Name: 抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价方法，用于研究免疫学中的抗炎性巨噬细胞激活状态。该技术可测量原代小鼠巨噬细胞在体外和体内的反应，为开发炎症性疾病新疗法提供重要工具。

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L.K. 获得了不列颠哥伦比亚大学四年期研究生奖学金（4YF）。L.M.S. 获得了加拿大胃肠病学会/克罗恩病和结肠炎加拿大组织/加拿大卫生研究院新研究者薪金奖，并且是迈克尔·史密斯健康研究基金会的生物医学学者。本研究工作由加拿大血液服务中心资助的项目基金支持，并与加拿大卫生研究院合作（基金编号 # CIHR2016-LS）。

本文所述所有方法均已获得不列颠哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 骨髓巨噬细胞的衍生及其抗体激活
<ol>
	<li>使用 CO2 窒息法实施安乐死。
	<ol>
		<li>将小鼠放入诱导室中，用 5% 异氟烷麻醉 60 - 90 秒，直至小鼠不动且呼吸深而缓慢。</li>
		<li>关闭异氟烷麻醉，以 6 - 8 L/min 的流速通入 CO2，直至小鼠停止呼吸。继续维持 CO2 至少 5 分钟。确认无心跳和呼吸后，实施颈椎脱位以确保死亡。 
		注：8 - 12 周龄的小鼠可获得最高产量的巨噬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠腿部，并将其四肢伸展仰卧固定于泡沫板上。用剪刀和镊子夹住皮肤，在每条后肢表面做浅切口（0.2 cm），去除皮肤和毛发。 
	注：本步骤及所有组织培养操作均应在无菌操作台中进行。</li>
	<li>修剪肌肉以暴露胫骨和股骨。在髋关节下方和踝关节上方切断骨骼和肌肉，取出胫骨和股骨，并尽可能去除附着的肌肉。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒骨骼，静置 1 分钟使其挥发，然后将骨骼放入含骨冲洗培养基（Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM），10% 胎牛血清（FBS））的 6 孔板中。</li>
	<li>在踝端和股骨顶端各切除约 0.1 cm 骨组织，暴露骨髓腔。确保可见骨髓，并能将 26 号针头插入骨髓腔内。</li>
	<li>切断骨骼和肌肉，将胫骨和股骨从膝关节分离。将连接 10 mL 注射器的 26 号针头插入骨髓腔，用 5 mL 骨冲洗培养基冲洗骨髓至 50 mL 圆底离心管中。每只小鼠的两根胫骨和两根股骨冲洗至同一 50 mL 管中。</li>
	<li>用移液器反复吹打数次，或以低速涡旋震荡，轻柔分散骨髓团块，使骨髓条状物分散成小于 0.5 mm 的小颗粒。用骨冲洗培养基补至 50 mL。将管内液体转移至 75 cm2 组织培养处理过的培养瓶中，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。 
	注：成熟巨噬细胞和间充质细胞将贴壁并被弃去，而目标造血祖细胞则保持悬浮状态。</li>
	<li>将含造血祖细胞的培养基转移至 50 mL 圆底离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）培养基（IMDM，10% FBS，5 ng/mL MCSF，100 U/mL 青霉素/链霉素，150 μM 单硫代甘油（MTG））中。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞18。加入培养基使细胞浓度调整为 0.5 × 106 个细胞/mL（每瓶 30 mL 培养基中含 1.5 × 107 个细胞），轻柔吹打混匀。将 30 mL 细胞悬液加入新的 75 cm2 组织培养处理过的培养瓶中。</li>
	<li>在初次培养后的第 4 天和第 7 天，使用倒置相差明场显微镜观察，确认细胞已贴壁并呈轻微分支状。弃去含非贴壁细胞的培养基，用 IMDM 洗涤细胞一次，加入 30 mL MCSF 培养基。</li>
	<li>至第 10 天细胞成熟时（&#62;95% 的细胞 F4/80 和 Mac-1 表达阳性），再次确认细胞贴壁并呈轻微分支状。</li>
	<li>为进行刺激实验铺板，从培养瓶中移除培养基，加入 8 mL 无酶、含 EDTA 的细胞解离缓冲液（材料表）。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用无菌细胞刮棒施加轻微压力轻柔刮取细胞，显微镜下确认细胞已从瓶壁脱落。将解离后的细胞转移至 50 mL 圆底离心管中。用 5 mL IMDM 洗涤培养瓶 3 次，合并洗涤液与收获的细胞。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>每 50 mL 圆底离心管中用 3 mL MCSF 培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板计数活细胞18。将细胞重悬至浓度为 1 × 106 个细胞/mL，每孔加入 100 μL 细胞悬液（即每孔 1 × 105 个细胞），接种于 96 孔组织培养处理、平底板中。 
	注：一只小鼠的骨骼可获得足够接种 100 孔的细胞。如需要，也可将 1 mL 细胞悬液接种于 6 孔板（组织培养处理、平底）。若需进行 Western 印迹分析，可使用更多数量的细胞（1 × 106 个细胞）。</li>
	<li>待细胞贴壁后，对每组设置双复孔或三复孔，分别加入含 10 ng/mL LPS 的 IMDM、30 mg/mL IVIg，或 IVIg + LPS 进行刺激。LPS 或 IVIg 的剂量可根据需要滴定以优化反应效果。保留双复孔或三复孔作为未刺激对照组。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。 
	注：重新铺板的细胞应在 1 小时内贴附于组织培养孔中。</li>
	<li>将每孔的细胞上清液收集至独立的 1.7 mL 微量离心管中，以 10,000 × g 离心 5 分钟，去除任何颗粒物质。</li>
	<li>小心移除细胞上清液，避免扰动沉淀。将澄清后的细胞上清液转移至无菌微量离心管中。 
	注：细胞上清液可立即用于酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子、IL-10 及细胞因子亚基 IL-12/23p40，或长期储存于 -80 °C。请遵循商业试剂盒提供的 ELISA 操作说明（材料表）。其他促炎细胞因子（如 IL-6 和 TNF）也可检测，因为与单独使用 LPS 刺激相比，IVIg 与 LPS 共同处理可降低这些因子的表达。刺激后，贴壁细胞可用于 Western 印迹或定量聚合酶链式反应（Q-PCR）等技术分析19,20。</li>
</ol>
2. 小鼠的挑战实验 在体 内 使用静脉注射免疫球蛋白（IVIg）并收集腹腔巨噬细胞
<ol>
	<li>称量每只小鼠的体重。根据每只小鼠的体重计算所需静脉注射免疫球蛋白（IVIg，储存浓度为100 mg/mL）的体积，以提供2.5 g/kg体重的终剂量。 
	注意：例如，对于一只20 g的小鼠，需要500 µL的IVIg。</li>
	<li>将所需量的IVIg吸入一支装有无菌26号针头的1 mL无菌注射器中。对于不接受IVIg的对照组小鼠，改用等体积的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）进行注射。</li>
	<li>用一只手抓住小鼠颈部后方的皮肤，拇指和食指捏住皮肤，其余手指握住尾巴和后肢，使小鼠身体倾斜朝向地面。</li>
	<li>将针头以相对于小鼠腹部30–40°的角度插入右下腹区域，针尖斜面朝上，插入针头约1.5 cm，通过腹腔注射IVIg或PBS。注射后等待1小时。</li>
	<li>使用5%异氟烷麻醉小鼠，随后以6–8 L/min的CO2进行窒息安乐死（参见步骤1.1.1–1.1.2），或按照所在机构的伦理指南执行。</li>
	<li>将小鼠四肢展开，固定在泡沫板上。用70%乙醇喷洒小鼠体表。 
	注意：操作应在无菌操作台中进行。</li>
	<li>使用剪刀沿小鼠腹中线做一浅表皮肤切口（约0.2 cm），注意避免切开腹膜腔。用镊子将腹部皮肤向两侧拉开，暴露出完整的腹膜壁内层。</li>
	<li>用5 mL无菌注射器吸取5 mL无菌PBS（pH 7.4）。从左侧或右侧上方将25或27号针头斜面向上插入腹腔中央部位。 
	注意：应小心放置针头，确保PBS注入腹腔空间，而非直接注入器官内。</li>
	<li>将液体推入腹腔。拔出针头后，轻轻按摩腹膜10秒，以松动附着的细胞。再次从腹腔顶部插入针头，避开器官，收集灌洗液并置于冰上的15 mL锥形管中。 
	注意：每注入5 mL液体，大约可回收3.75 mL。</li>
	<li>重复注射与回收操作（步骤2.8–2.9）3次，累计注射体积达20 mL，总共回收约15 mL灌洗液。将每只小鼠的灌洗液分别收集至独立的15 mL锥形管中。 
	注意：最后一次注射后，可尝试从动物身体最左侧和右侧区域抽取液体，这些区域液体积聚较多，器官对针头的干扰较小。</li>
	<li>在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。将每只小鼠冲洗所得的细胞重悬于500 μL铺板培养基（IMDM，含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素）中。使用血细胞计数板计数活化的巨噬细胞18。 
	注意：巨噬细胞体积略大于其他腹腔细胞。使用野生型C57BL/6小鼠时，通常每只小鼠可获得5 × 105 至 1 × 106个巨噬细胞。 
	可选：若细胞沉淀中含有大量红细胞，可根据制造商说明书使用1×红细胞裂解缓冲液进行裂解去除。</li>
	<li>将细胞重悬于铺板培养基中，调整浓度为1 × 106个巨噬细胞/mL，并以每孔100 μL接种至96孔平底组织培养板中。 
	注意：若实验需设置三复孔或进行刺激剂梯度稀释，可能需要合并多只小鼠的细胞。例如，若一只小鼠获得5 × 105个巨噬细胞，则需500 μL铺板培养基，足够用于5个孔，即一个含一种LPS剂量的双重复实验。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时，使巨噬细胞贴壁。贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。移除细胞上清液及未贴壁细胞。用200 μL预热至37 °C的IMDM洗涤孔板两次，每次静置10秒后缓慢倾斜移除液体。更换新鲜铺板培养基，并在刺激前于37 °C、5% CO2条件下继续孵育30分钟。</li>
	<li>用含10 ng/mL LPS的IMDM刺激巨噬细胞，或不加刺激作为对照。孵育24小时后，收集并澄清细胞上清液（参见步骤1.16–1.17），用于ELISA检测IL-10细胞因子水平。请遵循商业试剂盒提供的ELISA操作流程（材料表）。 
	注意：刺激后，贴壁细胞可用于后续实验技术，如Western blot或PCR。</li>
</ol>
3. 小鼠挑战实验 体内 使用 IVIg + LPS 处理并收集腹腔巨噬细胞
<ol>
	<li>称量每只小鼠。计算提供 2.5 g/kg 体重终剂量所需的 IVIg（100 mg/mL 储存浓度）体积。计算提供 0.2 μg/g 体重终剂量所需的 LPS（IMDM 中 100 μg/mL 储存浓度）量。 
	注意：例如，对于一只 20 g 的小鼠，需要 500 µL 的 IVIg 储存液和 40 μL 的 100 μg/mL LPS 溶液。</li>
	<li>将所需量的 IVIg 和 LPS 抽入装有无菌 26 号针头的无菌 1 mL 注射器中。对于不接受 IVIg 的对照组小鼠，用等体积的无菌 PBS（pH 7.4）替代 IVIg。</li>
	<li>用一只手抓住小鼠颈背部皮肤，拇指和食指捏住皮肤，其余手指握住尾巴和后肢，固定小鼠。将其身体向地面倾斜。</li>
	<li>将针头以相对于小鼠腹部 30–40° 的角度，针尖斜面向上，插入右下腹区域，深度约 1.5 cm。按照步骤 2.4 的方法，腹腔注射 IVIg + LPS 或 PBS + LPS。</li>
	<li>1 小时后，通过执行步骤 2.5–2.10 收集腹腔巨噬细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。取出 1 mL 回收的灌洗液，用于按照制造商说明书进行 ELISA 检测 IL-10 和 IL-12/23p40，或在 -80 °C 冻存以备后续分析。 
	注意：为确保灌洗液细胞因子分析在不同处理组之间的准确比较，应对腹腔进行 4 次 5 mL 冲洗，最终总体积为 15 mL。每次冲洗均无法完全回收全部液体。</li>
	<li>同步骤 2.11，重悬并计数活的巨噬细胞。 
	注意：巨噬细胞体积略大于其他腹腔细胞。使用野生型 C57BL/6 小鼠时，典型产量为每只小鼠 5 × 105&#160;-&#160;1 × 106 个巨噬细胞。 
	可选：如果细胞沉淀中存在大量红细胞，可按照制造商说明书进行裂解步骤以去除红细胞，操作同步骤 2.11。</li>
	<li>同步骤 2.12，将细胞重悬于铺板培养基中。 
	注意：实验中可能需要合并多只小鼠的细胞。例如，若一只小鼠获得 5 × 105 个巨噬细胞，则需要 500 μL 铺板培养基。</li>
	<li>同步骤 2.13，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 1 小时，使巨噬细胞贴壁。</li>
	<li>按照步骤 1.14–1.15，收集并澄清所有腹腔细胞的条件培养基。 
	注意：样品可立即使用，或冻存于 -80 °C，用于后续 ELISA 检测细胞因子。</li>
	<li>执行步骤 2.11，但将细胞在未刺激条件下孵育 24 小时。按照步骤 1.16–1.17 收集并澄清细胞上清液，用于 ELISA 检测细胞因子。 
	注意：细胞也可用于如 Western blot 或 PCR 等技术处理，操作同步骤 1.16–1.17 和 2.14。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

巨噬细胞的活化状态在组织稳态和疾病中均发挥重要作用22巨噬细胞可具有不同且部分重叠的活化状态，具体取决于其微环境中所接收的信号3它们在炎症反应的各个阶段均发挥独特作用：抵御病原体、促进伤口愈合与组织修复；此外，还具有独特的抗炎激活状态，对终止炎症反应至关重要。2抗炎型巨噬细胞的活化需要两种外部刺激，以促使巨噬细胞产生大量抗炎性细胞因子IL-10，并产生少量促炎性细胞因子（如IL-12）。23一个信号来自抗体通过Fcγ受体的作用，第二个信号则是促炎刺激，例如LPS或IFNγ。24,25血清、免疫复合物和抗TNFα抗体均被发现可诱导巨噬细胞产生高水平的IL-10，从而进入抗炎性活化状态8,23,<s...

巨噬细胞是天然免疫细胞，在应对感染或损伤的免疫反应中发挥多种作用。巨噬细胞负责启动针对感染或组织损伤的免疫反应，终止炎症反应，并促进修复反应1。三种研究最为深入的巨噬细胞活化状态示例如下：1）经干扰素γ（IFNγ）和细菌脂多糖（LPS）处理的巨噬细胞，记为M(IFNγ + LPS)，这类细胞参与炎症反应；2）经白细胞介素4（IL-4）刺激的巨噬细胞，记为M(IL-4)，与修复反应相关；3）经免疫复合物（IC）和LPS共同刺激的巨噬细胞，记为M(IC + LPS)，具有关闭炎症反应的能力2,3。M(IC + LPS)与M(IL-4)型伤口修复巨噬细胞不同，不表达精氨酸酶（Arg-1）或FIZZ14。这类抗炎巨噬细胞的最佳标志是其细胞因子的产生情况5。巨噬细胞在维持健康方面具有多种功能，但也参与炎症性疾病和癌症的发生发展3。因此，巨噬细胞是治疗多种疾病的重要治疗靶点。研究抗体对其活化状态的影响，对于开发基于巨噬细胞的疾病治疗方法至关重要。
本文的重点是利用小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和腹腔巨噬细胞来检测抗体药物对炎症反应的影响 体外 和 体内最近，多项研究揭示了抗体对巨噬细胞活化的影响6,7,8巨噬细胞在免疫复合物（由抗体与抗原结合形成）和通常具有促炎作用的刺激物LPS共同激活下，会大量产生抗炎性细胞因子IL-10，而促炎性细胞因子白细胞介素12（IL-12）的产生水平则极低。9此外，已发现抗TNFα的单克隆抗体英夫利昔单抗（infliximab）部分通过其可结晶片段（Fc）区诱导抗炎型巨噬细胞而发挥作用7我们已报道，IVIg + LPS 可诱导产生抗炎型巨噬细胞活化，类似于 M(IC + LPS) 表型，其中共刺激的巨噬细胞大量分泌 IL-10，而促炎性细胞因子亚基 Interleukin 12 或 23 p40 (IL-12/23p40)、白细胞介素-6 (IL-6) 和 TNF 的分泌量则较低8IVIg 是一种由多克隆抗体（主要为 IgG）组成的药物，这些抗体来自超过 1,000 名供体的血液混合10它被用于治疗多种免疫系统疾病，例如特发性血小板减少性紫癜和慢性脱髓鞘性多神经病，但其作用机制尚未完全阐明。11基于抗体的药物对巨噬细胞活化的影响可使用本文所述方法进行评估。
可利用骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和腹腔巨噬细胞来检测特定生物制剂对巨噬细胞活化的影响。使用这些巨噬细胞来源可对原代细胞进行评估。在培养的原代细胞上进行抗体的初步测试，相比其他耗时且昂贵的疾病模型，所需时间和资金投入更少。通过将药物注射到健康小鼠体内（in vivo），随后分离细胞并进行体外分析（ex vivo），即可判断是否有必要进一步开展研究，以评估生物制剂治疗是否会影响疾病模型中的巨噬细胞活化。
鲜有研究探讨生物疗法对巨噬细胞活化的影响 体外 和 体内 直接地，我们的技术相较于其他方法具有优势。目前的技术涉及在混合细胞群体中测试生物药物的作用效果 体外，例如英夫利昔单抗在混合淋巴细胞反应（MLR）中的作用，或静脉注射免疫球蛋白（IVIg）对人外周血单个核细胞中巨噬细胞的影响，这些效应无法归因于特定的细胞类型7,12使用骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和腹腔巨噬细胞相较于使用细胞系（如RAW264.7细胞）具有优势，后者在脂多糖（LPS）刺激下无法产生促炎性细胞因子IL-128,13测试基于抗体的药物对巨噬细胞反应的影响 离体 具有优势，因为细胞因子反应可直接归因于巨噬细胞，而非通过测定血清细胞因子水平来间接推断巨噬细胞反应14骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和腹腔巨噬细胞可从基因修饰小鼠中分离获得，以确定特定蛋白在抗炎型巨噬细胞活化中的作用。例如，我们已使用 Il10 缺陷的(-/-) BMDMs 以证明 IVIg 诱导的促炎性细胞因子产生减少部分依赖于 IL-108可通过蛋白质印迹法研究药物的作用机制，以确定特定蛋白质和信号转导事件的功能。可对骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）或腹腔巨噬细胞进行定量聚合酶链式反应（qPCR），以揭示抗体激活所导致的基因表达模式。小鼠疾病模型可提供基于抗体的生物疗法在炎症性肠病、类风湿性关节炎和癌症等疾病模型中潜在疗效的信息。15,16,17然而，本文所述技术将通过确定这些生物制剂是否诱导抗炎性巨噬细胞活性，来揭示其作用机制。

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s 改良 Dulbecco&amp;rsquo;s 培养基 (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>单硫代甘油 (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1× 红细胞裂解缓冲液</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞解离缓冲液</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>无酶，基于 Hanks 液，含 EDTA</td></tr><tr><td>脂多糖 (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>来源于大肠杆菌 E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供</td><td></td></tr><tr><td>静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供</td><td></td></tr><tr><td>静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)（无菌），pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-12/23p40 ELISA 试剂盒</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>抗 Erk1/2 抗体</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗 pp38 抗体</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 号针头</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;组织培养处理培养瓶</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>细尖头，用于解剖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>精细型，4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub>"</td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>倒置相差显微镜</td></tr><tr><td>天平&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

抗体类药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化影响的评估

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

巨噬细胞是具有吞噬功能的天然免疫细胞，可启动针对病原体的免疫应答，并参与组织修复与再生。巨噬细胞在终止炎症反应过程中同样发挥重要作用。我们已证实，经静脉注射免疫球蛋白（IVIg）刺激的巨噬细胞在受到细菌脂多糖（LPS）刺激时，可产生大量抗炎性细胞因子白细胞介素10（IL-10），同时分泌较低水平的促炎性细胞因子。IVIg是一种多价抗体，主要成分为来自超过1,000名献血者血浆混合的免疫球蛋白G（IgGs），用于补充免疫缺陷患者的抗体，或抑制自身免疫性疾病及炎症性疾病患者的免疫反应。此外，治疗性抗肿瘤坏死因子α（TNFα）抗体英夫利昔单抗（infliximab）也被证实可激活巨噬细胞，在炎症刺激下产生IL-10。IVIg及其他基于抗体的生物制剂可用于检测其对巨噬细胞活化的影响。本文描述了由小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离、抗体刺激及其活化评估的方法 体外 以及用抗体激活的小鼠腹腔巨噬细胞 体内最后，我们展示了如何利用蛋白质印迹法（western blotting）来确定特定细胞信号通路在抗炎型巨噬细胞活性中的作用。这些实验方案可用于基因修饰小鼠，以评估特定蛋白对抗炎型巨噬细胞活化的影响。这些技术还可用于评价特定生物制剂是否通过诱导巨噬细胞转化为可产生IL-10的抗炎活化状态，从而减轻炎症反应。 体内这可以提供关于巨噬细胞活化在小鼠疾病模型中对抗体类生物制剂疗效所起作用的信息，并有助于揭示其在人体中可能存在的新作用机制。相反，这也可能警示在治疗感染性疾病时应谨慎使用特定的抗体类生物制剂，特别是当巨噬细胞在宿主抵御该感染中发挥重要作用时。

从小鼠骨髓中分离的骨髓源性巨噬细胞可由骨髓穿刺物中的造血细胞前体体外培养获得。一只C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓穿刺物混合后通常可获得10⁷个细胞7 骨髓来源的巨噬细胞，是实验中获取巨噬细胞的便捷来源。在受到炎症刺激时，BMDMs可用于检测基于抗体的药物反应 体外. 图1 表明静脉注射免疫球蛋白品牌 Gammunex（GX）联合 LPS 可使抗炎细胞因子 IL-10 的产量较单独使用 LPS 刺激增加 7 倍（图1A) 并减少 IL-12/23p40 的产生（图1B). 图1 还表明不同的静脉注射免疫球蛋白（IVIg）制剂具有不同的效果。尽管三种不同的IVIg制剂均能显著降低IL-12/23p40<strong class="...

基于抗体的药物已彻底改变了炎症性疾病的治疗方法。除了对特定靶点产生直接作用外，抗体还可激活巨噬细胞，使其转化为抗炎表型。本实验方案描述了如何评估抗炎巨噬细胞的活化状态。 体外 使用小鼠骨髓来源巨噬细胞，以及 体内 使用腹腔巨噬细胞。

巨噬细胞是具有吞噬功能的先天免疫细胞，可启动针对病原体的免疫反应，并参与愈合过程及组织修复。巨噬细胞……

这些实验的总体目标是利用小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞，确定基于抗体的药物对抗炎性巨噬细胞活化状态的影响。该方法有助于回答免疫学领域中的关键问题，例如，特定的抗体药物是否通过将巨噬细胞转变为产生IL-10的抗炎性活化状态而发挥作用。该技术的主要优势在于，它能够分别在体外检测来自骨髓的原代小鼠巨噬细胞的反应，以及在体内检测腹腔巨噬细胞的反应。在无菌操作台中进行此操作。将已处死的小鼠仰卧固定于泡沫板上，四肢伸展。然后用70%乙醇清洁腿部。接下来，进行约两毫米深的浅层切割，以去除后肢表面的皮肤和毛发。然后解剖组织，暴露胫骨和股骨。去除胫骨和股骨时，需在髋关节下方以及踝关节上方切断骨骼和肌肉。然后，尽可能去除骨骼上的肌肉组织。接着，用70%乙醇清洗骨骼，并静置挥发1分钟。随后，将骨骼放入装有骨组织培养基的六孔板中。在培养板中，从股骨两端各修剪掉一毫米，以暴露其内部腔隙。确保26号针头能够进入这些腔隙。接着，将胫骨和股骨从膝关节处分离。然后，将连接在10毫升注射器上的针头插入骨腔，收集骨髓。将四根骨中的骨髓全部抽入含有5毫升骨髓培养基的50毫升锥形管中。用移液器反复吹打培养基和骨髓数次。或者以低速涡旋，轻轻分散悬液中的团块。骨髓条应被打散成小于半毫米长的细小碎片。接着，用骨组织培养基将管内液体补至50毫升，并将其转移至75平方厘米的组织培养瓶中。将骨髓孵育一小时。在孵育过程中，成熟细胞会贴附于培养瓶上，而所需的造血祖细胞则保持悬浮状态。将悬浮液转移至50毫升锥形管中，离心使细胞沉淀成团。随后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 毫升 MCSF 培养基中。然后调整细胞密度至每毫升 500,000 个，并将 30 毫升细胞悬液接种至新的 75 平方厘米培养瓶中。继续培养细胞，并在第 4、7 和 10 天使用倒置相差断场显微镜观察，确认细胞贴壁并呈轻微分支状。观察细胞时，弃去含有非贴壁细胞的培养基。随后用IMDM洗涤贴壁细胞一次，并向培养瓶中加入30毫升新鲜的MCSF培养基。第10天时，更换为8毫升不含酶的EDTA细胞解离缓冲液，以收集细胞。短暂孵育细胞，然后轻轻刮下细胞，并在显微镜下确认细胞是否已脱落。待细胞完全脱落后，将含有细胞的缓冲液转移至50毫升锥形管中。随后用5毫升IMDM冲洗培养瓶三次，以收集更多细胞。收集所有样品，离心后将沉淀重悬于 3 mL MCSF 中。随后对细胞进行计数，并调整细胞浓度至每毫升一百万个。然后每孔加入 100 µL 细胞悬液，接种于 96 孔平底板中。整个培养板应可加样。将细胞培养约一小时，直至其贴壁。然后使用不同浓度的LPS或静脉注射免疫球蛋白，或两者混合物（以IMDM培养基配制）进行刺激。所有操作均需设置重复组（双复孔或三复孔），并务必保留未处理的对照组。随后将细胞培养24小时，并分析上清液。用一毫升注射器准备所需剂量的静脉注射免疫球蛋白和脂多糖（LPS），并安装26号针头。作为对照，改用 PBS 加 LPS。用一只手抓住小鼠颈背部皮肤，同时固定其臀部和尾巴。瞄准腹部右下象限，将针头斜面向上，以 30 至 40 度角插入，深度约为 1.5 厘米。然后注射推注剂量。一小时后，在处死小鼠后收集腹腔巨噬细胞。在无菌操作台内，将已处死的小鼠四肢展开固定于泡沫板上，并用70%乙醇消毒腹部。然后，沿中线做一道约两毫米深的浅切口，剥离腹部皮肤，注意避免刺破腹膜壁。接着，用 pH 7.4 的无菌 PBS 完全充满一支 5 毫升注射器，使用 25 或 27 号针头，从腹部一侧向中线方向、在腹腔顶部进针，针尖斜面朝上，对小鼠进行注射。拔出针头后，按摩腹膜10秒以使细胞脱落。然后再次将针头插入腹腔，收集约3.75毫升灌洗液。将灌洗液转移至预冷的15毫升锥形管中，置于冰上。重复注射、按摩并收集灌洗液三次，将所有收集的液体合并至同一管中。最后一次收集时，可从小鼠远端更易抽出灌洗液。随后离心沉淀细胞，并将细胞重悬于 500 µL 铺板培养基中。然后计数活的巨噬细胞，并将其重悬于每毫升含一百万个细胞的悬液中。接着，将100微升悬液加入96孔平底板的各孔中。随后，将细胞孵育1小时。腹腔巨噬细胞将贴附于培养板上。随后，去除未贴壁的细胞，并用200微升预热的IMDM培养基洗涤每孔两次。每次洗涤后，静置10秒，然后缓慢倾斜培养板以吸去洗液。洗涤后，重新加入 100 微升铺板培养基，并将培养板放入培养箱中。进行 ELISA 时，继续将细胞在无刺激条件下培养 24 小时，然后收集并澄清条件培养基，用于细胞因子分析。在体外受到炎症刺激时，BMDM可用于测试基于抗体的药物反应。与单独使用LPS刺激相比，静脉注射免疫球蛋白联合LPS可使抗炎细胞因子IL-10的产量增加七倍，并降低IL-12/23p40的产生。此外，单独使用静脉注射免疫球蛋白或联合LPS刺激均可增强MAP激酶ERK1/2的活化，表现为早期且持续的磷酸化。P-38的活化也更早发生。此外，与注射PBS的小鼠相比，经体外刺激后，腹腔巨噬细胞显著增加了IL-10的产生。随后评估了灌洗液以及体外刺激的腹腔巨噬细胞上清液中的细胞因子产生情况。当小鼠接受静脉注射免疫球蛋白和脂多糖（LPS）刺激时，灌洗液、腹腔细胞和腹腔巨噬细胞中的IL-10水平均升高。相比之下，促炎性细胞因子亚基IL-12/23p40在培养的腹腔巨噬细胞中显著减少，但在灌洗液中未见减少。观看本视频后，您应充分了解如何利用小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞，在体外和体内实验中检测基于抗体的药物对巨噬细胞活化状态的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

在本视频中，我们演示了骨髓来源巨噬细胞在细菌脂多糖和静脉注射免疫球蛋白刺激下的活化过程。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞对抗体刺激的活化

本视频展示了使用静脉注射免疫球蛋白和细菌脂多糖激活小鼠腹腔巨噬细胞的方法。共刺激可将腹腔巨噬细胞激活为具有免疫调节活性的抗炎型巨噬细胞。...

小鼠模型中抗体诱导腹腔巨噬细胞的体内活化

在本视频中，我们展示了不同抗 c-fms...

抗C-fms抗体对小鼠骨髓细胞体外破骨细胞生成的影响

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。...

骨髓来源巨噬细胞的制备

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

在此，我们介绍一种实验方案 体内 GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）对初始CD4...

一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的 小鼠模型

本方案包括小鼠长骨的解剖和骨髓分离，以获取骨髓巨噬细胞，并利用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）或肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导生成破骨细胞，同时可通过抗c-fms抗体（即M-CSF受体）阻断该过程。...

抗c-fms抗体对破骨细胞体外形成及破骨细胞前体增殖的影响

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。...

小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

了解抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价方法，用于研究免疫学中的抗炎性巨噬细胞激活状态。该技术可测量原代小鼠巨噬细胞在体外和体内的反应，为开发炎症性疾病新疗法提供重要工具。

抗体类药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化影响的评估

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