Name: 念珠菌光滑全基因组测序检测抗真菌耐药性标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 了解全基因组测序技术如何检测光滑念珠菌的抗真菌耐药性基因突变。该方法通过分析基因变异与药物敏感性谱的相关性，为临床诊断和耐药菌监测提供重要依据。

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本工作由传染病与微生物学中心公共卫生部门资助。作者未获得本研究的其他任何资金支持。作者感谢Alicia Arnott博士、Nathan Bachmann博士和Ranjeeta Menon博士在全基因组测序实验中提供的专业建议和协助。

本研究无需伦理审批。
1. Candida glabrata 的传代培养与接种物制备
<ol>
	<li>选择一组待研究的C. glabrata分离株，其中应至少包含一株具有已知药敏模式的C. glabrata美国典型培养物保藏中心（ATCC）菌株。</li>
	<li>使用无菌的一次性塑料接种环挑取单个菌落，并在沙保葡萄糖琼脂（SDA）平板上划线接种进行传代培养8。</li>
	<li>将SDA平板在35 °C条件下孵育24–48小时，以获得生长良好的纯培养物。</li>
</ol>
2. 抗真菌药物敏感性测定
<ol>
	<li>使用无菌一次性塑料接种环，从 SDA 平板上新传代的 C. glabrata 分离株中挑取 4–5 个直径约 1 mm 的菌落，重悬于 3 mL 无菌蒸馏水中。通过轻柔吹打混匀，获得均匀的菌悬液。</li>
	<li>使用比浊仪将菌液浓度调整至 0.5 麦氏浊度，相当于 1 × 106 至 5 × 106 个细胞/mL8。</li>
	<li>根据制造商说明，使用商用检测试剂盒（参见材料与试剂表）对所有 C. glabrata 分离株进行药敏试验。依据 CLSI 指南，根据抗真菌药物的最低抑菌浓度（MIC）结果判读分离株的敏感性，并出具报告（表 1）8。</li>
</ol>
3. 用于测序的基因组DNA提取
<ol>
	<li>从新培养的SDA平板上取一环菌落，重悬于含有50 mM EDTA的300 µL溶液中，置于1.5 mL离心管内。</li>
	<li>向悬液中加入40 µL溶壁酶（10 mg/mL），轻轻吹打5次，直至悬液均匀。</li>
	<li>将样品在37 °C孵育1–2小时以消化细胞壁，随后在室温下冷却5分钟。</li>
	<li>将悬液在14,000 × g 离心2分钟，然后小心移除上清液。</li>
	<li>按照DNA提取试剂盒的操作说明提取基因组DNA（参见材料表）。</li>
	<li>将提取的DNA沉淀重悬于50 µL的10 mM Tris缓冲液（pH 7.5–8.5）中，而非试剂盒提供的洗脱缓冲液。</li>
	<li>通过测定260/280 nm处的光密度（O.D）来检测DNA纯度25。</li>
</ol>
4. 基因组DNA定量
<ol>
	<li>根据试剂盒制造商的指南，配制用于荧光检测的1x Tris EDTA（TE）缓冲液（参见材料表）。</li>
	<li>在一次性96孔板中，将2 µL DNA样品加入98 µL的1x TE检测缓冲液中进行稀释（终体积为100 µL，稀释倍数为1:50）。此稀释步骤可使用多通道移液器手动操作，也可通过自动化液体处理工作站完成。</li>
	<li>使用荧光检测试剂盒中提供的λ DNA（100 µg/mL）配制一系列标准品（见表2），并在检测时与样品一同测量。</li>
	<li>向100 µL稀释后的DNA样品和标准品中各加入100 µL荧光染料进行反应。室温避光孵育5分钟。</li>
	<li>根据制造商的指南测量所有样品的荧光值。</li>
	<li>利用荧光读数绘制标准曲线，并计算DNA样品的原始浓度。</li>
	<li>确定需添加的DNA体积和10 mM Tris缓冲液（pH 8）体积，以将DNA浓度调整至0.2 ng/µL。</li>
	<li>使用自动化液体处理工作站进行DNA稀释。此步骤也可通过手动移液完成。</li>
</ol>
5. DNA文库构建
注意：文库构建和测序均按照公司提供的制造商方案和指南进行（图1A）（见材料表）。
<ol>
	<li>片段化与PCR扩增
	<ol>
		<li>标记一个新的96孔硬壳薄壁板。</li>
		<li>向板中每个样本孔加入5 µL定量的输入DNA（浓度为0.2 ng/µL，总量为1 ng）。</li>
		<li>向含有DNA的每个孔中加入10 µL片段化缓冲液和5 µL扩增缓冲液，并轻轻吹打混匀。使用粘性板封膜密封板。</li>
		<li>将板放入热循环仪中，运行以下PCR程序：55 °C孵育5分钟，然后保持在10 °C。当样品温度达到10 °C时，立即进行中和反应。</li>
		<li>向板中加入5 µL中和缓冲液以终止扩增反应，并轻轻吹打混匀。密封板后在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>向样本中加入15 µL索引PCR预混液。</li>
		<li>使用一套适用于96孔板格式的索引引物管，确保每个样本根据索引模板（表3）获得唯一的索引组合。</li>
		<li>按照表3模板中提供的顺序，将索引引物管排列在索引板架上（图1B），并记录索引在模板中的位置。</li>
		<li>将已加入PCR预混液的片段化板放置在装有按序排列索引引物管的索引板架上。</li>
		<li>将索引引物1管垂直排列，索引引物2管水平排列于索引架上。使用多通道移液器，小心地向每个样本孔加入5 µL索引引物。</li>
		<li>用新盖替换旧的索引引物管盖，以避免不同索引之间的交叉污染。</li>
		<li>使用96孔透明板封膜密封板，并执行第二次PCR扩增：95 °C预变性30秒，随后进行12个循环（95 °C变性10秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物纯化
	<ol>
		<li>将片段化板中的PCR产物转移至深孔板中，用于PCR纯化（参见材料表）。</li>
		<li>根据生产商说明书涡旋振荡商用磁珠溶液（参见材料表），并向深孔板中每个PCR产物加入30 µL磁珠。</li>
		<li>将板置于微孔板振荡器上，以1800 rpm振荡2分钟，随后在室温下静置孵育5分钟。</li>
		<li>将板置于磁力架上2分钟，直至上清液澄清。</li>
		<li>保持板在磁力架上，小心弃去上清液。</li>
		<li>在磁力架上的板中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇。</li>
		<li>在磁力架上孵育30秒，小心移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。</li>
		<li>重复洗涤步骤一次，并让磁珠在空气中干燥15分钟。如有残留乙醇，应彻底去除。</li>
		<li>将板从磁力架上取下，向磁珠中加入52.5 µL重悬缓冲液。</li>
		<li>将板置于微孔板振荡器上，以1800 rpm振荡2分钟，随后在室温下静置孵育2分钟。</li>
		<li>将板放回磁力架，等待上清液澄清。</li>
		<li>使用多通道移液器，小心地将纯化板中50 µL上清液转移至新的硬壳板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库标准化
	<ol>
		<li>根据生产商指南解冻文库标准化试剂（参见材料表）。</li>
		<li>将纯化板中的20 µL上清液转移至新的深孔板中。</li>
		<li>加入45 µL磁珠悬浮液，并用板封膜密封板。</li>
		<li>将板置于微孔板振荡器上，以1800 rpm振荡30分钟。此孵育时间至关重要，不得超时。</li>
		<li>将板置于磁力架上2分钟，确认上清液已澄清（图1B）。</li>
		<li>保持板在磁力架上，将上清液移除并弃入适当的危险废物容器中。</li>
		<li>将板从磁力架上取下，用45 µL洗涤缓冲液清洗磁珠。</li>
		<li>将含洗涤缓冲液的板置于微孔板振荡器上，以1800 rpm振荡5分钟。</li>
		<li>将板放回磁力架2分钟，待液体澄清后弃去上清液。</li>
		<li>将板从磁力架上取下，再次用洗涤缓冲液重复洗涤一次。</li>
		<li>将板从磁力架上取下，向每孔加入30 µL 0.1 N NaOH。</li>
		<li>将含0.1 N NaOH的板置于微孔板振荡器上，以1800 rpm振荡5分钟，随后放回磁力架2分钟或直至液体澄清。</li>
		<li>向新的96孔硬壳薄壁最终标准化文库板的每孔中加入30 µL洗脱缓冲液。</li>
		<li>将标准化板中的30 µL上清液转移至最终标准化文库板中，使最终体积为60 µL。此时文库已准备好用于测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过qPCR测定DNA文库浓度
	<ol>
		<li>根据生产商指南解冻qPCR试剂盒中提供的预混液、引物和标准品（参见材料表）。</li>
		<li>按照生产商说明书，将qPCR试剂盒中的PCR试剂预混液和引物混合，分装后可储存于-20 °C。</li>
		<li>为测定DNA文库浓度，使用10 mM Tris缓冲液（pH 8）对DNA文库进行1/8000稀释：先进行1:100稀释（1.5 µL DNA文库加入148.5 µL Tris缓冲液），再进行1:80稀释（取1:100稀释液2 µL加入158 µL Tris缓冲液）。</li>
		<li>将稀释板在700 rpm下振荡至少1分钟，随后在14000 × g下离心1分钟。</li>
		<li>通过混合4 µL稀释后的DNA文库或DNA标准品与16 µL预混液，配制20 µL最终PCR反应体系。</li>
		<li>按照生产商设定的程序在热循环仪中进行PCR扩增：95 °C预变性5分钟，35个循环（95 °C变性30秒，60 °C退火45秒），最后进行65 °C至95 °C的熔解曲线分析。</li>
		<li>从qPCR热循环仪中获取样本DNA文库和标准品的Ct值。</li>
		<li>根据标准品的Ct值生成标准曲线（图2）。通过均值±3个循环定义质控上下限范围。例如，若平均Ct值为13个循环，则质控范围为10至16个循环。</li>
		<li>根据标准曲线和Ct值确定各个文库浓度及平均文库浓度（ALC）。</li>
		<li>根据以下计算公式确定用于最终测序的总混合文库（PAL）体积，目标文库浓度应在1.4–1.8 pM之间。 
		注意： qPCR测得的平均文库浓度 = ALC；总混合文库（PAL）= ALC / 2；变性后的PAL（DAL）= PAL × 0.666 
		根据DAL与缓冲液混合的体积，决定加入流动池的文库浓度。例如，若将65 µL文库加入835 µL缓冲液中，则从此稀释液（Dil 1）中取195 µL加入总体积1300 µL中：(65/900) × dnPAL = Dil1 
		Dil1 × (195/1300) = 最终浓度（应在1.4–1.8 pM之间）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 文库合并及在台式测序仪中启动测序
<ol>
	<li>根据制造商的说明解冻试剂盒。从4 °C保存的包装中取出新的流动池，并在测序前至少30分钟置于室温下。取出缓冲液盒，并在使用前预冷测序缓冲液（见材料表）。</li>
	<li>通过混合5 µL文库（1 nM）和5 µL 0.2 N NaOH制备对照文库。短暂涡旋，室温孵育5分钟，使对照文库变性为单链。</li>
	<li>加入5 µL 200 mM Tris-HCl（pH 7），涡旋混匀。再加入235 µL预冷的测序缓冲液，轻轻混匀。总体积为250 µL，对照文库终浓度为20 pM。</li>
	<li>将待测序的各样本文库从最终归一化的文库板中各取5 µL转移至同一个低吸附的1.5 mL离心管中，进行DNA文库混合。</li>
	<li>在另一个低吸附离心管中加入30 µL混合文库和30 µL 0.2 N NaOH，以使文库变性。</li>
	<li>涡旋低吸附离心管，室温孵育5分钟，使文库充分变性为单链。</li>
	<li>向含有变性文库的离心管中加入30 µL 200 mM Tris-HCl（pH 7），中和反应体系。</li>
	<li>加入65 µL中和后的变性文库悬液和835 µL预冷测序缓冲液，涡旋充分混匀。</li>
	<li>在最终的低吸附离心管中加入以下组分：195 µL中和后的变性文库、1.30 µL对照文库和1103.70 µL测序缓冲液。充分混匀。</li>
	<li>将最终文库混合液（1300 µL）加载至试剂盒指定位置。</li>
	<li>按照操作指南，在测序仪指定网站中输入项目和样本信息，设置测序运行。</li>
	<li>按照操作指南启动测序。将流动池、含文库的试剂盒以及缓冲液盒装入台式测序仪中。</li>
	<li>记录测序过程中使用的所有试剂盒和 cartridge 的批号。</li>
</ol>
7. 从测序网站下载数据
<ol>
	<li>按照网站上提供的制造商说明下载 FASTQ 文件。</li>
	<li>为确保测序质量良好，需检查 Q30 百分比 ≥ 75%，簇密度在 170–280 K/mm2 之间，最佳范围为 200–210 K/mm2（表 4）。</li>
</ol>
8. 测序数据分析
<ol>
	<li>将测序样本的 FASTQ 文件导入数据分析集成软件包（参见材料表）。</li>
	<li>在软件中创建测序工作流程，从功能列表中添加以下步骤：数据修剪、比对至参考序列（选择参考基因组）、局部重比对和变异分析（图 3A），参数设置见表 5。</li>
	<li>选择单个样本或一批样本的 FASTQ 文件运行工作流程，并将输出文件保存至指定的样本文件夹中。</li>
	<li>生成序列覆盖深度、比对区域以及基因组中结构变异列表的报告（图 3B）。</li>
	<li>利用结构变异列表，在与耐药性和毒力相关的基因中搜索非同义单核苷酸多态性（SNPs）。</li>
	<li>通过列出 SNP 位置、基因以及耐药或敏感分离株的数量来准备报告（表 6）。</li>
</ol>

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作者声明无竞争性财务利益，也无其他利益冲突需要披露。

&#160; &#160;本研究确定了全基因组测序（WGS）指导检测光滑念珠菌（C. glabrata）耐药性的可行性、大致时间线及精确度。文库制备和测序的周转时间（TAT）为四天，分析结果的报告时间为一至两天。这与从培养平板进行药敏试验以及Sanger测序相比，TAT至少相当，但通量显著更高。根据测序芯片的容量，可同时测序约30至90个光滑念珠菌（C. glabrata）基因组，测序覆盖度达80%至100%。由于测序是在本单位建立的WGS实验室完成，本研究中的成本和资源需求相当于当前Sanger测序和探针法检测的成本，每样本估计费用为80至100澳元（AUD）。所有分离株的药敏性均通过商业检测试剂盒测定，并使用读数镜进行目视判读。培养生长通过比色生长指示剂颜色由蓝色变为粉红色来判断。最低抑菌浓度（MIC）读取为一系列粉红色（生长）孔之后的第一个蓝色孔，即能够显著抑制真菌生长的最低抗真菌药物浓度。对于WGS检测，使用文库制备试剂盒构建基因组DNA文库。分离株文库通过qPCR进行定量。定量后的文库被混合，用于在台式测序仪上进行最终测序运行。
在我们...

Candida glabrata 是一种日益常见的病原体，因其对唑类药物以及近期对棘白菌素类药物表现出耐药性而备受关注1,2,3。与二倍体的 C. albicans 不同，C. glabrata 的单倍体基因组可能使其更容易获得突变并发展出多重耐药性。已有报道指出其对这两类药物同时产生共耐药现象4。因此，早期评估 C. glabrata 的抗真菌药物敏感性并检测其耐药性，对于实施正确、靶向的治疗以及推动抗真菌药物管理以减少抗菌药物耐药的驱动因素至关重要1,5,6。建立高效的检测流程，以快速识别耐药分离株中与耐药生物标志物相关的确认性突变，也将有助于优化用药决策和改善临床结局。
抗真菌药物敏感性通常通过测定最低抑菌浓度（MIC）来评估，MIC被定义为与无药物生长对照相比，能够显著抑制微生物生长的最低药物浓度。临床与实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）已对敏感性检测方法进行了标准化，以提高MIC测定的准确性和一致性7,8。然而，抗真菌药物MIC的应用仍存在局限性，尤其是对于棘白菌素类药物，在不同实验室之间进行比较时尤为明显，因为所采用的方法学和实验条件存在差异9。此外，MIC值与棘白菌素治疗反应之间的相关性尚不明确，且无法区分野生型（或敏感型）菌株与携带FKS突变（即棘白菌素耐药株）的菌株10,11。尽管已有确认性的单基因PCR和抗真菌耐药标志物的Sanger测序方法，但由于缺乏对多种耐药标志物的同步检测，检测结果往往延迟5,12。因此，基于全基因组测序的分析技术能够实现对基因组不同位点耐药相关突变的同步检测，相较于现有方法具有显著优势。
全基因组测序（WGS）已成功应用于追踪疫情暴发期间的疾病传播，同时也被用作细菌和病毒全基因组风险评估及耐药性检测的一种方法13。近年来，核酸测序技术的进步使得病原体的全基因组测序（WGS）在临床可操作的时间范围内，在技术和经济上均成为可行。与微生物学实验室中使用的其他病原体鉴定和表征方法相比，DNA测序具有重要优势14,15,16。首先，它提供了一种通用的解决方案，具有高通量、快速和高质量的特点。测序可应用于各类微生物，并可在本地或区域实验室实现规模经济。其次，它生成的数据以“可长期使用”的格式保存，便于在国家和国际层面进行比对。最后，随着包含参考基因组的公共数据库迅速增长，WGS在医学中的潜在应用价值得到了增强，这些数据库可与包含额外临床和流行病学元数据的等效数据库相链接17,18。
近期研究表明，全基因组测序（WGS）可用于从临床分离的Candida spp.中鉴定抗真菌药物耐药标志物10,19,20。这主要得益于高通量台式测序仪的普及、成熟的生物信息学分析流程以及测序成本的持续降低21,22。相较于Sanger测序，真菌WGS的优势在于可在单次运行中同时对多个基因组进行测序。此外，对Candida基因组进行WGS可识别药物靶点中的新发突变，追踪遗传进化过程以及临床相关序列型的出现20,22,23。尤为重要的是，在固有性多重耐药的情况下，WGS可在选择治疗方案前协助早期检测介导耐药的突变22,24。
在此，我们探讨了利用全基因组测序（WGS）进行筛查以检测与各类抗真菌药物耐药性相关突变的可行性。我们从终端用户和诊断性真菌学实验室的角度，提出了一种实施WGS的方法学。本分析纳入了三个独立临床病例中培养获得的三对分离株。 体外 随着时间的推移，真菌在抗真菌治疗后对棘白菌素类和5-氟胞嘧啶产生了耐药性。

<table><tbody><tr><td>DensiCHECK Plus</td><td>BioM&amp;eacute;rieux Inc</td><td>K083536</td><td>用于麦氏比浊法测定的密度计</td></tr><tr><td>Sensititre YeastOne</td><td>TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific</td><td>YO10</td><td>含标准抗真菌药物的商用药物敏感性检测板</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性接种环和接种针</td><td>Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-605</td><td>一次性塑料接种环可直接从包装中取出使用，无需灼烧灭菌</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>T2795&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>体积 2.0 mL，自然色&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>来自 Arthrobacter luteus 的 ZYMOLYASE 20T</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>8320921</td><td>用于真菌分离株在 DNA 提取前的细胞壁裂解&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1120</td><td>可进行 100 次 DNA 提取</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>&amp;nbsp;试剂盒中的 Picogreen 试剂在实验方案中称为荧光染料&lt;br/&gt; 包含用于检测的 λ DNA 标准品和 Picogreen 试剂</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 样本制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>包含用于 96 个样本的试剂盒 1 和试剂盒 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit v2</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001,&lt;br/&gt; FC-131-2002,&lt;br/&gt; FC-131-2003,&lt;br/&gt; FC-131-2004</td><td>Index set A&lt;br/&gt; Index set B&lt;br/&gt; Index set C&lt;br/&gt; Index set D</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2004</td><td>300 个循环，每套试剂盒可处理超过 250 个样本</td></tr><tr><td>NextSeq 500 Mid Output v2 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2003</td><td>300 个循环，每套试剂盒可处理超过 130 个样本</td></tr><tr><td>PhiX Control Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>用于按顺序排列 Index Kit 中的索引</td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture Kit</td><td></td><td>FC-130-1005</td><td>&amp;nbsp;含 2 个固定装置</td></tr><tr><td>KAPA 文库定量试剂盒&lt;br/&gt; 用于下一代测序</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td>包含预配置的标准品、引物和 MasterMix</td></tr><tr><td>Janus NGS Express 液体处理系统&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>YJS4NGS</td><td>用于测序过程中的 DNA 稀释</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;0.8 mL 储存板</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0765B</td><td>MIDI 板，用于 DNA 文库纯化和&lt;br/&gt; 标准化</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>&amp;nbsp;溶液中的磁珠，用于文库纯化</td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10027</td><td>用于基于磁珠的 DNA 纯化</td></tr><tr><td>OrbiShaker MP&amp;nbsp;</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BT1502</td><td>96 孔板振荡器，配备 4 个平台</td></tr><tr><td>Hard Shell PCR 板</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td>薄壁，96 孔</td></tr><tr><td>LightCycler 480 仪器 II&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>5015278001</td><td>可容纳 96 孔板</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR 板密封膜，带粘性，光学透明&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;MSB1001</td><td>透明 96 孔板密封膜</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td>CLCBio</td><td>数据分析软件，版本 8</td></tr><tr><td>NextSeq500 仪器</td><td>Illumina&amp;nbsp;</td><td>Illumina&amp;nbsp;</td><td>台式测序仪，用于下一代测序</td></tr></tbody></table>

白色念珠菌全基因组测序用于检测抗真菌药物耐药性标志物

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Candida glabrata 可迅速获得导致耐药性的突变，尤其是对唑类和棘白菌素类药物的耐药性。鉴定基因突变至关重要，因为所检测到的耐药性 体外 常常与临床治疗失败相关。我们探讨了利用全基因组测序（WGS）进行抗真菌药物耐药性全基因组分析的可行性 C. glabrata目的是识别全基因组测序（WGS）实施过程中的促进因素与障碍，并评估其有效性。本文概述了WGS方法学中的关键质量控制节点和基本组成要素，以研究与抗真菌药物敏感性降低相关的遗传标志物。同时估算了数据分析的准确性及检测周转时间。
12株临床分离株和1株ATCC菌株的表型敏感性 C. glabrata 通过抗真菌药物敏感性试验确定。这些菌株包括来自3例患者的3对分离株，均表现出药物最低抑菌浓度升高。其中2对分离株的第2个菌株对棘白菌素类药物产生耐药性，第3对分离株的第2个菌株对5-氟胞嘧啶产生耐药性。其余菌株为敏感株及唑类耐药株。通过下一代测序技术进行全基因组测序（WGS），在耐药菌株中确认了与棘白菌素类、唑类及5-氟胞嘧啶耐药相关的单核苷酸多态性（SNPs）。&#160;抗真菌耐药基因中的非同义SNPs，例如 FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 和 FCY2 被鉴定出来。总体而言，WGS测序读段平均有98%被比对到参考基因组。 C. glabrata 分离株与参考基因组比对，获得约75倍的测序深度覆盖。检测周转时间与成本与Sanger测序相当。
总之，对C. glabrata进行全基因组测序（WGS）能够揭示与多种抗真菌药物类别耐药性相关的临床重要基因突变，而无需进行多次PCR或DNA测序反应。这标志着在临床实验室中建立WGS能力以同时检测导致抗真菌耐药的突变方面迈出了积极的一步。

研究了13株C. glabrata，包括C. glabrata ATCC 90030以及来自悉尼Westmead医院临床真菌学参考实验室的12株分离株（分离株CMRL1至CMRL12）（表1）。其中包括三对在抗真菌治疗前后获得的分离株CMRL-1/CMRL-2、CMRL-3/CMRL-4和CMRL-5/CMRL-6，这些分离株之间无流行病学关联24（表1）。
采用CLSI解释性折点法测定9种抗真菌药物的最低抑菌浓度（MIC），这些药物分别为两性霉素B（Amphotericin, AMB）、阿尼芬净（Anidulafungin, ANI）、米卡芬净（Micafungin, MIF）、卡泊芬净（Caspofungin, CAS）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine, 5-FC）、泊沙康唑（Posaconazole, POS）、伏立康唑（Voriconazole, VR...

本研究采用全基因组测序方法，分析导致Candida glabrata对抗真菌药物产生耐药性的基因突变。C. glabrata对棘白菌素类、唑类和5-氟胞嘧啶耐药的分离株被用于测序，以展示该方法学。分离株的药敏谱与特定基因中突变模式的有无相关。

白色念珠菌（Candida glabrata）可迅速获得导致耐药性的突变，尤其是对唑类和棘白菌素类药物的耐药性。遗传突变的鉴定……

本研究的总体目标是在诊断实验室中应用全基因组测序技术，以鉴定导致光滑念珠菌对抗真菌药物产生耐药性的基因突变。真菌的全基因组测序可对抗真菌药物耐药性研究领域作出重要贡献，能够同时检测耐药真菌基因组范围内针对重要抗真菌药物的关键突变。对具有医学重要性的真菌进行全基因组测序，还可用于检测和监测医疗机构中真菌病的暴发及传播事件，以及临床医生需要了解的真菌物种和克隆的出现情况。本实验操作将由本实验室的博士研究学者Rebecca Rockett博士和Verlaine Timms博士进行示范。首先，从临床和商业来源的光滑念珠菌（Candida glabrata）菌株中提取基因组DNA样本。然后将5 µL定量DNA加入预先标记的96孔硬壳薄壁板的每个孔中。向每个孔中加入10 µL片段化缓冲液和5 µL扩增缓冲液。接着使用移液器轻轻混匀样品，用粘性封膜密封板孔，将板放入热循环仪中，并运行相应的PCR程序。当样品温度达到10摄氏度时，立即加入5 µL中和缓冲液，并用移液器轻轻混匀样品。然后密封反应板，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，向每个孔中加入15 µL Indexing PCR主混合液。将引物工具排列在索引板架中，并在模板上记录索引的位置。然后将含有PCR预混液的标签化板与索引管按正确顺序放置在索引板架上。重要的是，索引引物一管应水平放置，索引引物二管应垂直放置。根据索引模板中提供的顺序和位置，移除索引引物管上的旧管盖并丢弃。使用多通道移液器，向每个孔中加入五微升索引引物。此步骤需谨慎操作，以避免样本和索引之间的交叉污染。为防止索引间的交叉污染，需更换每个旧索引管的管盖。最后，密封反应板并运行第二次 PCR 程序。首先将标签化反应板中的PCR产物转移至深孔板中。涡旋振荡磁珠溶液，并向每孔加入30 µL磁珠。然后将深孔板置于微孔板振荡器上振荡混匀，室温孵育5分钟。将平板置于磁力架上静置两分钟，或直至上清液变澄清。随后，在不移动平板的情况下，小心弃去上清液，并加入 200 µL 80%乙醇。保持平板仍在磁力架上，孵育 30 秒后弃去上清液。重复洗涤过程，并让磁珠干燥15分钟。将酶标板从磁力架上取下，向磁珠中加入52.5 µL重悬缓冲液。使用微孔板振荡器，在1,800 RPM条件下振荡2分钟。振荡结束后，将酶标板在室温下孵育两分钟。孵育结束后，将酶标板置于磁力架上，直至上清液变澄清。最后，使用多通道移液器将50 µL澄清上清液从纯化板转移至新的硬壳板中。首先按照文库标准化试剂盒的说明操作，将硬壳板中的澄清上清液20微升转移至新的深孔板中。向深孔板的每个孔中加入45微升磁珠悬浮液，并使用板封膜密封板子。接着，在微孔板振荡器上以1,800 RPM的速度振荡30分钟。将平板置于磁力架上静置两分钟，直至上清液澄清。使用移液器吸走上清液，并将上清液弃入适当的危险废物容器中。随后将平板从磁力架上取下，用45 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠。在微量板振荡器上振荡混匀，将板置于磁力架上静置2分钟。待上清澄清后，弃去上清液，并将板从磁力架上取下。用洗涤缓冲液再重复洗涤一次。从磁力架上取下板之前，向每个孔中加入 NaOH。然后在微型振荡器上以 1,800 RPM 振荡 5 分钟，再将板置于磁力架上，直至液体变澄清。向新的 96 孔硬壳薄壁板的每个孔中加入 30 微升洗脱缓冲液。最后，从标准化板中将30微升上清液转移至含有洗脱缓冲液的各个孔中。此时，最终的标准化文库板已准备好用于后续实验的测序。研究包括抗真菌治疗前后获得的13株C.glabrata分离株，分别为C.glabrata ATCC 90030和来自临床实验室的12株分离株。针对每种分离株，测定了其对九种抗真菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。该表格列出了每种分离株在抗真菌药物测试条件下的MIC值。分离株中存在与耐药性相关的基因单核苷酸多态性（SNPs），这与体外对抗真菌药物的MIC升高相关。本表格总结了临床分离的光滑念珠菌中单核苷酸多态性（SNP）位点及其相关基因所介导耐药的药物。观看本视频后，读者可在诊断实验室环境中复制该技术，用于全基因组测序的认证。视频重点介绍了DNA文库制备中的关键步骤以及获得准确、可重复结果所必需的质量控制要点。

whole-genome-sequencing-candida-glabrata-for-detection-markers

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医学

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