Name: CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习使用核糖核蛋白电穿孔法在小鼠和人造血祖细胞中进行CRISPR/Cas9基因敲除的高效方案。该方法可在不到一周内完成，编辑效率高达75%至98%，适用于研究正常和恶性造血过程中的基因功能。

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本工作得到了德克萨斯州癌症预防与研究研究所（RP160283、RP140001 和 R1201）、加布里埃尔癌症研究天使基金会、爱德华·P·埃文斯基金会以及美国国立卫生研究院（DK092883、CA183252、CA125123、P50CA126752、CA193235 和 DK107413）的资助。M.C.G. 得到贝勒医学院学生科研倡导者计划的支持。流式细胞术部分得到了美国国立卫生研究院（国家研究资源中心资助 S10RR024574、国家过敏与传染病研究所 AI036211 和国家癌症研究所 P30CA125123）对贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心设施的支持。

该实验方案遵循贝勒医学院人类伦理委员会的指导原则。所有在小鼠上进行的实验操作均经贝勒医学院机构动物护理与使用委员会批准。
1. sgRNA 正向链设计
<ol>
	<li>访问 http://www.crisprscan.org/?page=track8，开始设计感兴趣的 sgRNA。</li>
	<li>根据感兴趣的细胞类型，点击 &#34;Mouse&#34; 或 &#34;Human&#34; 按钮。</li>
	<li>在 UCSC 搜索框中输入目标基因，然后点击“go”。</li>
	<li>放大并移动至目标基因的特定区域（即某个特定外显子）。 
	注意：为实现高效的基因敲除，建议选择在特定细胞类型中所有转录异构体均包含的最早出现的外显子（或多个外显子）作为靶点。</li>
	<li>确保潜在的 sgRNA 靶序列列在 &#34;CRISPRscan predictions on genes (CDS)&#34; 标题下。</li>
	<li>查找并点击一个评分相对较高且脱靶位点较少（以亮绿色高亮显示）的靶序列。复制 &#34;Oligo sequence&#34; 部分显示的完整序列，并将其粘贴到文本文件中。在该序列的 3' 端添加 &#34;ATAGC&#34;。完成后，提交全长序列的合成订单。 
	注意：对于每个靶序列，CRISPRscan8 提供一个 &#34;integrated&#34; 正向 sgRNA 引物，其中包含 T7 启动子、原间隔序列（靶序列）以及通用支架重叠序列（见 图 1A）。全长序列由 56 或 57 个核苷酸组成，具体长度取决于原间隔序列的长度。</li>
</ol>
2. sgRNA DNA 模板合成
<ol>
	<li>溶解并稀释sgRNA正向引物和通用反向引物（完整序列见表1）。为获得10 µM的终浓度，请按照制造商说明将引物稀释至100 µM，然后用无核酸酶水进行1:10稀释。</li>
	<li>进行重叠PCR（见图1B），在PCR条状管中混合以下组分：2 µL 正向sgRNA引物（10 µM）、2 µL 通用反向支架引物（HPLC纯化）（10 µM）、10 µL 高保真DNA聚合酶预混液（2×）和6 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>运行以下PCR程序：95 °C 预变性3 min，98 °C 变性5 s，60 °C 退火5 s，72 °C 延伸10 s，重复第2步共6个循环，72 °C 延伸1 min，4 °C 保存。</li>
	<li>使用DNA纯化柱纯化PCR产物（参见材料表）。按照制造商说明操作，并用11.5 µL洗脱缓冲液洗脱。</li>
	<li>用分光光度计测定PCR产物的浓度。以洗脱缓冲液作为空白对照进行调零。 
	注意： DNA浓度应在约50至120 ng/µL之间。</li>
</ol>
3. 体外 sgRNA的转录
<ol>
	<li>在PCR条状管中混合以下组分（试剂来自RNA合成试剂盒）：4 µL洗脱的DNA、4 µL dNTPs、1 µL 10x反应缓冲液和1 µL T7 RNA聚合酶酶混合液。</li>
	<li>将样品在37 °C孵育至少4小时。</li>
	<li>使用RNase清除剂去除手套表面的RNase。</li>
	<li>用无核酸酶水将每份RNA样品补至总体积50 µL（按照制造商说明书进行RNA纯化的第一步）。</li>
	<li>按照制造商说明书继续进行RNA纯化，并用试剂盒提供的50 µL无核酸酶水洗脱。</li>
	<li>使用分光光度计测定洗脱sgRNA的浓度。用无核酸酶水作为空白对照校准仪器。 
	注意： 纯化后的预期产量为50 - 80 µg RNA（即浓度为1.0 - 1.5 µg/µL）。</li>
	<li>立即使用纯化的sgRNA，或将其分装为2 - 4 µL每份，于-80 °C长期保存。</li>
</ol>
4. 造血干细胞与祖细胞的分离与培养
<ol>
	<li>小鼠HSPCs的分离与培养 
	注意： 使用2至6月龄的雄性和雌性Ubc-GFP小鼠（JAX004353）与Rosa26-LSL-tdTomato小鼠（JAX007914）和Vav-iCre小鼠（JAX008610）杂交，以获得下述结果。
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位法处死麻醉后的小鼠。 
		注意： 两名经过培训的人员应通过观察至少5分钟无呼吸和心跳，独立确认动物安乐死成功。去除动物的皮肤。</li>
		<li>解剖小鼠的胫骨、股骨和髂嵴，去除骨骼周围的所有肌肉和结缔组织。将完整的骨骼放入含有添加2% FBS的HBSS（HBSS+）的组织培养皿中，并置于冰上。待所有骨骼清理完毕并转移至组织培养皿后，立即移入超净工作台。</li>
		<li>将清洗后的骨骼转移至无菌研钵中，每3根骨骼加入2 mL预冷的HBSS+。用研杵将骨骼研磨成骨碎片，使骨髓释放出来。持续研磨直至骨骼在研杵下不再发出碎裂声。</li>
		<li>从研钵中收集上清液，使用40 µm细胞滤筛过滤至50 mL锥形管中。用5 mL冰冻HBSS+冲洗残留的骨碎片，并通过同一40 µm滤筛过滤至同一50 mL锥形管中。</li>
		<li>用预冷的HBSS+溶液将细胞洗涤两次：补满离心管，400 × g离心7分钟，弃去上清液。</li>
		<li>第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于20 mL预冷的PBS中。采用台盼蓝排斥法计数活细胞。9.</li>
		<li>孵育 1 x 108 每1 mL 冰冷的含生物素标记的c-kit抗体（1:100稀释）的HBSS+中，于冰上孵育45分钟。</li>
		<li>用预冷的HBSS+洗涤细胞，400 × g离心7分钟，弃上清液。</li>
		<li>根据制造商说明书，用抗生物素磁珠孵育细胞。</li>
		<li>使用磁性柱或磁激活细胞分选仪，按照制造商说明书分离c-kit阳性细胞。将c-kit阳性细胞收集至15 mL锥形管中。</li>
		<li>用 PBS 将 15 mL 圆底离心管加满，400 × g 离心 7 分钟，洗涤细胞两次，每次弃去上清液。两次洗涤之间，通过台盼蓝排斥法计算活细胞总数。9.</li>
		<li>将 c-kit+ 细胞重悬至浓度最高达 106 每100 µL培养基中可存活的细胞数，用于补充2% FBS、50 ng/mL小鼠干细胞因子（SCF）、50 ng/mL小鼠血小板生成素（TPO）、10 ng/mL小鼠IL-3和10 ng/mL小鼠IL-6的小鼠HSPC培养。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 至少1小时，最长不超过电穿孔前24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人HSPCs的分离与培养 
	注意： 这些步骤必须在层流罩内进行。
	<ol>
		<li>通过40 µm细胞滤网过滤骨髓/脐带血细胞。</li>
		<li>用添加了1 mM EDTA的PBS（PBS/EDTA）将过滤后的骨髓/脐带血细胞按1:2比例稀释。</li>
		<li>将15 mL密度梯度介质加入50 mL锥形管中。沿管壁缓慢加入30 mL稀释后的骨髓/脐带血，使其轻柔地覆盖在密度梯度介质表面。若细胞悬液体积超过30 mL，需准备多个锥形管分装。 
		注意： 确保血液与密度梯度介质之间的界面尽可能清晰锐利。</li>
		<li>以750 × g离心30分钟，不设减速。</li>
		<li>收集可见于培养基界面的单个核细胞层，转移至一个洁净的50 mL锥形管中。用PBS/EDTA补满管体积，280 g离心15分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用 PBS/EDTA 以 400 × g 离心 7 分钟洗涤细胞两次，弃去上清液。</li>
		<li>按照制造商说明书，将单个核细胞与抗CD34磁珠共同孵育。</li>
		<li>使用磁性柱或磁激活细胞分选仪，按照制造商说明书分离CD34+细胞。将CD34+细胞收集至15 mL圆底离心管中。</li>
		<li>用 PBS 将收集的 CD34+ 细胞补至满管，于 400 × g 离心 7 分钟，弃上清，重复洗涤两次。两次洗涤之间，通过台盼蓝排斥法计算活细胞总数。9.</li>
		<li>用含有100 ng/mL人SCF、100 ng/mL人FLT3配体（FLT3L）和100 ng/mL人TPO的培养基重悬细胞，细胞浓度约为2.5 × 10⁶/mL5 活细胞数/mL。将分离得到的CD34+细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24小时，最迟不超过48小时，然后进行电穿孔。 
		注意： 电穿孔前，通过流式细胞术检测富集的CD34+细胞群体的纯度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 电穿孔
注意：以下方案针对 10 µL 电穿孔尖端进行了优化。所有步骤均应在超净工作台中进行。
<ol>
	<li>台盼蓝染色排除法计数细胞9. 收集 2 x 105 每个重复的活细胞数（例如，收集 6 x 105 用于3次电穿孔的细胞。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞两次，每次以 300 x g 离心 7 分钟，小心移除上清液。</li>
	<li>同时，除仅含 Cas9 的对照组外，为每个重复样品在 PCR 管中加入 1.5 µg Cas9 和 1 µg 总 sgRNA，在室温下孵育 20–30 分钟，以制备 Cas9-sgRNA RNP 复合物。 
	注意： Cas9蛋白的浓度为10 µg/µl。为确保准确移液，需用无核酸酶水将所需总量的Cas9蛋白按1:10比例稀释（例如，进行10次电穿孔时，取1 µl Cas9蛋白与9 µl无核酸酶水混合）。每份反应加入1 µl稀释后的Cas9蛋白。根据sgRNA的浓度，每份反应中Cas9与sgRNA的总体积应控制在1.7至2 µl之间。若使用两种sgRNA，每份反应中各加入500 ng；若使用三种sgRNA，则每份反应中各加入330 ng，依此类推。</li>
	<li>根据所需总重复数乘以10 µL计算所需重悬缓冲液T的总体积（例如，3次重复需要30 µL）。用计算出体积的缓冲液T重悬细胞沉淀。确保细胞悬液的最终浓度为2 × 107 cells/mL</li>
	<li>将重悬的细胞按每份10 µL分装至各含有预先复合的sgRNA/Cas9 RNP的PCR管中（例如，进行三重复实验时，将30 μL细胞悬液分装至含有预先复合的Cas9-sgRNA的PCR管中）。</li>
	<li>开启电穿孔系统，打开仪器电源，向电穿孔比色皿中加入3 mL缓冲液E，然后将比色皿插入比色皿架中。</li>
	<li>设定电穿孔仪的所需参数：人HSPCs（1600 V，10 ms，3次脉冲）或小鼠HSPCs（1700 V，20 ms，1次脉冲）。 
	注意： 如有需要，可在对CD34+ HSPC进行实验之前，采用相同策略在急性髓系白血病（AML）细胞系（如HL60）上检测sgRNA效率（AML细胞系使用无抗生素培养基），电穿孔条件如下：Buffer R，1350 V，35 ms，1次脉冲。</li>
	<li>使用一种特殊的电穿孔移液器进行电穿孔操作，该移液器带有可扣合在电穿孔移液器吸头上的爪状结构。握住电穿孔移液器，伸出爪状结构，夹住吸头内部的圆盘，然后用力将移液器向下压紧，以固定吸头。</li>
	<li>用移液器将样品上下吹打10次以充分混匀。吸取10 µL样品，确保无气泡，将移液器吸头直接插入电穿孔比色皿的电解缓冲液中，尽量避免接触比色皿内壁。按下 &#34;开始&#34; 在屏幕上。之后 &#34;完整&#34; 消息出现后，移除移液管，并将内容物加入含有新HSPC培养基的孔中。</li>
	<li>对所有样品重复上述操作。仅在必要时更换移液器吸头。</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Biologist%27s+Toolkit+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9.</a> Mol Cell. 58, 568-574 (2015).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32, 941-946 (2014).</li>
<li>Mandal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ablation+of+genes+in+human+hematopoietic+stem+and+effector+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9.</a> Cell stem cell. 15, 643-652 (2014).</li>
<li>Gundry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Genome+Editing+of+Murine+and+Human+Hematopoietic+Progenitor+Cells+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9.</a> Cell Rep. 17, 1453-1461 (2016).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature methods. 12, 982-988 (2015).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current protocols in immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).</li>
<li>Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+an+intricate+machinery+that+shapes+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 665-677 (2015).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42, e168(2014).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539, 384-389 (2016).</li>
<li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Transl Med. 8, 360ra134(2016).</li>
<li>Aguirre, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Copy+Number+Dictates+a+Gene-Independent+Cell+Response+to+CRISPR%2FCas9+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting.</a> Cancer Discov. 6, 914-929 (2016).</li>
</ol>

无利益冲突需披露

本详细方案中描述的RNP方法可高效实现小鼠和人类原代造血细胞以及悬浮细胞系的基因敲除。尽管通常可获得非常高的敲除效率，但仍需考虑几个关键变量。首先，外显子的选择对于确保高效的插入缺失（indel）整合对应于基因敲除至关重要。与外显子选择相关的两个重要因素是其在不同转录本异构体间的保守性以及在外显子在转录本中的位置。不同细胞类型之间的异构体表达模式存在差异，因此如果希望在多种细胞类型中实现基因敲除，应靶向在不同细胞类型间保持不变的外显子。异构体表达模式可通过q-PCR或RNA测序数据进行验证。关于外显子在转录本中的位置，最好选择较早的外显子，因为位于末端或倒数第二个外显子的移码突变可能逃逸无义介导的mRNA降解10，从而产生具有新功能或未知功能的蛋白，而非真正的功能缺失型蛋白。
确定插入缺失（indel）频率是评估基因敲除效率以及正确解读实验生物学结果的关键步骤。内切酶检测法（例如surveyor检测法）具有操作相对快速简便的优点。然而，由于存在显著的背景信号，这类方法往往不够准确，且结果通常难以重复。此外，它们无法提供有关实验中产生的插入缺失质量的信息（例如插入和缺失的长度）。Sanger测序为内切酶检测法提供了一种有价值的替代方案。诸如TIDE11（https://tide.nki.nl/）等平台可帮助分解Sanger测序峰图，准确估算等位基因破坏效率，同时提供各个插入缺失事件的频率。其主要缺点是对高质量Sanger测序峰图的绝对依赖。高通量扩增子测序克服了上述大部分问题。扩增子文库可在极低DNA投入量的基础上构建，且高测序深度可确保结果的可靠性。为了降低扩增子测序的成本，我们通常将扩增子文库混入更大的测序运行中（例如RNA测序），仅占用总读段数的1 - 1.5%。最后，为确认基因敲除成功，我们强烈建议在条件允许时通过Western印迹或流式细胞术检测蛋白水平。
如前所述，本文介绍的方法快速且简便，为研究小鼠和人HSPC中的基因敲除提供了一种新工具。尽管本方案提供了基于尖端电穿孔系统的基因敲除操作步骤，但其他系统也已证明具有高效性12,13。
关于RNP方法，需要指出两个主要局限性。首先，正如我们课题组所述，使用体外转录的sgRNA对HSPC进行电穿孔时，细胞活力可能因电穿孔过程而显著受损，尤其是在非最优条件下6如有需要，可使用商业合成的sgRNA（即消除） 体外 转录）可能解决这一问题。随着成本逐渐降低，这些试剂盒可从多家供应商处购买。在此情况下， 体外 转录可用于生成sgRNA文库以筛选其有效性，随后可选择最高效的sgRNA（s）进行合成。RNP方法的第二个主要局限性在于无法像基于病毒的方法那样追踪成功转染的细胞。然而，在许多实验场景中，Cas9-sgRNA RNP所实现的高敲除效率和快速编辑效果可能超过这些缺点。我们建议使用高通量扩增子测序来精确测定每次实验中的基因中断效率。如果目标基因的敲除预期会带来增殖表型（即与野生型细胞相比，增殖能力降低或增强），则通过在多个时间点测定插入缺失（indel）频率，可评估敲除细胞是否发生富集（即indel频率随时间增加）或被竞争淘汰即插入缺失频率随时间降低。
为了理解基因功能缺失的生物学效应而进行的体内或体外实验需要设置适当的对照。如前所述，体外转录的sgRNA可能对细胞具有毒性，尤其是对原代前体细胞6。此外，Cas9蛋白引起的DNA双链断裂可能引发与基因无关的抗增殖反应14。因此，在CRISPR实验中，我们通常使用多种对照sgRNA，并建议选择一种在目标细胞类型中表达的细胞表面标志物，以及一个不表达的第二个靶基因作为对照。
在细胞因子存在下对人HSPC进行短期培养可提高基因编辑效率6，并是实现高效基因敲除（KO）所必需的步骤。我们发现电穿孔前培养36至48小时为最佳时长6。电穿孔后，细胞可进一步培养，但需注意培养时间越长，多谱系植入能力丢失的风险越高。因此，我们通常在电穿孔后6小时进行移植，最晚不超过电穿孔后24小时。
CRISPR/Cas9 显著提高了科学家成功编辑哺乳动物细胞基因组的能力。预计在原代造血祖细胞中实现更可行的基因敲除，将快速推动造血干细胞与祖细胞（HSPC）及血液系统疾病领域的科学认知。尤为重要的是，本文所述方案还可高效地同时构建多个基因敲除，从而能够模拟在白血病等疾病中常见的复杂遗传背景。
尽管本文所述的实验方案主要针对基因敲除，但也可轻松调整用于基因敲入实验。这可以通过共递送用于同源定向修复6,13（HDR）的单链寡核苷酸模板，或在电穿孔后通过含有同源模板的AAV6载体转导细胞来实现12。在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中修复或引入特定突变的能力，将促进基因治疗新策略的发展，并推动对急性髓系白血病（AML）及其他血液系统疾病中癌基因驱动突变的深入研究。尽管在人HSPCs中实现HDR已取得成功6,12,13，但在小鼠HSPCs中应用该策略进行基因编辑仍较为困难6。优化人尤其是小鼠HSPCs中的HDR实验方案，将有助于实现更精确的基因编辑，并开发利用内源性标签追踪编辑细胞的工具。
最后，破坏突变型功能获得性等位基因也可能成为先天性和获得性造血系统疾病的潜在治疗策略。在此情况下，建议采用无DNA的方法，以避免可能引起转化的整合事件。此外，&#34;瞬时作用并撤离&#34;策略可降低产生非预期脱靶效应的可能性。未来仍需进一步努力，开发特异性的递送系统，从而为恶性及非恶性血液系统疾病的治疗开辟新途径。

CRISPR/Cas9 技术的出现极大地简化了哺乳动物细胞中的基因编辑。早期的 CRISPR/Cas9 实验方案采用质粒或病毒介导的方式递送 Cas9 蛋白和 sgRNA1,2,3。这些方法在细胞和动物模型的构建中具有革命性意义，并已成功应用于原代造血干细胞和祖细胞（HSPCs）4,5。然而，这些方法仍存在若干缺点。首先，基因敲除效率通常低于 50%4,5。尽管该效率足以在细胞系中建立基因敲除（KO）克隆，但由于 HSPCs 需要短期培养，因此不适合采用此类策略。其次，克隆步骤的要求限制了单次实验中可测试的 sgRNA 数量，并产生较大且难以转染的构建体。第三，这些方法导致实验周期较长。
为了克服这些局限性，我们课题组开发了一种基于Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNPs）递送的替代性CRISPR/Cas9方法，并已近期在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中发表6. 在该策略中，CRISPR 的原始组分（Cas9 蛋白和 体外 转录的sgRNA）预先形成复合物，并通过电穿孔直接递送至靶细胞图1。由于Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物的半衰期短于质粒或病毒核酸的转录时间，因此相较于早期方法，其脱靶率更低7此外，核糖核蛋白（RNP）方法的优势在于可消除任何外源DNA的引入，避免其随机整合至靶细胞基因组中，从而导致细胞转化。
本实验方案基于一种简化的RNP介导的基因敲除实验工作流程，如图1所示。第一步是为每个sgRNA设计并订购引物。这些引物用于制备sgRNA的DNA模板，进而通过体外转录（IVT）获得sgRNA。纯化的sgRNA随后与预先购买的Cas9蛋白孵育，形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。最后，将预先形成的Cas9-sgRNA RNP通过电穿孔导入细胞。电穿孔后，可根据需要检测编辑效率，并开展体外/体内实验。以下将详细介绍这一创新性实验方法。

<table><tbody><tr><td>根据细胞数量选择组织培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Sigma</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水 —— DEPC 处理</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2600</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap RNA酶去污染溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean and Concentrator-25</td><td>Zymo</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 高产量 RNA 合成试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 3NLS，100 &amp;micro;g</td><td>IDT</td><td>1074181</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 细胞筛</td><td>VWR</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA008-050</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)，常规</td><td>Corning</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro 分离仪或 MACS 手动细胞分离柱</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统设备</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 mL 套件</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>适用于细胞数量较多的情况（见实验方案），可使用 Neon 转染系统 100 mL 套件 (# MPK10025)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7851</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit UltraPure 人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>Stem Span SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>重组人 SCF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-695</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>重组人 TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>重组人 FLT3L</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-479</td><td>仅用于人源实验</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小鼠解剖工具</td><td></td><td></td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td></td><td></td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>生物素标记的抗 c-kit 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-1171-82</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>抗生物素 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>X VIVO-15，含 L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>小鼠 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>小鼠 TPO</td><td>Peprotech</td><td>315-14</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>小鼠 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr><tr><td>小鼠 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>仅用于小鼠实验</td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

造血干细胞（HSCs）领域的进展得益于对原代前体细胞以及动物模型进行遗传工程改造的方法。在HSCs中实现基因的完全敲除，需要从基因敲除小鼠中分离HSCs，而对原代人HSCs进行基因敲除则无法实现。病毒转导可用于基因敲减策略，但其效率存在较大变异。总体而言，对人和小鼠造血细胞的遗传操作受限于较低的效率，以及耗时长、成本高的问题。近年来，CRISPR/Cas9技术极大地拓展了对哺乳动物细胞DNA进行工程化改造的能力。然而，将CRISPR/Cas9应用于造血细胞仍面临挑战，主要原因是其转染效率较低，基于质粒的方法具有毒性，以及基于病毒的实验流程周转时间较长。
本文提供了一种快速对小鼠和人类造血干细胞及祖细胞进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑的方法，基因敲除效率可高达90%。该方法采用核糖核蛋白（RNP）递送策略，具有简化的三天工作流程。利用Cas9-sgRNA RNP可实现“瞬时作用、迅速退出”的编辑方式，不会在编辑细胞的基因组中引入外源DNA序列，并可降低脱靶效应。基于RNP的方法快速且简便：无需进行sgRNA克隆、病毒制备或特定的sgRNA化学修饰。通过本实验方案，科研人员可在一周内成功实现目标基因在原代造血细胞中的敲除，该时间已包含寡核苷酸合成所需的等待时间。该方法将使更广泛的用户群体能够根据自身需求灵活应用此方案。

本实验方案的目标是利用 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物（RNP）在小鼠和人类造血干细胞/祖细胞（HSPC）中实现基因敲除（KO）。该实验流程简便快速，从实验设计到基因敲除效率的评估可在不到一周的时间内完成。
与基于质粒或病毒的方法相比，本方案的成功在于将sgRNA核糖核蛋白复合物（sgRNA RNPs）与电穿孔技术相结合。这种无需克隆的策略显著缩短了获得转染所需组分的时间。此外，电穿孔可实现高达95%的细胞转染效率，最大限度地提高了RNPs的递送效率。sgRNA可通过体外转录在实验室中合成 体外 体外转录（IVT），而纯化的Cas9蛋白可从多家公司购买（见实验方案）。用于IVT的sgRNA DNA模板通过使用sgRNA正向引物（sgRNA Fwd primer）进行短片段PCR扩增获得图1A，B）和通用骨架Rev引物（图1B - 参见方案）。将PCR产物作为体外转录（IVT）的模板使用图1CCas9-sgRNA RNP 复合物通过将 sgRNA 与 Cas9 共同孵育 15–30 分钟生成图1C）。最后，将sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）通过电穿孔导入细胞。经编辑的造血干细胞和祖细胞（HSPC）随后可用于开展以下实验 体外 和 体内 实验。
小鼠细胞中的基因敲除
为了验证Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）电穿孔策略的有效性，我们对从小鼠中分离的、普遍表达GFP或tdTomato的c-kit+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行了针对GFP或tdTomato的sgRNA电穿孔。在设计的三种针对GFP的sgRNA中，GFP sg1表现出最高的效率，流式细胞术检测显示其GFP表达破坏率约为70 - 75%（图2A，B）。为了在基因组水平上定量基因破坏频率，我们提取了电穿孔后细胞的基因组DNA，并进行了基于T7内切酶I（T7EI）的检测。如图2C所示，T7EI检测到高达60%的插入缺失（indel）形成。需要注意的是，T7EI检测通常会低估indel的发生频率。我们还设计了针对tdTomato的sgRNA，并对来自Rosa26位点表达tdTomato的HSPCs进行了电穿孔。如图2D所示，tdTomato sg1高效地消除了tdTomato的表达。
人类细胞中的基因失活
此处展示了一种针对CD45的单条sgRNA策略所实现的高效基因敲除效果。CD45是一种在造血细胞上表达的细胞表面标志物。设计了三条靶向CD45不同外显子的sgRNA（CD45 sg1、sg2和sg3），并在HL60急性髓系白血病细胞系中检测其效率（图3A）。电穿孔后第5天通过流式细胞术评估蛋白敲除效果。其中CD45 sg1效率最高（敲除效率达98%，见图3A），因此被用于后续实验。图3B展示了使用CD45 sg1对人原代CD34+祖细胞进行CD45基因敲除的结果，电穿孔后第5天通过流式细胞术检测。结果显示，CD34的表达未受影响，而约80%的细胞失去了CD45的表达。电穿孔6小时后，将200,000个经编辑的原代CD34+细胞通过眶后注射移植到NSG小鼠体内。移植3个月后采集骨髓和脾脏细胞进行分析。仅在sgRNA处理组样本中可检测到被编辑的细胞（HLA-ABC阳性、CD45阴性，以红色标出），而在仅表达Cas9的对照组中未检测到（图3C）。
如有需要，可使用两个靶向邻近序列的sgRNA来产生缺失。该方法可通过PCR快速评估编辑效率，且通常可实现更高的基因破坏效率。图3D展示了在DNMT3A基因的第10号外显子中高效产生58 bp缺失的结果。电穿孔后6小时，将200,000个经编辑的CD34+细胞移植到NSG小鼠体内。移植后5个月，在外周血中清晰检测到该58 bp缺失（图3E），证实CD34+细胞已被成功编辑并具备长期植入能力。
<img alt="sgRNA合成过程、引物设计、PCR设置、基因编辑研究中的Cas9复合物示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：快速简便地生成sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）的方法。A） sgRNA正向引物（sgRNA Fwd primer）示意图。该引物是一种DNA寡核苷酸，包含T7启动子、靶向序列（protospacer sequence）以及与sgRNA骨架序列互补的重叠区域。在3'端以红色标出的是“ATAGC”序列，需将其添加至从CRISPRscan获取的sgRNA正向引物序列末端。B） 用于获得体外转录（IVT）模板的重叠PCR示意图。sgRNA正向引物与通用骨架反向引物（Universal Scaffold Rev primer）之间的序列重叠，使得通过PCR实现延伸与扩增成为可能。C） 描述体外转录反应及sgRNA RNP预复合过程的示意图。PCR产物经纯化后作为体外转录（IVT）的模板，IVT可大量生成sgRNA，可用于多次重复实验（见实验方案）。sgRNA RNP通过将IVT纯化的sgRNA与预先购买的Cas9蛋白共同孵育而形成。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析，GFP表达，柱状图百分比，凝胶电泳，基因编辑结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠造血祖细胞中高效的基因敲除。A) 将靶向 GFP 的单导向 RNA（GFP sg1）与 Cas9 蛋白共同通过电穿孔导入表达 GFP 的小鼠 c-kit+ HSPC，并在电穿孔后 24 小时通过流式细胞术进行分析。B) 将不同量的 GFP sg1 与 1 µg Cas9 蛋白形成复合物并进行电穿孔。仅需 200 ng 的 GFP sg1 即可高效消除 GFP 表达。C) 对 A-B 中所用细胞提取的基因组 DNA 进行 T7EI 检测。扩增跨越 Cas9-sgRNA 切割位点的 PCR 产物，按 1:4 比例稀释于 1× Buffer 2 中，并在梯度 PCR 仪中缓慢退火。退火后的产物随后在 37 °C 条件下用 1.25 U 的 T7 内切酶 I 消化 10 分钟。消化产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。使用 ImageJ 软件对每条泳道的条带强度进行绘图分析。切割百分比通过切割条带与未切割条带强度的比值计算得出。D) 从小鼠中分离出表达 tdTomato 的 c-kit+ HSPC，并通过电穿孔导入与靶向 tdTomato 的 sgRNA 形成复合物的 Cas9 蛋白。电穿孔后 24 小时进行流式细胞术分析，结果显示约 74% 的细胞删除了 tdTomato。R26 = Rosa26。* p &lt;0.05，** p &lt;0.01，*** p &lt; 0.001。本图改编自 Gundry et al.6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术与PCR结果；CD45基因编辑影响；Cas9与sgRNA分析；血细胞数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：人类造血细胞中高效的基因敲除。A） 设计并测试了三种靶向 CD45 的 sgRNA（CD45 sg1、sg2 和 sg3），在 HL60 急性髓系白血病细胞系中进行电穿孔（电穿孔条件见实验方案）。电穿孔后 5 天进行流式细胞术分析。结果显示，CD45 sg1 在三种 sgRNA 中敲除效率最高（敲除效率达 98%）。 B) 使用 CD45 sg1 在原代人脐带血 CD34+ HSPC 中进行 CD45 基因敲除。约 80% 的细胞中可检测到 CD45 缺失。请注意，编辑后 CD34 表达未发生变化。 C) 经编辑的人类HSPC可高效移植至NSG小鼠体内。在仅移植Cas9的对照组小鼠中，人类有核细胞呈现正常的HLA+/CD45+表型；而在移植经CD45-sg1处理的CD34+细胞的小鼠中，同时观察到HLA+/CD45+和HLA+/CD45-两种细胞群，表明人类CD45基因敲除细胞已成功植入。D) 2%琼脂糖凝胶显示，通过两个sgRNA（双导向策略）在CD45基因第10外显子中诱导产生58 bp的缺失。 DNMT3A 在来自3个不同脐带血样本（CB1、CB2和CB3）的人类HSPC中。电穿孔后3天进行PCR检测。E）2%琼脂糖凝胶显示，移植至NSG小鼠体内5个月后仍存在58 bp的缺失。该图改编自Gundry 等6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸</td>
			<td colspan="3">序列</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Rev scaffold primer </td>
			<td colspan="3">agcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac</td>
			<td>用于重叠 PCR 的通用反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGTGCTGGTGTTGGGCGCACgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 2</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGAGCAAGTGAGGATCCTCgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 3</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGATGCTTGTTCCCTTCAGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDNMT3A Ex10 sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDNMT3A Ex10 sg2</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGTGGCCAGCAGCCGCGCGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26 sgRNA</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGCGAGGAGCTGTTCACCGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGGTACAGGCGCTCGGTGGgtttaagagctagaaatagc</td>
			<td>用于重叠 PCR 的 sgRNA 正向引物序列</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：实验中使用的sgRNA正向引物及通用反向引物的完整序列。

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外 转录和商业化Cas9。在有限的时间和经济成本下即可实现高效的编辑效率。

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

造血干细胞（HSCs）领域的进展得益于对原代祖细胞以及动物模型进行遗传工程改造的方法。

本实验方案的总体目标是通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白方法，实现对原代造血祖细胞的快速高效基因敲除。该方法可用于回答正常与恶性造血研究领域中的关键科学问题，例如：基因X缺失后会产生哪些分子层面和表型层面的后果。该技术的主要优势在于操作极为简便、快速且成本低廉。从实验设计到实施的预计所需时间少于一周。尽管该方法已针对造血祖细胞进行了优化，但也可应用于其他细胞类型，例如原代T细胞、小鼠和人源造血细胞系以及原代白血病样本。我们最初产生该方法的想法，是由于意识到其他CRISPR/Cas9递送方式（包括质粒和病毒）对我们的细胞具有毒性或周转时间较慢。为了设计感兴趣的单导向RNA，首先访问CRISPRscan网站。根据目标细胞类型，点击小鼠或人类按钮，然后在 UCSC 搜索框中输入目标基因并点击“go”。接下来，放大至您希望靶向的外显子区域。查看“Genes”标题下的 CRISPRscan 预测中是否列出了任何单导向 RNA 靶序列。接下来，单击标记为绿色矩形的目标单导向RNA，并复制“Oligo序列”下方显示的完整序列。然后将该序列粘贴到文本文档中。接着，在该序列的3'端添加核苷酸ATAGC。订购全长序列。现在，为了合成单导向RNA的DNA模板，溶解并稀释单导向RNA正向引物和通用反向引物。然后将所有试剂加入PCR管中，进行重叠PCR。配制PCR反应后，将反应管放入热循环仪中并运行程序。程序结束后，使用DNA纯化柱纯化PCR产物。用11.5 µL洗脱缓冲液稀释DNA。然后，在分光光度计上使用洗脱缓冲液作为空白对照。用分光光度计测定样品 DNA 的浓度。首先，在 PCR 条形管中混合洗脱的 DNA、脱氧核苷三磷酸、反应缓冲液和 T7 RNA 聚合酶酶混合物。然后将样品在37摄氏度孵育4小时。接着，使用RNase清洁剂去除正在使用的手套上的RNase。随后，用无核酸酶水将每个RNA样品的体积调整至50微升。根据制造商说明书纯化RNA。最后，用50 µL无核酸酶的水洗脱RNA。首先，使用无核酸酶的水对分光光度计进行空白校正，然后测定洗脱RNA的浓度。使用台盼蓝排斥法计数细胞数量。每次重复实验收集 200,000 个活细胞，然后加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞。随后以 300 × g 离心 7 分钟。离心后，小心移除上清液。在离心过程中，将1.5微克Cas9与1微克总单导向RNA在PCR管中孵育20至30分钟，以制备每个重复所需的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。计算所需重悬缓冲液T的体积后，将获得的细胞沉淀溶解于重悬缓冲液T中。然后取10微升溶解后的细胞悬液加入含有Cas9-sgRNA RNP复合物的PCR管中。接着打开电穿孔仪，将比色皿插入比色皿架中。然后加入三毫升缓冲液E。设置电穿孔仪的参数。进行电穿孔操作时，首先握住电穿孔移液器，伸出夹爪并抓住移液器吸头内部的圆盘，然后用力将移液器向下压紧以固定吸头。接着，通过上下吹打10次混匀样品。吸取10微升样品，并确保无气泡产生。接着，将枪头直接插入电穿孔比色皿的电解缓冲液中。然后点击屏幕上的“开始”按钮。让完整的消息显示在屏幕上。然后将移液器从比色皿中取出。接着，将比色皿中的内容物排入已加入新鲜HSPC培养基的孔中。为了研究Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物电穿孔的效率，从小鼠中分离的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）被电穿孔导入靶向GFP或tdTomato的单导向RNase。这些HSPCs普遍表达GFP或tdTomato。流式细胞术分析显示，在蛋白水平上，HSPCs中GFP或tdTomato表达的丢失率分别约为75%和74%。然后，利用电穿孔细胞中GFP位点PCR扩增的DNA进行基于T7核酸内切酶1的检测，以定量分析GFP基因的破坏效率。使用ImageJ软件计算切割条带与未切割条带的强度比值，从而计算出切割百分比。在HL-60急性髓系白血病细胞系中测试了三种靶向人CD45的不同单导向RNA的效率。流式细胞术结果显示，与对照组相比，单导向RNA1的敲除效率最高，达到98%。随后，使用单导向RNA1在原代人脐血CD34阳性造血干细胞和祖细胞中也进行了CD45敲除实验。流式细胞术分析显示，与仅使用Cas9相比，近80%的细胞CD45表达缺失，而CD34表达未发生改变。为了研究人源CD45基因敲除的HSPC细胞的植入情况，从CD34阳性、经眼后静脉转染的NSG小鼠中分离骨髓和脾脏细胞进行分析，结果显示编辑后的细胞为HLA-ABC阳性且CD45阴性。一旦掌握该技术，若操作正确，可在三天内完成本实验方案。在进行该实验操作时，务必注意保持所有表面和试剂均无RNase污染，使用多种技术验证基因敲除的效率，并设置适当的实验对照。观看本视频后，您应能够充分掌握如何设计、合成Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物，并将其转染至造血祖细胞中，以实现快速而高效的基因敲除。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。...

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。...

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

学习使用核糖核蛋白电穿孔法在小鼠和人造血祖细胞中进行CRISPR/Cas9基因敲除的高效方案。该方法可在不到一周内完成，编辑效率高达75%至98%，适用于研究正常和恶性造血过程中的基因功能。

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

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