住组织。
屏障干燥后，将样品在 100% 丙酮中固定 5 分钟，然后风干 2 分钟，然后在 TBS 中洗涤玻片 10 分钟。在黑暗中用 3 滴 0.1% 亲和素预处理载玻片 10 分钟，然后点击或轻弹载玻片，用亲和素溶液覆盖组织。向每个样品中加入 3 滴 01% 生物素，然后在样品上轻敲或轻弹生物素，然后进行 TBS 洗涤，如刚才所示。
然后用 100 μL 5% 正常血清的 TBS 溶液在室温下阻断任何非特异性结合 30 分钟。孵育结束时，轻敲玻片以去除多余的血清，并将玻片与 100 μL 目标一抗混合物在加湿室中孵育 1 小时。在 TBST 中洗涤抗体标记的玻片 5 分钟。
干燥后，在加湿室中用 100 μL 目标二抗混合物标记细胞 30 分钟，然后在 TBS 中洗涤 10 分钟。将干燥的二抗标记玻片与 100 μL 目标三抗混合物孵育 30 分钟，然后进行 TBS 洗涤 10 分钟。洗涤结束时，擦干载玻片并用补充 dapi 的封固剂封固组织。
然后用盖玻片覆盖每张载玻片，让封固介质凝固至少两个小时。要扫描载玻片，请打开显微镜软件并加载图像扫描协议。将第一张载玻片加载到显微镜载物台上。
然后在控制栏中，单击 Set exposure 并调整每个滤镜的曝光时间，直到获得足够但未饱和的信号。单击上部面板中的开始并打开 LabID 文件夹。输入第一张幻灯片的 ID，然后单击 下一步。
要在明场光下以 4 倍放大倍率获取载玻片的概览，请单击 单色成像 并查找标本。要选择要扫描的组织，请按 control 键并使用光标以 4 倍放大倍率选择或取消选择要扫描的感兴趣区域。要获取每个区域的荧光红/蓝/绿图像，请单击 Low power imagine。
对于高倍视野选择，按控制键并选择至少五个感兴趣区域，这些区域对应于将要以 20 倍放大倍率扫描的组织区域。然后，要获得每个场的多光谱图像采集，请单击 high power imagine，然后单击 Data storage 将图像存储在相应的实验室 ID 文件夹中。要在文件菜单下创建新项目，请选择 new project，在 find feature 菜单下，选择 cell segmentation，然后在 pheno types 菜单下，选择 pheno typing，然后单击 configure。
在 image format （图像格式） 中，选择 multi spectral （多光谱）。在样品格式中，选择 fluorescence（荧光）。要将代表性图像集成到项目中，请在文件菜单下单击打开图像，然后选择整个系列的 10-30 张代表性图像。
要去除自动荧光，请打开未染色的载玻片，然后选择文库来源和适当的荧光团。单击 Auto florescence 并在空白载玻片上选择自动荧光区域。要生成合成图像，请选择 Prepare all 以集成荧光库和自动荧光光谱。
单击眼睛图标以打开视图编辑器面板，并取消选择 autoflourescence 以修剪 autoflourescence 信号。为每个标记选择合适的颜色。要分割细胞，请在区间菜单中选择 nuclei and membrane （细胞核和膜）。
在 nuclei 菜单下，将 DAPI 设置为 nuclear counter stain。单击 segment cells 并检查细胞膜中细胞核的分割。要对细胞进行表型分析，请在表型菜单下单击 add（添加）。
要创建细胞表型类别，请为 Fluorophor 和 Fluorophor 组合选择五个以上的代表性，然后单击 train classifier。分类器正在创建一种算法，该算法为每个细胞分配具有置信区间的表型。缩放并检查细胞的表型。
然后单击 phenotype all 保存表型算法和图像项目，在文件菜单下选择 save project。然后为项目命名并保存。要对系列进行批量分析，请选择 bath analysis 并选择保存的项目。
选择用于存储批处理数据的文件夹。添加要分析的图像，然后单击 run.在分析结束时，检查合成图像的质量并验证系列中所有图像的表型。
通过荧光多光谱成像对透明肾细胞癌标本上的肿瘤浸润 CD8 阳性 T 细胞的分析显示，大约一半的 CD8 阳性 T 细胞是 PD-1 的单阳性，大约 1/3 的 PD-1 和 Tim-3 是双阳性。在组织切片上整合这些不同的细胞信号后，测量 PD-1 阳性 Tim-3 阳性与 PD-1 阳性、Tim-3 阴性 CD8 阳性 T 细胞的 PD-1 荧光强度，表明当 Tim-3 共表达时，PD-1 MFI 更高，增强了 Tim-3 表达的功能相关性。在这个代表性实验中，66% 的肾肿瘤患者的 PD-1 配体表达也呈阳性，100% 的 Tim-3 配体 Galactin-9 呈阳性。
肾细胞癌患者肿瘤组织的临床评分也显示，表达 PD-1 和 Tim-3 的肿瘤浸润 CD-8 阳性 T 细胞的数量和百分比与预后评分参数呈正相关，但 PD-1 阳性 CD-8 不表达 Tim-3 呈正相关。有趣的是，CD-8 阳性 T 细胞共表达 PD1 且 Tim 3 高于中位百分比的肾细胞癌患者更容易复发，而发现没有 Tim-3 co 表达的 PD-1 表达与患者复发无关。当我尝试此程序时，重要的是要记住，如果可能的话，与两名不同的研究人员（包括一名病理学家）一起审查细胞的表型。
按照此程序，可以执行其他事项，例如细胞术，以回答有关 x-vivo 刺激后自身表型功能影响的其他问题。开发后，这项技术为癌症领域的研究人员探索受影响器官的免疫反应铺平了道路。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种创新的多重免疫荧光分析方法，用于基于表型自动计数肿瘤免疫细胞。该技术旨在分析肿瘤微环境并识别免疫疗法反应的预后生物标志物。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 肿瘤微环境在癌症进展和治疗反应中起着至关重要的作用。
- CD8 + T 细胞对肿瘤中的免疫反应很重要。
- 现有的细胞计数方法可能耗时且需要大量数据处理。
- 本研究旨在简化免疫细胞表型的分析。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来自动计数肿瘤样本中的免疫细胞。
- 促进癌症研究中的大规模队列分析。
- 改善对肿瘤微环境内免疫相互作用的理解。
使用的方法
- 用于细胞表型分析的多重免疫荧光。
- 用于自动计数的原位荧光多光谱成像。
- 用于成像的带有疏水屏障的组织切片的制备。
- 用于分析细胞群的数据处理技术。
主要结果
- 该方法允许高效计数 CD8 + T 细胞亚群。
- 结果表明肿瘤微环境中可能衍生的预后标志物。
- 该技术是可重复的，适合大规模研究。
- 改善对肿瘤中免疫细胞动态的理解。
结论
- 这种创新方法增强了肿瘤免疫细胞的分析。
- 它为识别免疫疗法的生物标志物提供了一个框架。
- 该方法可以适应肿瘤学的各种研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence analysis enables automated quantification of immune cell phenotypes in the tumor microenvironment, supporting target validation and biomarker discovery in immuno-oncology. By measuring co-expression of inhibitory receptors such as PD-1 and Tim-3 on CD8+ T cells, the method provides predictive confidence for patient stratification and therapeutic response. This approach addresses a key discovery-stage challenge: translating spatial immune profiling into actionable insights for portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying PD-1 and Tim-3 co-expression patterns on tumor-infiltrating CD8+ T cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional target validation of exhaustion markers in renal cell carcinoma.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by linking PD-1+/Tim-3+ T-cell frequency to poor prognosis and relapse risk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized multispectral imaging and phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs through automated cell counting and segmentation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by integrating fluorescence library preparation and autofluorescence removal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through correlation of PD-1+/Tim-3+ CD8+ T cells with prognostic scoring in renal cell carcinoma.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery to preclinical validation via composite imaging and phenotype algorithm training.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying Tim-3 co-expression as a functionally relevant biomarker independent of PD-1 alone.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling immune profiling that informs target confidence and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PD-1 and Tim-3 co-expression on CD8+ T cells in the tumor microenvironment.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multispectral imaging and standardized phenotyping workflows.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as PD-1 MFI and double-positive cell percentages to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via prognostic correlation in renal cell carcinoma specimens, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune profiling across tumor types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell exhaustion pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed immunofluorescence for immune cell quantification.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early biomarker identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on PD-1+/Tim-3+ T-cell thresholds linked to relapse.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, multispectral imaging, and image analysis software for phenotyping.
- Dependent on instrumentation including fluorescence microscopes with multispectral capabilities and environmental controls for slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, exposure settings, and phenotyping algorithms across sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types, fixation methods, and antigen retrieval protocols.
- Includes practical limitations such as lengthy phenotyping procedures and complex raw data processing requiring post-acquisition quality checks.
