CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

该方案的总体目标是使用核糖核蛋白方法通过 CRISPR/Cas9 和原代造血祖细胞实现快速有效的基因破坏。这种方法可以回答正常和恶性造血领域的关键问题，例如基因 X 丢失的分子和表型后果是什么，该技术的主要优点是极其简单、快速且具有成本效益。从实验构思到执行所需的估计时间少于一周。

尽管该方法已针对造血祖细胞进行了优化，但它可应用于其他细胞类型，例如原代 T 细胞、小鼠和人造血细胞系以及原代白血病样本。当我们意识到其他 CRISPR/Cas9 递送方法（包括质粒和病毒）对我们的细胞有毒或周转时间缓慢时，我们第一次有了这种方法的想法。为了设计感兴趣的单向导 RNA，首先导航到 CRISPRscan 网站。

根据目标细胞，点击鼠标或人类按钮，然后在 UCSC 搜索框中输入目标基因并单击开始。接下来，放大您想要定位的外显子。检查在"CRISPRscan predictions on Genes"标题下是否列出了任何单向导 RNA 靶序列。

接下来，单击标记为绿色矩形的目标单向导 RNA，并复制 Oligo 序列下显示的完整序列。然后将序列粘贴到文本文档中。接下来，将核苷酸 ATAGC 添加到序列的三个引物末端。

为全长序列下订单。现在，要合成单向导 RNA 的 DNA 模板，溶解并稀释单向导 RNA 正向和通用反向引物。然后将所有试剂添加到 PCR 管中以执行重叠 PCR。

构建 PCR 反应后，将试管放入热循环仪中并运行程序。程序结束后，使用 DNA 纯化柱纯化 PCR 产物。在 11.5 μL 洗脱缓冲液中稀释 DNA。

然后，在分光光度计上使用洗脱缓冲液作为空白。在分光光度计上测量样品 DNA 的浓度。首先，在 PCR 联管中混合洗脱的 DNA、脱氧核苷酸磷酸盐、反应缓冲液和 T7 RNA 聚合酶混合物。

然后将样品在 37 摄氏度下孵育 4 小时。接下来，使用 RNase 清洁剂从使用的手套上去除 RNase。然后，用无核酸酶的水将每个 RNA 样品的体积调节至 50 μL。

按照制造商的说明纯化 RNA。最后，在 50 μL 无核酸酶水中洗脱 RNA。首先，使用不含核酸酶的水将分光光度计空白，然后测量洗脱的 RNA 的浓度。

使用台盼蓝排除对细胞数进行计数。对于每个重复，每个重复收集 200， 000 个活细胞，然后添加磷酸盐缓冲盐水来洗涤细胞。然后以 300 倍 g 离心试管 7 分钟。

离心后，小心去除上清液。在离心过程中，将 1.5 μg Cas9 与 1 μg 单向导总 RNA 在 PCR 管中孵育 20 至 30 分钟。这是为了为每个重复制备 Cas9-sgRNA RNP 复合物。

计算出所需的重悬缓冲液 T 的体积后，溶解在重悬缓冲液 T 中获得的细胞沉淀，然后在含有 Cas9-sgRNA RNP 复合物的 PCR 管中加入 10 微升溶解的细胞悬液。接下来，打开电穿孔装置。将比色皿滑入比色皿支架。

然后加入 3 毫升缓冲液 E.在电穿孔装置上设置条件。要进行电穿孔，首先握住电穿孔移液器，然后伸出爪子并抓住移液器吸头内的圆盘，然后用力向下按压移液器以固定吸头。接下来，通过上下吹打 10 次来混合样品。

抽取 10 微升样品，确保没有气泡。接下来，将吸头直接插入电穿孔比色皿中的电解缓冲液中。然后点击 Start 开始 在屏幕上。

让完整的消息显示在屏幕上。然后从比色皿中取出移液管。接下来，将比色皿中的内容物分配到装有新 HSPC 培养基的孔中。

为了研究Cas9-sgRNA RNP电穿孔的功效，用靶向GFP或tdTomato的单向导RNase对从小鼠中分离的HSPCs进行电穿孔。这些 HSPCs 普遍表达 GFP 或 tdTomato。流式细胞术分析显示，在蛋白质水平上，HSPC 中 GFP 或 tdTomato 表达的损失约为 75% 和 74%。

然后，用来自电穿孔细胞 GFP 基因座的 PCR 扩增的 DNA 进行基于 T7 核酸内切酶 one 的测定。这是为了量化 GFP 的基因破坏效率。ImageJ 软件用于计算裂解条带强度与未裂解条带的强度之比，以计算裂解的百分比。

在 HL-60 AML 细胞系中测试了三种靶向人 CD45 的不同单向导 RNA 的效率。流式细胞术显示，与对照相比，单向导 RNA1 是最有效的一种，敲除效率为 98%。然后，使用单向导 RNA1 在原代人脐带血 CD34 阳性 HSPC 中也进行 CD45 敲除。

流式细胞术分析显示，与仅 Cas9 相比，近 80% 的细胞 CD45 缺失，CD34 表达没有改变。为了研究人CD45敲除HSPCs的植入，从CD34阳性眼眶后转染的NSG小鼠中收获骨髓和脾细胞进行分析，显示编辑细胞为HLA-ABC阳性和CD45阴性。一旦掌握，如果执行正确，该协议可以在三天内完成。

在尝试此程序时，请务必记住保持所有表面和试剂不含 RNase，使用多种技术验证有效的基因破坏，并使用适当的实验对照。看完这个视频，你应该对如何设计、合成和转染Cas9-sgRNA核糖核蛋白到造血祖细胞中，以获得快速高效的基因破坏有了很好的了解。