通过变形指数测量法测定血液中红细胞的变形能力与异质性

该技术的总体目标是通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性。该方法有助于回答ektacytometry领域的关键问题，例如红细胞的变形能力如何、血液样本的异质性程度如何，以及实验结果如何随疾病状态而变化。该技术的主要优势在于其可及性、操作便捷性以及在测量红细胞群体变形性和异质性方面的可靠性。

这些技术可能有助于监测镰状细胞贫血患者对治疗的反应。因为红细胞变形能力及其异质性与血红蛋白的组成和浓度相关。这些方法也可应用于其他以红细胞变形能力下降为特征的疾病，例如糖尿病，在此类疾病中红细胞变形能力下降可能促进微血管病变的发生。

首先将零渗透压管路连接至低渗透压PVP溶液，将500渗透压管路连接至高渗透压PVP溶液。确保转子完全浸入样品杯中。启动软件，通过选择“Hardware Check”（硬件检查），然后选择“instrument IO”（仪器输入/输出）来对仪器进行预冲洗。让仪器完成预冲洗循环过程。

循环结束后，将转子从杯中取出，并用低絮凝擦拭纸彻底擦干转子和杯体。将 freshly drawn 全血样本轻轻颠倒数次以混匀。然后，用移液器将 25 微升全血加入 5 毫升等渗 PVP 溶液中。

盖紧小瓶后，再次轻轻倒置数次以混匀。在软件主菜单中选择变形性（deformability），然后创建新的分析并添加实验细节。接着，打开变形红细胞计数仪的盖子，确认转子已完全降入样品杯中，并且样品杯正在转动。

用移液器将1毫升PVP血液溶液加入杯壁与转子之间的空隙中。然后轻轻提起转子，使样品向下流动。等待所有气泡从溶液中排出后，关闭变形红细胞计的盖子。

通过移动软件中滚动条上的箭头，将增益调整为200。当温度稳定在37摄氏度且衍射图像稳定时，按下开始按钮。在数据采集过程中观察衍射图样，以确保其保持圆形、椭圆形或菱形。

数据采集完成后，打印报告并进行清洁。健康血液在剪切应力作用下获得的衍射图样显示出预期的椭圆形图案。伸长指数使用此处所示公式进行计算。

吸取样品时，在仪器处于清洗循环期间，将去离子水喷入转子与测量杯之间的空隙进行冲洗。清洗循环完成后，将转子从测量杯中提起，并使用低絮状清洁纸巾将转子和测量杯彻底擦干。充分干燥至关重要，因为残留水分会导致红细胞裂解，从而产生干扰。

选择导出以保存报告。最后，单击软件上的主菜单按钮返回主页面。按照之前的方法将另一个样本加载到ektacytometer中后，确保屏幕上出现稳定的衍射图像。

移动尺子沿屏幕调整相机增益，直至产生 3.8 cm 的衍射高度。使用尺子确认计算机屏幕上图像的高度。然后，按下开始按钮，像之前一样观察数据采集过程。

此图像显示了来自镰状细胞贫血患者血液的3.8 cm衍射图样。在按照前述方法清洗变形仪后，重复该操作以获得4.5 cm和5.4 cm高度下的衍射图样。在异质性血液样本中，由于刚性红细胞无法与可变形细胞正常对齐，导致出现菱形的衍射图样，从而引起衍射图样畸变。

随着相机增益调整以产生更大的衍射图案，这种畸变模式变得越来越明显。对于渗透梯度变形红细胞测定，首先将250微升全血加入含有5毫升等渗PVP的试管中，轻轻混匀。在软件主菜单中选择Osmoscan。

然后将装有血液PVP溶液的小瓶置于机器左侧针头的正下方。降低针头，直至其接触小瓶底部。确保管路已正确连接至低渗和高渗溶液，以用于梯度生成。

关闭ektacytometer的盖子，打开下半部分的门，以便观察血液进入管路的情况。点击“New Analysis”并输入实验细节。将相机增益调节至200后，让仪器持续运行，直至血液从仪器下方的管路进入样品杯中。

当计算机屏幕显示稳定的衍射图样时，点击对话框中的“立即开始”按钮以开始数据采集。让ektacytometer持续采集数据至约500毫渗摩尔每千克，然后停止仪器运行。打印报告。

接下来，取下旧的PVP血液样本管，更换为装有去离子水的洁净样本管。将针头下降至接触样本管底部，然后按下对话框中的清洗按钮，以冲洗梯度系统。清洗完成后，按下计算机显示器上对话框中的清洁选项，并选择导出以保存报告。

像之前一样将转子和杯体烘干。在健康志愿者中发现的均质血液群体，当测量衍射尺寸时，不会产生不同的变形性曲线。相比之下，镰状细胞贫血患者血液等异质性血液群体，其变形性测量值随衍射图样尺寸的增大而显著降低。

在镰状血中，当衍射图样畸变程度作为EI max的函数进行测量时，其与血红蛋白S以及成人血红蛋白变异体血红蛋白A2相关。输血可纠正这种畸变，表现为其与血液中正常成人血红蛋白百分比呈负相关。无论将衍射图样畸变程度作为达到半最大变形所需剪切应力的函数，还是作为EI max的函数进行测量，其均与胎儿血红蛋白相关。关键的渗透梯度变形红细胞测定参数，如EI max、EI min和O min，分别提供了关于细胞水合状态、表面积与体积比以及渗透脆性的额外信息。

一旦掌握，若操作得当，这些技术大约可在一小时内完成。在完成该实验步骤后，还可进行显微镜观察等其他方法，以进一步探究红细胞个体变形能力的相关问题。观看本视频后，您应对如何测量血液样本中的变形能力及血清异质性有充分的理解。