Name: Ektacytometry 血中红细胞异质性的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习使用ektacytometry技术测定红细胞变形性和细胞异质性，适用于镰状细胞贫血等血液疾病研究。该方法操作便捷、结果可靠，可用于监测患者治疗效果及评估疾病进展。

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本研究由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所和国立心肺血液研究所（隶属于美国国立卫生研究院）的院内研究计划资助。文中表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国国立卫生研究院的官方立场。

本研究的所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署了书面知情同意书，研究方案经美国国立卫生研究院机构审查委员会批准。
1. 开启ektacytometer
<ol>
	<li>将清洗液的管路连接至低渗和高渗聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液。注意将0 osmolar管路连接至低渗溶液，将500 osmolar管路连接至高渗溶液。 
	注意： 低渗PVP溶液的渗透压应介于35至55毫渗摩尔/千克（mOsm/kg）之间，pH值为7.25–7.45，于 25 °C 黏度在 37.0 ± 0.1 °C 下介于 27.0 至 33.0 厘泊（cP）之间 0.5 °C高渗PVP溶液的渗透压应介于764至804 mOsm/kg之间，pH值为7.25–7.45。 25 °C 黏度测定值为 27.0–33.0 cP 37.0 ° 0.5 °C.</li>
	<li>确保摆锤完全放入杯中。启动软件并初始化仪器（硬件检查 | 仪器输入输出）。让仪器完成引灌循环。循环完成后，将转子从杯中取出，并使用低絮纤维擦拭纸彻底擦干转子和杯。 
	注意： 残留的水会裂解红细胞，从而产生干扰。</li>
</ol>
2. 测量随剪切应力增加而变化的变形能力
<ol>
	<li>在含有适当抗凝剂的试管中采集血液（少于 1 mL 的血量足以完成这些技术的重复实验）。 
	注意：优先选择 EDTA 而非肝素，因为 EDTA 对血液流变学参数的影响较小。33 若在采血后 6 小时内进行测量，应将血液置于室温保存。</li>
	<li>检测前通过反复倒置试管数次，轻柔混匀全血样本。使用移液器将 25 µL 全血加入 5 mL 等渗 PVP 溶液中，盖上试管盖，并通过反复倒置数次轻柔混匀。该等渗 PVP 溶液的渗透压应在 284 至 304 mOsm/kg 之间，25 °C 时 pH 为 7.3–7.4，37.0 ± 0.5 °C 时黏度为 27.0–33.0 cP。</li>
	<li>在软件主菜单中选择“变形性”。创建新分析并添加实验细节（变形性 | 添加所需细节 | 确定）。
	<ol>
		<li>打开变形粘度计的盖子，确认转子已完全降入杯中且杯子正在旋转。</li>
		<li>使用移液器将 1 mL PVP 血液溶液加入杯与转子之间的空隙中。</li>
		<li>轻微提起转子使样品下沉。等待所有气泡从溶液中逸出后，关闭变形粘度计的盖子。如有需要，按下抽吸按钮以帮助去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过软件滚动条移动箭头将增益调节至 200（参见注释）。当温度稳定在 37 °C 且衍射图像稳定时，按下“开始”按钮（开始）。 
	注意：在多数研究中，使用相机增益设为 200 的健康血液（血红蛋白浓度 &gt; 12.0 g/dL，平均红细胞体积 80–96 fL，平均红细胞血红蛋白浓度 33–36 g/dL）可获得良好的衍射图像。对于镰状细胞贫血患者的血液研究，建议将相机增益调整至生成 4.5 cm 衍射图像作为默认设置，以便在不同研究和实验室之间比较结果。9</li>
	<li>在数据采集过程中观察衍射图样，确保其保持圆形、椭圆形或菱形。数据采集完成后，保存或打印报告（文件 | 保存 或 文件 | 打印）。EI Max 和 SS ½ 值将自动报告，同时报告对应于用户指定或默认剪切应力的伸长指数。软件也将自动保存数据。</li>
	<li>实验结束时，点击计算机显示器上对话框中的“清洗”选项（清洗）。样品抽吸完成后，在仪器处于清洗循环状态时，向杯与转子之间的空隙中喷入去离子水进行冲洗。清洗循环完成后，将转子从杯中取出，并使用低纤维碎屑清洁纸巾彻底擦干转子和杯（关键：残留水分会导致红细胞溶血，产生干扰）。</li>
	<li>点击软件上的“主菜单”按钮返回主页面（主菜单）。</li>
</ol>
3. 测量细胞异质性
<ol>
	<li>检测前轻轻混匀全血样本，通过反复倒置管子数次。用移液器吸取 25 µL 全血加入一个新的含有等渗 PVP 溶液的 5 mL 管中，盖紧管盖，并通过倒置轻轻混匀，直至混合液均匀。</li>
	<li>从主菜单中选择变形能力（Deformability）。创建一项新的分析并添加实验细节（变形能力 | 添加所需细节 | 确定）。
	<ol>
		<li>打开ektacytometer的盖子，确认转子已完全降入杯中，且杯子正在旋转。</li>
		<li>用移液器将 1 mL PVP 血液溶液加入杯与转子之间的空隙中。</li>
		<li>等待所有气泡从溶液中逸出后，关闭 ektacytometer 的盖子。</li>
		<li>确保屏幕上出现稳定的衍射图像。通过软件中的滚动条移动箭头调节相机增益，使衍射高度达到 3.8 cm。使用直尺验证计算机屏幕上图像的高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当温度稳定在 37 °C 且衍射图像稳定时，按下开始按钮（开始）。</li>
	<li>在数据采集过程中观察衍射图样，确保其保持圆形、椭圆形或菱形。数据采集完成后，保存或打印报告（文件 | 保存 或 文件 | 打印）。</li>
	<li>最后，在计算机显示器上的对话框中点击“清洁”选项（Clean）。待样品被吸出后，在仪器仍处于清洁循环状态时，从洗瓶中向杯与转子之间的空隙喷入去离子水进行冲洗。清洁循环完成后，将转子从杯中提起，并用低绒清洁纸巾彻底擦干转子和杯（关键：残留水分会导致红细胞溶血，产生干扰）。</li>
	<li>重复步骤 2.1–2.5，并调节相机增益以获得 4.5 cm 的衍射图样高度（步骤 2.2）。</li>
	<li>重复步骤 2.1–2.5，并调节相机增益以获得 5.4 cm 的衍射图样高度（步骤 2.2）。</li>
	<li>最后，单击主菜单按钮返回软件的主页面（主菜单）。</li>
	<li>为根据最大伸长指数（EI Max）以百分比形式确定衍射图样畸变程度，使用以下公式（如需要，也可使用 4.5 cm 衍射图样高度的数据进行相同计算）： 
	<img alt="用于材料刚度分析的教育图解中的弹性指数计算公式。" src="/files/ftp_upload/56910/56910eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>类似地，为基于 SS1/2 确定衍射图样畸变程度，使用相同公式并代入报告的 SS1/2 值： 
	<img alt="使用不同长度下的 SS 1/2 变量计算百分比变化的公式，适用于数据分析。" src="/files/ftp_upload/56910/56910eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
</ol>
4. 渗透压梯度变形红细胞测定法
<ol>
	<li>按照1.1所述方法采集样本。检测前将全血样本轻轻混匀，通过反复倒置数次即可。加入 250 µL 用移液器将全血加入5 mL等渗PVP管中，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀，直至混合物均匀。</li>
	<li>从主菜单中选择 osmoscan（Osmoscan）。将装有血液PVP溶液的小瓶置于机器左侧针头的正下方。降低针头，直至其接触小瓶底部。确保低渗和高渗溶液的管路已正确连接，以形成梯度。关闭ektacytometer的盖子，并打开下半部分的门，以便观察血液进入管路的过程。</li>
	<li>新建分析并输入实验细节（Osmoscan | 新建分析 | 输入所需详细信息 | 确定将软件中控制相机增益的箭头调节至200，调整后让仪器继续运行，直至观察到血液从仪器下方的导管进入样品杯中。
	<ol>
		<li>一旦血液进入样品杯且计算机屏幕上出现稳定的衍射图样，即可通过点击对话框中的“立即开始”按钮（Start Now）开始数据采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让ektacytometer采集数据至约500 mOsm/kg，然后停止仪器。保存或打印报告。文件 | 保存 或 文件 | 打印）。数据也将自动保存。</li>
	<li>移除旧的PVP-血液小瓶，换上一个装有去离子水的洁净小瓶。将小瓶置于针头下方， lowering 针头使其接触小瓶底部，然后按下对话框中的清洗按钮，以冲洗梯度系统冲洗).</li>
	<li>冲洗完成后，按下计算机显示器对话框中的“clean”选项清洁）。清洁循环完成后，将浮子从杯中取出，并使用低碎屑清洁纸彻底擦干浮子和杯子（重要提示：残留水分会导致红细胞裂解，产生干扰）。 
	注意： Osmoscan 报告提供了渗透梯度下的变形指数数据。EI Min, O (EI Min)、EI Max, O (EI Max)、EI hyper 和 O hyper 会自动生成并包含在报告中。来自9名健康志愿者血液样本的渗透梯度变形细胞测量参数范围为：EI Min 0.12–0.196 任意单位（a.u.）；O Min 117–144 mOsm/kg；EI Max 0.551–0.573 a.u.；O (EI Max) 272–312 mOsm/kg；EI hyper 0.278–0.286；O hyper 454–505 mOsm/kg。</li>
</ol>
5. 关闭ektacytometer
<ol>
	<li>关闭仪器前应正确清洁仪器。
	<ol>
		<li>为此，请将低渗和高渗溶液的管路连接到通向清洗液的Y型接头。将一个装有清洗液的小瓶放置在机器左侧针头下方，并降低针头直至接触小瓶底部。确保转子完全浸入杯中。</li>
		<li>关闭软件，然后按下计算机显示器上“每日结束清洁”对话框中的“开始”按钮（关闭 | 开始）。让仪器完成整个清洗循环过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断开通向废液瓶的管路，并将其从仪器上取下以处理废液。彻底干燥转子。关闭仪器电源。</li>
</ol>

<ol><li>Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+ektacytometry%3A+a+new+method+of+measuring+red+cell+deformability+and+red+cell+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%22%5BJournal%5D)">Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices.</a> Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).</li>
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<li>Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemoglobin+oxygenation+level+on+red+blood+cell+deformability+and+aggregation+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).</li>
<li>Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+sickle+cell+anemia+and+alpha-thalassemia.+Effect+on+pathological+properties+of+sickle+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes.</a> J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).</li>
<li>von Tempelhoff, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+blood+rheological+properties+and+red+blood+cell+indices%28MCH%2C+MCV%2C+MCHC%29+in+healthy+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).</li>
<li>Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spherocytosis%2C+elliptocytosis%2C+and+other+red+cell+membrane+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders.</a> Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所描述的ektacytometry技术简便且高度自动化，可确保获得有效且可重复的结果。然而，仍存在一些关键步骤。血液温度的适当控制至关重要。血液在室温下储存超过八小时可能会影响SS ½值。34 确保仪器温度稳定在37 °C同样重要，因为悬浮介质的黏度具有温度依赖性。血液样本应充分氧合，以避免因未氧合或部分氧合样本导致的变形能力降低，除非这些状态是实验关注的参数。35 从仪器操作角度来看，仪器的彻底清洁至关重要，以确保管道或转子入口处无残留的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），因为PVP在干燥后会硬化，从而堵塞仪器内的液体流动。关注这些细节将有助于获得准确的结果，并保持仪器的良好运行状态。
细胞异质性的量化可能需要进行调整。在3.8 cm的衍射图样中，某些样品在最高剪切应力下可能出现伸长指数急剧下降的情况。这种情况有时可通过使用新鲜样品重复测量来克服。否则，可采用较低剪切应力下的伸长指数值来测量衍射图样畸变的程度，或改用4.5 cm的衍射图样。9 此外...

ektacytometry 可便捷地测量红细胞在剪切应力（单位为帕斯卡（Pa））或悬浮介质渗透压改变下的变形能力。红细胞变形能力的相关参数包括最大伸长指数（EI Max），即红细胞在递增剪切应力作用下所能达到的最大变形程度，以及剪切应力 &#189; （SS &#189;达到最大变形度一半所需的剪切应力。1 渗透梯度变形指数测定法具有多个信息性参数。包括最小伸长指数（EI Min），用于反映细胞表面积与体积的比值，以及其对应的渗透压（O Min），用于评估红细胞的渗透脆性。EI Max及其对应的渗透压（O (EI Max)）可提供关于细胞膜柔韧性和细胞表面积的信息。在渗透梯度的高渗支中，半最大伸长指数以EI hyper表示。EI hyper及其对应的渗透压（O hyper）可反映红细胞内黏度，后者由血红蛋白浓度决定。2,3 在异质性血液中测量变形能力较为复杂，其原因是刚性红细胞（如镰状红细胞）在受到逐渐增加的剪切应力时，无法像可变形红细胞那样沿流动方向正常排列。刚性红细胞不产生特征性的椭圆形衍射图像，而是形成球形图案，当其与可变形红细胞产生的椭圆图案叠加时，最终呈现为菱形的衍射图样。4,5,6 球形衍射图样已被证实对应于不可逆镰状红细胞，该结论通过对密度梯度离心分离后的细胞组分进行变形指数测定而获得。6 变形指数的计算包含对椭圆长轴和短轴的测量；因此，当短轴宽度增加时，菱形会表现出明显的伸长率降低。7 先前的研究表明，衍射图样畸变程度与镰状细胞贫血患者血液中镰状血红蛋白（HbS）的百分比以及镰状红细胞的百分比均存在相关性。5 衍射图样畸变程度可通过复杂的数学分析获得。8 也可通过调节变形计上的相机光圈开度或拟合软件的灰度级别来改变衍射图样的高度。5 然而，关于如何调整灰度级别的具体细节尚不明确，且最新一代商用变形红细胞计上的相机光圈不易接触。为解决这些问题，可利用易于调节的相机增益来调整衍射图样的高度。9 利用该方法评估细胞异质性时，衍射图样畸变程度可与镰状细胞贫血患者血液中胎儿血红蛋白的百分比相关联。10 多种渗透梯度变形指数测定参数同样与镰状细胞贫血患者血液中胎儿血红蛋白或镰状血红蛋白的百分比相关。衍射图样畸变的相关性可能反映了血红蛋白组成对循环中刚性、不可变形红细胞百分比的影响。此外值得关注的是，在镰状细胞危象期间，整个渗透梯度变形指数测定曲线呈现与循环中高密度红细胞百分比相对应的双相变化。11
变形红细胞测定法同样适用于研究其他多种疾病。渗透梯度变形红细胞测定法可用于诊断遗传性红细胞膜病，例如遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症和遗传性热异形红细胞增多症。3,12,13,14 铁缺乏时会出现变形能力下降。15 红细胞变形性的表征 &#34;储存损伤&#34; 血液的研究已采用变形指数测定法，未来针对储存血液过程中损伤性质及其预防干预措施的研究很可能受益于本文所介绍的技术。16 红细胞变形能力下降也与糖尿病中的微血管疾病相关。17 近期研究将高血糖、红细胞内抗坏血酸浓度与渗透脆性相互关联，提示这些因素可能在微血管病变的发生发展中具有重要意义。18 正在开展变形指数测定研究以验证该假设（Parrow 和 Levine，未发表数据）。红细胞变形性研究的另一个有趣方向是疟原虫血液期感染。细胞变形性 恶性疟原虫 感染红细胞的变形能力在疟原虫从环状体阶段到裂殖体阶段的48小时胞内成熟过程中显著下降。有证据表明，这种变形能力的降低在寄生虫成熟后会得到逆转，逆转时间与感染红细胞释放入血液循环的时间相吻合。变形能力下降被认为是由 疟原虫 促进红细胞滞留的蛋白质。19 这些研究仅是临床重要疾病中与红细胞变形能力及渗透梯度参数测量相关情况的一小部分示例。此外还存在多个其他研究领域。
测量红细胞变形能力的其他技术包括光镊（也称为激光捕获），该技术利用光子的物理特性在单个或多个方向上拉伸单个红细胞。20 此方法的优势在于可测量单个红细胞的变形能力，但由于力学校准存在一定的不确定性，导致不同研究之间的结果差异较大21，且数据分析过程较为耗时，除非实现自动化22。微管吸吮法通过负压将红细胞吸入微管中，也可用于测量红细胞的变形能力7,23。该方法可进行多种测量，例如吸入红细胞所需的压力，每一项测量均可反映红细胞的不同特性23。原子力显微镜是一种高分辨率技术，通过量化激光束的偏转程度来反映悬臂在红细胞表面移动时的偏转情况，从而测定细胞膜的刚度24。这些技术可提供有关单个红细胞的信息，但难以适用于测量红细胞群体的变化，且通常需要较高的专业技术水平。
同时检测单个细胞和细胞群体的需求推动了自动化技术的发展，以及微流控技术和基于阵列方法的进步。与变形测量法类似，流变显微术也测量红细胞在剪切应力作用下的变形能力，但其图像是通过显微镜直接获取的。25 为了实现更高通量的分析，已采用自动细胞成像技术，利用流变显微镜生成变形能力分布图。26 如果有健康对照个体的数据，该方法还可用于量化细胞异质性。27 微流控技术同样支持对单个细胞进行高通量分析；目前已开发出多种设计，包括基于过滤原理的装置28、红细胞通过微孔所需时间的细胞通过分析仪29，以及测量红细胞通过所需压力而非时间的替代方法30。另一种用于单细胞高通量分析的平台是单细胞微室阵列芯片，其额外优势在于可对细胞进行后续基于荧光的表征分析。31 尽管上述每种技术都具有潜在应用价值，并可能在特定应用场景中表现更优，但变形测量法的比较优势在于其高灵敏度、操作简便性和精确性。32 最新一代商用变形测量仪还具备高度灵活性，可执行多种不同类型的检测。

<table><tbody><tr><td>LoRRca MaxSis 标准版</td><td>机电一体化</td><td>LORC109000</td><td></td></tr><tr><td>LoRRca MaxSis Osmoscan</td><td>机电一体化</td><td>LORC109001</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 0 mOsm</td><td>机电一体化</td><td>QRR030910</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 500 mOsm</td><td>机电一体化</td><td>QRR030930</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 5 mL 小瓶</td><td>机电一体化</td><td>QRR030901</td><td></td></tr><tr><td>X clean</td><td>机电一体化</td><td>QRR010946</td><td></td></tr><tr><td>P1000&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z646555</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z646547</td><td></td></tr><tr><td>P200 滤芯吸头</td><td>MidSci</td><td>AV200-H</td><td></td></tr><tr><td>P1250 滤芯吸头</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>MidSci</td><td>8091</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>MidSci</td><td>C15R</td><td></td></tr></tbody></table>

通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性

Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry

红细胞变形能力下降是多种疾病的特征。在某些情况下，变形能力缺陷的程度可以预测疾病的严重程度或严重并发症的发生。ektacytometry（激光衍射粘度法）通过测量红细胞在逐渐增加的剪切应力下，或在恒定剪切应力下经受渗透梯度时的变形能力来评估其变形性。然而，当检测含有刚性与可变形红细胞的异质性血液时，直接测量变形性难以解释，因为刚性细胞无法在剪切应力作用下正常排列，导致衍射图样发生扭曲，表现为表观变形性显著降低。对这种扭曲程度的测量可作为血液中红细胞异质性的指标。在镰状细胞贫血中，该指标与刚性细胞所占百分比相关，反映了红细胞内的血红蛋白浓度和血红蛋白组成。除了测量变形性外，渗透梯度ektacytometry还可提供有关红细胞渗透脆性和水合状态的信息。这些参数同样反映了镰状细胞患者红细胞的血红蛋白组成。ektacytometry测量的是红细胞群体的变形性，因此无法提供单个红细胞的变形性或力学特性的信息。尽管如此，本文所述技术的目标是提供一种便捷且可靠的血液变形性和细胞异质性测量方法。这些技术可用于监测多种疾病的时间变化、疾病进展以及对治疗干预的反应。镰状细胞贫血是一个已被充分表征的示例。其他可能需要关注红细胞变形性或异质性测量的潜在疾病包括血液储存、糖尿病、Plasmodium感染、缺铁性贫血以及由膜缺陷引起的溶血性贫血。

本论文中描述的ektacytometry结果可用于测量任何条件下红细胞的变形能力。图1展示了ektacytometer的一般设置示意图。在逐渐增加的剪切应力作用下，均一的红细胞群体将产生椭圆形的衍射图样，据此可计算延长指数，如图2所示。在异质性血液样本中，由于刚性红细胞无法与可变形细胞正常对齐，会产生球形图样并叠加在椭圆上，从而形成菱形的衍射图样，导致衍射图样发生畸变。随着相机增益的调整使衍射图样尺寸增大，这种畸变图样将更易被检测到，如图3所示。在健康志愿者中所见的均一血液群体，当测量不同大小的衍射图样时，其变形能力曲线不会出现差异（图4A）。相反，异质性血液群体（如镰状细胞贫血患者血液）的变形能力测量值则会随着衍射图样尺寸的增大而显著降低（图4）。在镰状细胞血液中，当以EI ...

本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。

红细胞变形能力降低是多种疾病的特征。在某些情况下，变形能力缺陷的程度可预测疾病的严重程度……

该技术的总体目标是通过ektacytometry测量红细胞变形性及细胞异质性。该方法有助于回答ektacytometry领域的关键问题，例如红细胞的变形能力如何、血液样本的异质性程度如何，以及实验结果如何随疾病状态而变化。该技术的主要优势在于其可及性、操作便捷性以及在测量红细胞群体变形性和异质性方面的可靠性。这些技术可用于监测镰状细胞贫血患者对治疗的反应。由于红细胞变形能力与异质性与血红蛋白的组成和浓度相关，因此这些方法也可应用于其他以红细胞变形能力下降为特征的疾病，例如糖尿病；在糖尿病中，红细胞变形能力下降可能促进微血管病变的发生。首先将零渗透压管路连接至低渗透压PVP溶液，将500渗透压管路连接至高渗透压PVP溶液。确保转子完全浸入样品杯中。启动软件，通过选择“硬件检查”，然后选择“仪器IO”来对仪器进行预冲洗。让仪器完成预冲洗循环过程。循环结束后，将转子从杯中取出，并用低绒毛擦拭纸彻底擦干转子和杯体。通过反复倒置试管数次，轻轻混匀 freshly drawn 的全血样本。然后，用移液器将 25 微升全血加入 5 毫升等渗 PVP 溶液中。盖上小瓶盖后，轻轻倒置数次以混匀。从软件主菜单中选择变形性，然后创建新的分析并添加实验细节。接着，打开ektacytometer的盖子，确认转子已完全降入杯中，并检查杯体是否在转动。用移液器将1毫升PVP血液溶液加入杯壁与转子之间的空隙中。然后轻轻提起转子，使样品下沉。等待所有气泡从溶液中排出后，盖上变形红细胞计的盖子。通过移动软件中滚动条上的箭头，将增益调整为200。当温度稳定在37摄氏度且衍射图像稳定时，按下开始按钮。在数据采集过程中观察衍射图样，以确保其保持圆形、椭圆形或菱形。数据采集完成后，打印报告并进行清洁。健康血液在剪切应力作用下获得的衍射图样显示出预期的椭圆形图案。伸长指数使用此处所示公式进行计算。吸取样品时，在仪器处于清洗循环期间，将去离子水喷入转子与测量杯之间的空隙进行冲洗。清洗循环完成后，将转子从测量杯中提起，并使用低絮状清洁纸巾将转子和测量杯彻底擦干。充分干燥至关重要，因为残留水分会导致红细胞裂解，从而产生干扰。选择导出以保存报告。最后，单击软件上的主菜单按钮返回主页面。按照之前的方法将另一个样本加载到ektacytometer中后，确保屏幕上出现稳定的衍射图像。移动尺子沿屏幕调整相机增益，直至产生 3.8 cm 的衍射高度。使用尺子确认计算机屏幕上图像的高度。然后，按下开始按钮，像之前一样观察数据采集过程。此图像显示了从一名镰状细胞贫血患者血液中获得的3.8 cm衍射图样。在按照前述方法清洗变形仪后，重复该操作以获得4.5 cm和5.4 cm高度下的衍射图样。在异质性血液样本中，由于刚性红细胞无法与可变形细胞正常对齐，导致出现菱形的衍射图样，从而引起衍射图样畸变。随着相机增益调整以产生更大的衍射

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

Ektacytometry 血中红细胞异质性的测定

介绍了利用超支化聚甘油（HPG）对红细胞（RBCs）细胞膜进行修饰的方法。通过水相两相分配、渗透脆性试验和补体介导的溶血试验对修饰后的红细胞进行了表征。采用流式细胞术和微分型系统（MTS）血型分型卡评估了表面蛋白和抗原的伪装效果。...

通过紧凑型超支化聚甘油的膜接枝保护抗原功能红细胞

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。...

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

本文所述方案详细介绍了一种基于图像处理技术，在受控且恒定的剪切速率下定量红细胞（RBC）聚集体的实验方法。该方案的目标是在可控的微流控环境中，将红细胞聚集体的大小与相应的剪切速率关联起来。...

用于动态研究红细胞聚集的可控微流控环境

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

本文介绍了氧梯度变形性测定法，这是一种快速且可重复的方法，用于在受控去氧和复氧条件下测定镰状细胞病患者样本中红细胞的变形能力。该技术为研究红细胞镰状化以及监测镰状细胞病治疗效果提供了一种手段。...

通过氧梯度变形红细胞计在可控自动脱氧过程中表征镰状化特性

本方法旨在通过与三位已知红细胞CR1密度的受试者进行比较，测定任意受试者红细胞中的CR1密度。该方法采用流式细胞术，通过与藻红蛋白（PE）偶联的抗CR1单克隆抗体对受试者的红细胞进行免疫染色后检测。...

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