抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价
December 26th, 2017
抗体药物对炎症性疾病进行了革命性的治疗。除了对特定靶点产生直接影响外, 抗体还能激活巨噬细胞成为抗炎药。该协议描述了如何抗炎巨噬细胞活化可以评估在体外,使用小鼠骨髓巨噬细胞, 和在体内,使用腹腔巨噬细胞。
这些实验的总体目标是确定基于抗体的药物对使用小鼠骨髓和腹膜巨噬细胞的抗炎巨噬细胞活化状态的影响。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如，特异性抗体药物是否通过将巨噬细胞转变为产生抗炎激活状态的 IL-10 来发挥作用。该技术的主要优点是，它在体外测量来自骨髓和体内腹膜腔的原代小鼠巨噬细胞的反应。
在无菌罩中执行此程序。将安乐死的老鼠仰卧在泡沫板上，四肢伸展。然后，用 70% 乙醇清洁腿部。
接下来，做一个大约两毫米深的浅切口，以去除每条后腿表面的皮肤和毛皮。然后，解剖组织以进入胫骨和股骨。要去除胫骨和股骨，请切开髋关节下方和脚踝上方的骨骼和肌肉。
然后，从骨骼中去除尽可能多的肌肉组织。接下来，用 70% 乙醇清洁骨头，并让它蒸发一分钟。然后，将骨头放入装满骨肉培养基的六孔板中。
在板中，从股骨的两端修剪一毫米，以便露出它们的内腔。确保 26 号针头可以进入腔体。接下来，将胫骨和股骨与膝关节分开。
然后，将 10 毫升注射器上的针头插入骨腔并收集骨髓。将骨髓从所有四块骨头中拉入装有 5 毫升骨肉培养基的 50 毫升锥形管中。将培养基和骨髓上下输送数次。
或者以低速涡旋以轻轻分散悬浮液中的团块。应将一串串骨髓分成长度小于半毫米的小骨髓斑点。接下来，用骨肉培养基将试管加满至 50 毫升，然后将其转移到 75 平方厘米的组织培养瓶中。
将骨髓孵育一小时。在孵育过程中，成熟的细胞将粘附在培养瓶上，所需的造血祖细胞将保持悬浮状态。将悬浮液转移到 50 mL 锥形管中，然后将细胞旋转成沉淀。
接下来，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml MCSF 培养基中。然后将细胞密度调整为每毫升 500， 000，并将 30 毫升装入新的 75 平方厘米培养瓶中。继续培养细胞，在第 4 天、第 7 天和第 10 天，使用倒置相差壁场显微镜验证细胞是否贴壁并略微分枝。
检查细胞时，丢弃含有非贴壁细胞的培养基。然后用 IMDM 洗涤贴壁细胞一次，并将 30 毫升新鲜的 MCSF 培养基加入烧瓶中。第 10 天，用 8 毫升不含酶的基于 EDTA 的细胞解离缓冲液替换培养基以收集细胞。
短暂孵育细胞，然后轻轻刮擦细胞，并使用显微镜验证它们是否已释放。释放细胞后，将缓冲液与细胞一起转移到 50 mL 锥形管中。然后用 5 ml IMDM 冲洗培养瓶 3 次以收集更多细胞。
拉出所有收集物，离心它们并将沉淀重悬于 3 毫升 MCSF 中。现在，对细胞进行计数并将其浓度调整为每毫升 100 万。然后将每孔 100 微升细胞悬液接种在 96 孔平底板中。
整个板应该是可填充的。将细胞培养约一小时，直到它们粘附。然后用 IMDM 中制备的不同浓度的 LPS 或静脉注射免疫球蛋白或两者刺激它们。
一式两份或一式三份执行所有作，并确保保留未经处理的对照。然后将细胞孵育 24 小时并分析上清液。准备一个装有所需量的静脉注射免疫球蛋白和 LPS 的 1 毫升注射器，并连接一个 26 号针头。
对于对照，请改用 PBS 加 LPS。抓住老鼠的骷髅，同时用一只手固定它的后躯和尾巴。瞄准腹部右下象限，以 30 至 40 度角插入针头，斜面向上，插入约 1.5 厘米。
然后注射推注。一小时后，在对小鼠实施安乐死后收获腹膜巨噬细胞。在无菌罩中，将安乐死的小鼠固定在四肢张开的泡沫板上，并用 70% 乙醇对腹部进行消毒。
然后，沿中线做一个两毫米的浅切口，并拉出腹部皮肤。避免刺穿腹膜壁。接下来，将 pH 值为 7.4 的无菌 PBS 装满 5 毫升注射器，并使用 25 或 27 号针头在腹膜腔顶部从两侧朝中线注射小鼠，针头的斜面向上。
拔出针头后，按摩腹膜 10 秒以去除细胞。现在，再次将针头插入腔中，并收集约 3.75 毫升的灌洗液。将灌洗液转移到冰上的 15 毫升锥形管中。
再重复注射、按摩和收集灌洗液 3 次，然后将所有收集物拉入同一根管中。在最终收集过程中，从鼠标的远端抽出灌洗液可能更容易。接下来，离心细胞，并将其重悬于 500 μL 电镀培养基中。
然后对活的巨噬细胞进行计数，并以每毫升 100 万的浓度重悬。现在，将 100 微升悬浮液接种到 96 孔平底板的孔中。接下来，将细胞孵育一小时。
腹膜巨噬细胞会粘附在板上。然后，去除非贴壁细胞，并用 200 微升温热的 IMDM 冲洗每个孔两次。每次洗涤后，等待 10 秒钟，然后慢慢倾斜板以拉出漂洗液。
洗涤后，加入 100 微升电镀培养基，然后将板放入培养箱中。对于 ELISA，继续在没有刺激的情况下孵育细胞 24 小时。然后收集并澄清用于细胞因子分析的条件培养基。
BMDM 可用于在体外受到炎症刺激时测试基于抗体的药物反应。与单独 LPS 刺激相比，静脉注射免疫球蛋白和 LPS 可增加抗炎细胞因子 IL-10 的产生 7 倍。它减少了 IL-12/23p40 的产生。
此外，单独静脉注射免疫球蛋白刺激或与 LPS 联合刺激可增加 MAP 激酶 ERK1/2 的激活，伴有早期和长期磷酸化。P-38 的激活也发生得更早。此外，与 PBS 注射小鼠相比，腹膜巨噬细胞在体外刺激下显着增加了 IL-10 的产生。
接下来评估灌洗液和离体刺激的腹膜巨噬细胞上清液中细胞因子的产生。当小鼠接受静脉注射免疫球蛋白和 LPS 攻击时，灌洗液、腹膜细胞和腹膜巨噬细胞中 IL-10 升高。相比之下，促炎细胞因子亚基 IL-12/23p40 的产生在培养的腹膜巨噬细胞中显着减少，但在灌洗液中则没有。
看完这个视频，你应该对如何使用小鼠骨髓和腹膜巨噬细胞在体外和体内测试抗体药物对巨噬细胞活化状态的影响有一个很好的了解。
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概述
本文概述了一种评估抗体药物诱导的抗炎巨噬细胞活化的协议。它详细说明了体外评估小鼠骨髓巨噬细胞和体内腹腔巨噬细胞的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 药理学
背景
- 基于抗体的疗法已经改变了炎症性疾病的治疗方法。
- 巨噬细胞在炎症中起着关键作用，可以被激活为抗炎状态。
- 理解巨噬细胞活化可以导致更好的治疗策略。
- 本研究聚焦于特定抗体药物对巨噬细胞行为的影响。
研究目的
- 调查抗体药物如何影响巨噬细胞的活化状态。
- 确定这些药物是否能够促进巨噬细胞产生IL-10的抗炎活化状态。
- 提供一种研究原代小鼠巨噬细胞的可靠方法。
使用的方法
- 从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓巨噬细胞。
- 用LPS和免疫球蛋白培养和刺激巨噬细胞。
- 采集并分析注射治疗后的腹腔巨噬细胞。
- 通过上清液分析评估巨噬细胞的活化状态。
主要结果
- 成功分离和培养了骨髓和腹腔巨噬细胞。
- 证明了巨噬细胞活化状态对抗体治疗的响应。
- 为未来巨噬细胞生物学研究提供了详细的方法。
- 强调了巨噬细胞活化在治疗背景下的重要性。
结论
- 基于抗体的药物可以有效改变巨噬细胞的活化状态。
- 该协议作为免疫学研究的宝贵工具。
- 需要进一步研究以探讨这些发现在临床环境中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Evaluating the effects of antibody-based drugs on murine macrophage activation provides critical insight into immunomodulatory mechanisms relevant to biologic drug development. This approach enables mechanistic de-risking by clarifying whether candidate therapeutics induce anti-inflammatory states, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Understanding macrophage responses informs portfolio decisions, especially for biologics targeting immune pathways in inflammatory and autoimmune indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antibody-induced macrophage polarization.
- Supports biological de-risking by quantifying anti-inflammatory cytokine production, such as IL-10.
- Clarifies pathway engagement and functional target validation for antibody-based candidates.
- Facilitates predictive confidence in advancing immunomodulatory biologics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary macrophage systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes cytokine quantification assays for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables robust measurement of drug-induced changes in macrophage activation states.
- Supports reliable evaluation of candidate biologics in immune cell-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo macrophage activation data with disease-relevant models in mice.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for biologics with immune-modifying activity.
- Supports mechanistic de-risking for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of antibody-based drugs on primary macrophages both in vitro and in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-induced anti-inflammatory macrophage states and pathway activation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cytokine readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as IL-10 and IL-12/23p40 levels for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models to inform biomarker alignment and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse antibody-based biologics across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulatory drug development.
- Operational Value: Standardizes macrophage activation assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for biologics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated immune mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary immune cell isolation and cytokine quantification.
- Needs access to sterile tissue culture, ELISA, and western blotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to genetically modified mouse models for mechanistic studies.
- Limited by species differences and the need for careful interpretation of murine data for human translation.
