利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因
2018年4月10日
本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外 转录和商业化Cas9。在有限的时间和经济成本下即可实现高效的编辑效率。
本实验方案的总体目标是通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白方法，实现对原代造血祖细胞的快速高效基因敲除。该方法可用于回答正常与恶性造血研究领域中的关键科学问题，例如：基因X缺失后会产生哪些分子层面和表型层面的后果。该技术的主要优势在于操作极为简便、快速且成本低廉。从实验设计到实施的预计所需时间少于一周。
尽管该方法已针对造血祖细胞进行了优化，但也可应用于其他细胞类型，例如原代T细胞、小鼠和人源造血细胞系以及原代白血病样本。我们最初产生该方法的想法，是由于意识到其他CRISPR/Cas9递送方式（包括质粒和病毒）对我们的细胞具有毒性或周转时间较慢。为了设计感兴趣的单导向RNA，首先访问CRISPRscan网站。
根据目标细胞类型，点击小鼠或人类按钮，然后在 UCSC 搜索框中输入目标基因并点击“go”。接下来，放大至您希望靶向的外显子区域。查看“Genes”标题下的 CRISPRscan 预测中是否列出了任何单导向 RNA 靶序列。
接下来，单击标记为绿色矩形的目标单导向RNA，并复制“Oligo序列”下方显示的完整序列。然后将该序列粘贴到文本文档中。接着，在该序列的3'端添加核苷酸ATAGC。
订购全长序列。现在，为了合成单导向RNA的DNA模板，溶解并稀释单导向RNA正向引物和通用反向引物。然后将所有试剂加入PCR管中，进行重叠PCR。
配制PCR反应后，将反应管放入热循环仪中并运行程序。程序结束后，使用DNA纯化柱纯化PCR产物。用11.5 µL洗脱缓冲液稀释DNA。
然后，在分光光度计上使用洗脱缓冲液作为空白对照。用分光光度计测定样品 DNA 的浓度。首先，在 PCR 条形管中混合洗脱的 DNA、脱氧核苷三磷酸、反应缓冲液和 T7 RNA 聚合酶酶混合物。
然后将样品在37摄氏度孵育4小时。接着，使用RNase清洁剂去除正在使用的手套上的RNase。随后，用无核酸酶水将每个RNA样品的体积调整至50微升。
根据制造商说明书纯化RNA。最后，用50 µL无核酸酶的水洗脱RNA。首先，使用无核酸酶的水对分光光度计进行空白校正，然后测定洗脱RNA的浓度。
使用台盼蓝排斥法计数细胞数量。每次重复实验收集 200,000 个活细胞，然后加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞。随后以 300 × g 离心 7 分钟。
离心后，小心移除上清液。在离心过程中，将1.5微克Cas9与1微克总单导向RNA在PCR管中孵育20至30分钟，以制备每个重复所需的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。
计算所需重悬缓冲液T的体积后，将获得的细胞沉淀溶解于重悬缓冲液T中。然后取10微升溶解后的细胞悬液加入含有Cas9-sgRNA RNP复合物的PCR管中。接着打开电穿孔仪，将比色皿插入比色皿架中。
然后加入三毫升缓冲液E。设置电穿孔仪的参数。进行电穿孔操作时，首先握住电穿孔移液器，伸出夹爪并抓住移液器吸头内部的圆盘，然后用力将移液器向下压紧以固定吸头。接着，通过上下吹打10次混匀样品。
吸取10微升样品，并确保无气泡产生。接着，将枪头直接插入电穿孔比色皿的电解缓冲液中。然后点击屏幕上的“开始”按钮。
让完整的消息显示在屏幕上。然后将移液器从比色皿中取出。接着，将比色皿中的内容物排入已加入新鲜HSPC培养基的孔中。
为了研究Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物电穿孔的效率，从小鼠中分离的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）被电穿孔导入靶向GFP或tdTomato的单导向RNase。这些HSPCs普遍表达GFP或tdTomato。流式细胞术分析显示，在蛋白水平上，HSPCs中GFP或tdTomato表达的丢失率分别约为75%和74%。
然后，利用电穿孔细胞中GFP位点PCR扩增的DNA进行基于T7核酸内切酶1的检测，以定量分析GFP基因的破坏效率。使用ImageJ软件计算切割条带与未切割条带的强度比值，从而计算出切割百分比。
在HL-60急性髓系白血病细胞系中测试了三种靶向人CD45的不同单导向RNA的效率。流式细胞术结果显示，与对照组相比，单导向RNA1的敲除效率最高，达到98%。随后，使用单导向RNA1在原代人脐血CD34阳性造血干细胞和祖细胞中也进行了CD45敲除实验。
流式细胞术分析显示，与仅使用Cas9相比，近80%的细胞CD45表达缺失，而CD34表达未发生改变。为了研究人源CD45基因敲除的HSPC细胞的植入情况，从CD34阳性、经眼后静脉转染的NSG小鼠中分离骨髓和脾脏细胞进行分析，结果显示编辑后的细胞为HLA-ABC阳性且CD45阴性。一旦掌握该技术，若操作正确，可在三天内完成本实验方案。
在进行该实验操作时，务必注意保持所有表面和试剂均无RNase污染，使用多种技术验证基因敲除的效率，并设置适当的实验对照。观看本视频后，您应能够充分掌握如何设计、合成Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物，并将其转染至造血祖细胞中，以实现快速而高效的基因敲除。
概述
本文介绍了一种利用核糖核蛋白方法在小鼠和人类原代造血细胞中快速实现 CRISPR/Cas9 介导基因敲除的实验方案。该方法可在最短的时间和最低的成本下实现高效的基因编辑。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因编辑
- 造血细胞生物学
- CRISPR/Cas9 技术
背景
- CRISPR/Cas9 是一种用于基因敲除的强大工具。
- 原代造血细胞对于研究造血过程至关重要。
- 传统的 CRISPR 递送方法可能具有毒性或效率低下。
- 本方案旨在提高效率并降低成本。
研究目的
- 开发一种快速高效的基因敲除方法。
- 研究基因缺失对造血祖细胞的影响。
- 提供一种适用于多种细胞类型的实验方案。
使用的方法
- 使用 CRISPRscan 设计单导向 RNA。
- 合成 RNA 并制备 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物。
- 通过电穿孔将 RNP 复合物导入原代造血细胞。
- 利用流式细胞术和 T7 核酸内切酶检测评估基因破坏效率。
主要结果
- 在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中实现了约 75% 的靶基因表达下调。
- 在 HL-60 急性髓系白血病细胞系中展示了 98% 的基因敲除效率。
- 在原代人脐带血细胞中显示出有效的基因破坏效果。
- 证实了经基因编辑的细胞在 NSG 小鼠体内的成功植入。
结论
- 该方案效率高，可在一周内完成。
- 适用于多种造血细胞类型。
- 保持无RNase环境对成功至关重要。
常见问题
行业重要性概述
在原代造血细胞中高效实现基因敲除，可加快血液学药物研发中的靶点验证和机制去风险化。核糖核蛋白CRISPR/Cas9方法通过递送高敲除效率且不含外源DNA的系统，减少了生物学不确定性，从而提升早期靶点筛选的可预测性。该工作流程通过在与疾病相关的造血系统中提供一种可扩展、成本效益高的功能基因组学方法，显著缩短了肿瘤学和免疫学项目的研发周期。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在原代小鼠和人类造血祖细胞中实现快速基因敲除，能够验证治疗假说。
- 操作价值：在急性髓系白血病（AML）细胞系中可实现高达98%的基因敲除效率，在原代人脐带血造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中可达80%，从而支持生物学风险评估。
- 战略价值：可在与疾病相关的系统中快速评估基因缺失表型，从而提高靶点确信度并助力研发管线筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为下游化合物筛选和表型分析制备经过验证的基因敲除造血细胞。
- 操作价值：通过RNP电穿孔结合定量流式细胞术和T7核酸内切酶检测，实现标准化、可重复的基因破坏。
- 战略价值：可在原代细胞、细胞系及原代白血病样本中进行规模化平台应用，实现一致的靶点验证。
转化与临床前研究
- 科学价值：展示了基因编辑的人类造血干细胞（HSPCs）在NSG小鼠体内的植入效果，支持从发现到临床前验证的转化连续性。
- 操作价值：提供了一个与靶点验证研究的临床前时间线相兼容的三日简化工作流程。
- 战略价值：降低了造血系统靶点的机制不确定性，有助于在肿瘤学和免疫学研发管线中做出基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可融入从靶点鉴定到先导化合物优化的整个发现流程，能够在化合物筛选前快速对造血系统靶点进行功能验证。
- 发现生物学：通过在原代造血细胞中高效地进行基因敲除，支持假设验证和信号通路的阐明。
- 筛选：提供即用型基因敲除模型，具有高度可重复性和定量输出结果，可用于可靠的化合物评估。
- 分析：通过流式细胞术和T7核酸内切酶检测，生成可量化的基因编辑效率数据，实现不同实验条件间的比较分析。
- 转化研究：通过体内实验证实经基因编辑的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）可成功植入，连接基础发现与临床前验证。
- 企业级应用：建立可重复使用的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）平台，适用于多种造血细胞模型，减少重复的方案开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：在靶点验证中具有可预测的置信度，可降低机制上的模糊性，并在不整合DNA的情况下实现高保真度的基因敲除。
- 操作价值：在原代和转化的造血细胞中实现基因编辑的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：在血液系统药物研发项目中，提升“推进/终止”决策质量，提高资金使用效率，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于快速、高效靶基因敲除数据，进行风险校正后的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆、RNA 操作和电穿孔技术方面的专业知识。
- 依赖于热循环仪、分光光度计、电穿孔仪以及用于验证的流式细胞术设备的可及性。
- 需要无RNase的环境以及标准化的试剂操作，以确保核糖核蛋白复合物（RNP）的稳定性及编辑效率。
- 需要针对不同的造血模型和靶基因进行向导RNA设计的调整与优化。
- 实际限制：效率可能因细胞类型和靶位点而异，需对每个目标基因进行实证验证。
