Name: 人类胚胎干细胞的推导Immunosurgery (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学习利用免疫外科技术从人类胚胎中分离内细胞团并培养胚胎干细胞的方法。该方案展示如何通过抗体和补体系统裂解滋养层细胞，为发育生物学和再生医学研究提供可靠的细胞系来源。

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A.E.C. 是 Jane Coffin Childs 医学研究纪念基金会和默克研究实验室的会士。我们感谢 D. Egli 和 C. Cowan 在实验设计和讨论方面提供的建议。

用于获取人类胚胎干细胞（hES细胞）的冷冻人类胚胎，是在哈佛大学人类受试者使用委员会和胚胎干细胞研究监督委员会审查并批准的研究方案下，经适当知情同意后捐赠用于科研的。
以下书面方案基于 Cowan 等人 2004 年报道的已发表参数，并进行了轻微修改。
胚胎培养
使用Quinn's Advantage解冻试剂盒解冻人类胚胎，并在添加了15% Plasmanate的Global培养基液滴中培养，直至发育至扩张囊胚阶段。
基于免疫手术法分离内细胞团
准备：
<ol>
<li>为去除透明带和进行免疫手术（见下文），在10 cm培养皿中制备各溶液液滴。用矿物油覆盖以防止蒸发。为每个拟用于建系的胚胎准备单独的一行。
<ul>
<li>EmbryoMax 酸性 Tyrode 溶液，直接使用。</li>
<li>人胚胎干细胞（hES）建系培养基：75% KO-DMEM，10% KO-血清替代物，10% Plasmanate，2.5% 经胚胎干细胞测试的胎牛血清（FBS），2 mM Glutamax-I，1% 非必需氨基酸，50 单位/mL 青霉素，50 µg/mL 链霉素，0.055 mM β-巯基乙醇，5 ng/mL bFGF。</li>
<li>兔抗人红细胞一抗，按制造商建议重悬，用hES细胞建系培养基按1:10稀释。</li>
<li>豚鼠补体血清，按制造商建议重悬，用hES细胞建系培养基按1:10稀释。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="免疫学示意图，显示细胞检测体系中的酸性Tyrode溶液、一抗和补体。" width="600" height="166" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-01"> </li>
</ul>
</li>
<li>使用前将所有培养皿在组织培养孵育箱中平衡至37°C。</li>
<li>拉制50 µL–100 µL毛细移液管（VWR），用于转移胚胎。用钻石笔切割管端，并与带有0.2 µm滤器的口吸管连接使用。</li>
</ol>
免疫手术程序：
注意事项：
<ul>
<li>在此操作中，滋养外胚层细胞通过短暂暴露于针对人类细胞的抗体并联合补体活性而被破坏。因此，该方案最适合用于滋养外胚层完整的高质量胚胎，因为只有囊胚的结构完整性才能防止内细胞团同样受到免疫反应的影响。</li>
<li>所有操作均在配备加热载物台的解剖显微镜下进行。</li>
</ul>
步骤：
<ol>
<li>使用胎牛血清（FBS）冲洗将用于胚胎移植的移液管，以防止胚胎粘附。</li>
<li>将囊胚从培养皿转移至含人胚胎干细胞（hES）的AT培养皿中的 holding 液滴中。</li>
<li>开始操作：将囊胚从hES液滴依次通过一系列AT液滴。在第三个液滴中观察透明带（zona pellucida）的溶解情况（通常为5–30秒）。注意避免过度处理，以免影响胚胎完整性。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="囊胚结构比较；内细胞团（ICM）、透明带（ZP）、滋养层（TE）；显微图像；发育生物学。" width="551" height="273" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-02"> </li>
<li>将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以洗去AT。建议预先在移液管中吸入培养基，以便立即中和AT反应。所有囊胚完成AT处理前，可暂时存放于此处。</li>
<li>将囊胚依次通过一系列一抗液滴，并在第三个液滴中于37°C组织培养箱中孵育30分钟。</li>
<li>将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以洗去未结合的一抗。</li>
<li>将囊胚依次通过一系列补体液滴，并在第三个液滴中观察滋养层细胞的裂解情况。将培养皿置于显微镜载物台上，最初30秒内观察滋养层细胞裂解时是否出现“起泡”现象。若在此期间观察到裂解，应将培养皿保留在显微镜下继续监测，直至反应完成。若前30秒内未见起泡，则放回培养箱，每隔5分钟检查一次，直至大部分滋养层细胞发生裂解（通常需5–15分钟）。需密切监测反应过程，以尽量缩短反应时间并减少对内细胞团的潜在损伤。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="免疫外科手术过程，显微图像，囊胚滋养层（TE）裂解前后对比，内细胞团（ICM）可见。" width="571" height="273" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-03"> </li>
<li>将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以清除残留的补体活性。</li>
<li>使用玻璃移液管（其直径略小于囊胚，由10µl VWR毛细管拉制而成），将囊胚反复吹打数次，以去除大部分已裂解的滋养层组织。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_4/574_Figure-04.png" alt="囊胚微操作去滋养层过程，去层前后对比，显微图像。" width="577" height="270" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-0"> </li>
<li>将分离得到的内细胞团（ICM）接种至经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。MEFs应于分离前一天制备，并在分离当天更换为人胚胎干细胞（hES）分离培养基。4孔NUNC培养皿适用于分离的初始步骤。</li>
<li>接种后最初1–2天内勿扰动培养皿。此后每日观察是否有胚胎干细胞集落向外生长（通常在1–2周内可见）。从第3天开始，每隔一天更换一半体积的培养基。</li>
</ol>
胚胎干细胞的生长与传代
当人胚胎干细胞集落生长至约0.5 mm或更大时，即可通过机械挑取进行扩增。
<ol>
<li>机械分散一半的生长物，并转移至含有新鲜饲养层的新培养板中。胚胎干细胞团块应约为30–50个细胞大小。保留另一半生长物作为首次传代（p1）的备用。随着生长物持续扩展，原始生长物（p0）可多次挑选使用。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="hES cell colony growth; low to high density; microscope images; cellular analysis." width="639" height="219" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure"> </li>
<li>次级克隆可同样分散并扩增至更大的培养皿中，直至第3-5代，此时新建立的细胞系可逐渐适应使用胰蛋白酶进行酶法传代。在最初的几代传代过程中，培养基中的血清含量也应逐步降低至1%和0%，以最大限度减少胚胎干细胞的分化。</li>
<li>所有已建立的胚胎干细胞系都应通过冻存早期传代的部分细胞，以备将来扩增使用。</li>
<li>此外，每种细胞系均应通过核型分析进行表征，并通过多能性及分化研究加以验证 体外 和 体内. </li>
</ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供的实验方案为研究人员简明扼要地概述了如何通过免疫外科手术法分离内细胞团来建立人类胚胎干细胞系。

<table><tbody><tr><td>Quinn&amp;rsquo;s Advantage Thaw Kit </td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Global 培养基</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 酸性 Tyrode 溶液</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KO-血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>经胚胎干细胞验证的定义型胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&amp;#8211;thanol </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人红细胞一抗</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠补体血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>10 µL、50 µL、100 µL 规格的毛细吸管</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带管路的口吸移液器</td><td>VWR international</td><td></td><td>与 VWR 提供的毛细吸管配套供应</td></tr><tr><td>0.2 µm Acrodisc 注射式滤器</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 Nikon Tokai Hit ThermoPlate 加热载物台的 Nikon SMZ1500 解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（E12.5）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过免疫手术法建立人类胚胎干细胞系

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并可分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步操作方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。

人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并能分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步实验方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。

人类胚胎干细胞具有自我更新并分化为体内所有细胞类型的潜能，这表明它们在……方面具有巨大前景

您好，我叫 Alice Chen。我是融化实验室的一名博士后，今天我将向您演示如何从人类胚胎中分离胚胎干细胞。我们会收到处于不同发育阶段的胚胎，并在体外进行培养，直至它们发育到合适的扩张囊胚阶段。这些示例展示了胚胎从最初的单细胞阶段发育到早期囊胚，再到扩张囊胚的过程，人类胚胎干细胞即来源于此扩张囊胚。用于分离的高质量胚胎随后将依次通过三滴ACE培养液，置于其中并观察透明带（zona pellucida）的溶解情况。神经外科过程是一种非特异性过程，其中兔抗人抗体将结合到外层细胞上。在这种情况下，指的是三联皮肤试验。当加入豚鼠血清补体后，所有带有抗体结合的细胞都将被裂解。首先，我们需要准备三个培养皿。第一块板用于ACE酪氨酸，我们用它来去除zita。第二和第三块板用于免疫外科手术。我将首先制备用于放置酸性酪氨酸滴液和人胚胎干细胞分离的板。培养基滴加。在培养皿左侧准备三滴酸性酪蛋白（acid tyros），在培养皿右侧准备三滴人胚胎干细胞培养基。第二个培养皿包含一抗，即兔抗人红细胞抗体（rabbit anti-human RBC）。同样，将培养板的左侧用于一抗，每个胚胎三滴；培养板的右侧用于人胚胎干细胞（ES）培养。对于补体板，同样每个胚胎三滴培养基。再次，在培养板左侧放置三滴补体，然后在培养板右侧放置三滴人胚胎干细胞培养基。同样，每一行用于放置一个胚胎。所有三块培养板均覆盖矿物油以防止蒸发，并放入培养箱中进行平衡。这是一个位于洁净工作台内的解剖显微镜，工作台内具有层流气流，类似于组织培养所用的环境，我们大部分的人类胚胎操作都在此处进行。在开始处理胚胎之前，首先需要准备好口吸管。这是标准的口吸管胶管，不同之处在于我们在你的口腔与移液端之间插入了一个0.2微米的滤膜，以确保无菌操作。让我演示一下如何拉制刻度吸管。我喜欢拉制多种不同规格的吸管。这些都可以从VWR购买得到，我通常会拉制10微升、50微升和100微升直径的吸管。现在使用钻石针切割固定管。在第一步中，应选择直径较大的钻石针，因为你需要处理整个胚胎。经筛选的高质量胚胎将依次移入三滴液滴中进行后续操作。将载玻片依次从第一滴溶液转移到第二滴，再转移到第三滴，在第三滴中静置并观察扎普帕丽塔（zap palita）的溶解过程。该过程通常少于30秒，可直接观察到扎普帕丽塔逐渐溶解。当扎普帕丽塔完全溶解后。将胚胎依次穿过人ES培养基的三个洗涤液滴，依次经过第一、第二和第三个洗涤液滴。随后将胚胎转入一抗液滴中，同样依次从第一滴转移至第二滴，再至第三滴，并在组织培养孵育箱中孵育半小时。当观察到胚胎外层细胞出现气泡时，三联滋养层细胞的裂解现象变得明显。这标志着三联滋养层细胞裂解的开始。当整个胚胎外缘均出现明显裂解时，即可将胚胎移入三滴人源培养基中进行洗涤。免疫手术后，使用口径更小的吹打吸管对胚胎进行机械吹打。该吹打吸管的直径应小于第一根吸管，以便更高效地去除已裂解的滋养层细胞。皮肤细胞。机械作用结束后，你会在中心位置留下一群细胞。其中包含一个完整的内细胞团。其周围存在大量三联真皮细胞，以及一些完整的三联真皮细胞。随后将该内细胞团分离物置于已铺有小鼠胚胎饲养层细胞的孔中。饲养层细胞板于前一晚制备，今晨我将培养基从小鼠胚胎成纤维细胞培养基更换为人类胚胎干细胞衍生培养基。随后将内细胞团分离物从补体后的洗涤液滴转移至含有饲养层细胞的孔中。将此培养皿放回培养箱，并静置数天，以允许内细胞团分离物贴壁。这是内细胞团分离物向外生长发育的一个示例。当生长物足够大时，我们就可以通过将其一分为二来进行首次传代。现在距离最初的分离培养已有14天，此处是我们某次分离培养中获得的一个生长物的示例。这是一个此类外延生长物的示例，今天我将取其中一半用于传代。该外延生长物将被切成两半，然后进一步分割成小方块，每一块都将转移至含有饲养层细胞的新孔中。保留一半外延生长物不进行处理是十分必要的，这样可以持续获得细胞来源，以便扩增细胞，并为所进行的任何传代操作保留备份。在前两到三代培养中，以机械法传代是较为理想的做法，最终可使细胞适应酶解法解离，从而实现更高效的传代。我们实验室持续建立人类胚胎干细胞系，用于研究发育与分化机制。这些细胞系还被分发给全球的干细胞研究人员。我认为影响建系成功的主要因素有四个。第一个因素与胚胎质量有关，而胚胎质量又取决于遗传背景、胚胎冻融过程的质量，以及囊胚阶段之前体外培养的质量。第二个因素可能是分离后内细胞团的质量完整性，这取决于用于分离内细胞团的技术，也可能与操作者的经验和技术水平有关。第三个因素是分离得到的内细胞团在饲养层上的贴附效果，第四个因素是该内细胞团的生长扩散情况。我认为这在技术上并不是一个困难的过程。只需要一些练习即可。事实上，每一步都相当简单，因此只要能够遵循实验方案，经过少量练习，我认为任何人都可以完成。我们在实验室中发现，每种细胞系都略有不同，其原因我们尚不完全清楚。例如，如果你要测试10个细胞系的分化潜能，其中可能有两到三个细胞系更倾向于分化为你感兴趣的细胞类型。我推测这些差异与细胞所处的发育阶段有关，即胚胎干细胞系来源于胚胎的哪个阶段，同时也与这些细胞的人工操作过程相关。我认为，细胞系的特性有时会发生变化，其异质性及分化潜能是每一位干细胞研究人员都需要牢记的重要因素。同样，我并不清楚造成这一现象的具体原因，但就我的研究而言，这可以作为一个实例：我们的最终目标是制造出胰腺中能够产生胰岛素的β细胞。要实现这类细胞系的第一步，是从胚胎干细胞生成内胚层细胞。在对10到20个细胞系进行比较时，我们发现其中一两个细胞系能够高效地生成内胚层，大约一半的细胞系生成内胚层的效率较低，而还有一些则几乎无法有效生成内胚层。因此，通过这一初步筛选过程，我们选择那些更倾向于形成目标细胞类型的细胞，并利用这些细胞继续后续的分化研究。1998年，Thompson 等人首次报道了人类胚胎干细胞的分离；2004年，我们的实验室报道了17株新的人类胚胎干细胞系的建立。通过改进已发表的实验方案，这些改进主要是为了使分离过程更加高效，包括培养基成分的调整、细胞传代方式以及冻存与复苏方法的优化。从那时起，在每一次细胞系建立过程中，我们都在探索改进实验方案和建立效率的新方法。例如，我们实验室正在尝试替代方法来分离内细胞团，不再使用兔抗体或豚鼠血清补体等异源试剂，而是通过更机械的方式解剖分离内细胞团。希望这些方法能够至少达到与现有方法相当、甚至更优的内细胞团分离效果。

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人类胚胎干细胞的推导Immunosurgery

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