Name: CRISPR 的染色质环结构重组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习使用CRISPR-dCas9 CLOuD9系统进行染色质环结构重组，实现基因表达的可逆调控。该方法利用无毒二聚化试剂和正交dCas9物种，可精确控制染色体构象变化，为研究染色质动态与转录调控机制提供有力工具。

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感谢 H. Chang、T. Oro、S. Tavazoie、R. Flynn、P. Batista、E. Calo 以及整个 Wang 实验室在技术方面提供的支持以及对本文稿的审阅。S.L.M. 的研究工作得到了美国国家科学基金会研究生奖学金（NSFGRF，编号 DGE-114747）、美国国防部国家防御科学与工程研究生奖学金（NDSEGF，编号 FA9550-11-C-0028）以及美国国家癌症研究所（编号 1F99CA222541-01）的支持。K.C.W. 获得了伯勒斯·威康基金医学科学家职业奖的资助，同时也是 Donald E. 和 Delia B. Baxter 基金会的教职学者。

1. gRNA 设计
<ol>
	<li>选择一个标准的gRNA设计工具来设计向导RNA10使用先前开发的 CLOuD9 载体的互补配对9 （即至少 1 S. aureus （CSA）和1 S. pyogenes （CSP）构建体）用于每次实验。
	<ol>
		<li>在选定的在线设计工具中，使用原间隔序列邻近基序（PAM）序列 &#34;NGG&#34; 引导序列长度为20 bp，针对CSP及PAM序列 &#34;NNGRRT&#34; 引导序列长度为21，适用于CSA。</li>
		<li>根据特异性评分选择向导，并在两条链上设计向导，以最大化获得有效向导的可能性。</li>
		<li>每个向导从寡核苷酸制造商处订购两条寡核苷酸：对于正向寡核苷酸，添加 &#34;caccg&#34; 在向导序列的5'端添加，对于反向寡核苷酸，添加 &#34;aaac&#34; 到5'端 &#34;c&#34; 在订购前添加到3'端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>首先，针对每个目标区域设计3-5个gRNA，分布于250-1000 bp的范围内。gRNA靶向效率的评估方法如下：
	<ol>
		<li>将鉴定出的gRNA克隆至具有活性的Cas9质粒中（见步骤3），并瞬时转染至293T细胞（见步骤4）11.</li>
		<li>在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞2–3天，随后收集细胞并提取基因组DNA12.</li>
		<li>通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标区域。将产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并纯化相应条带。</li>
		<li>按照 Guschin 所述的方法进行 T7 核酸内切酶实验， 等. 实验方案13,14. 
		注意：高效向导序列是指被确定能够在靶位点切割DNA的向导序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>保持细胞处于健康且活跃分裂的状态。
	<ol>
		<li>K562细胞培养于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。
		<ol>
			<li>在25 cm²培养瓶中培养K562细胞2 倾斜颈烧瓶用于&#160;每天维持细胞并调整细胞密度至400,000个细胞/mL。</li>
			<li>在K562细胞转导CLOuD9载体后，向维持培养基中添加2 µg/mL嘌呤霉素和100 µg/mL潮霉素。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于293T细胞，使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）进行培养。
		<ol>
			<li>在10 cm培养皿中培养293T细胞2&#160;培养皿中的细胞在汇合时进行传代和分瓶。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 质粒制备与gRNA插入15
注意：质粒图谱见附录，示例实验中使用的引物见补充表1。
<ol>
	<li>将5 µg慢病毒CRISPR质粒与3 µL BsmBI、3 µL碱性磷酸酶、6 µL 10x缓冲液以及0.6 µL新鲜配制的100 mM DTT混合。用ddH2O补至总体积60 µL，37 °C孵育30分钟，以完成质粒的消化和去磷酸化。</li>
	<li>对消化后的质粒进行凝胶纯化，并用ddH2O洗脱。</li>
	<li>取每条成对向导RNA（100 µM）各1 µL，加入1 µL 10x T4连接酶缓冲液、6.5 µL ddH2O和0.5 µL T4多核苷酸激酶（T4 PNK），总体积为10 µL。37 °C孵育30分钟，然后95 °C孵育5分钟，再以5 °C/min的速率降温至25 °C。 
	注意：此步骤可使成对向导RNA退火配对。</li>
	<li>将步骤3.3中退火后的向导RNA用ddH2O稀释1:200。</li>
	<li>取步骤3.2中消化后的质粒1 µL，加入步骤3.4中稀释后的连接产物0.5 µL、2.5 µL 2x缓冲液、1 µL ddH2O和0.5 µL连接酶，总体积为5.5 µL。室温孵育10分钟，使向导RNA连接至经BsmBI消化的质粒上。</li>
	<li>将步骤3.5中连接完成的新质粒转化至Stbl3细菌中，并采用任意质粒制备方法进行扩增。</li>
</ol>
4. 慢病毒生产
<ol>
	<li>使用血细胞计数板，按照每孔750,000个的数量将293T细胞接种于六孔板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。每个质粒构建体使用一个孔。</li>
	<li>接种后24小时，更换为新鲜的不含抗生素的DMEM培养基，其中含10% FBS。</li>
	<li>在一个离心管中，每反应体系加入11 µL脂质体转染试剂，并用150 µL OptiMEM培养基稀释11。</li>
	<li>在另一个离心管中，每反应体系加入步骤3.6中获得的2 µg CLOuD9慢病毒载体质粒、0.35 µg pMDLg/pRRE、1 µg pRSV-Rev和0.65 µg pMD2.G，并用150 µL OptiMEM培养基稀释11。</li>
	<li>对于每个反应体系，将稀释后的慢病毒质粒混合物以1:1的比例加入到稀释后的脂质体转染试剂中，混匀后室温孵育5分钟11。</li>
	<li>将步骤4.5中形成的每种混合复合物全部加入步骤4.2中对应的不含抗生素的293T细胞孔中。</li>
	<li>48小时后，用移液器收集病毒上清液至新的离心管中，于300 × g离心5分钟。离心后，将上清液转移至新的离心管中，以去除残留的细胞碎片。</li>
	<li>立即使用病毒上清液对靶细胞进行转导，或将其在-80 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>
5. 细胞的慢病毒转导
<ol>
	<li>将每种感兴趣的病毒构建体（包含互补的 CLOuD9 质粒）各 250 µL 加入含有 80,000 个细胞的 15 mL 圆锥管中，用于 CLOuD9 实验。</li>
	<li>用不含抗生素的培养基将每个圆锥管中的培养基总体积补至 1 mL，并加入聚凝素（polybrene），使其终浓度为 1–8 µg/mL（所用细胞类型可耐受的 polybrene 最大浓度需通过实验确定）。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，然后通过移液重悬细胞，不移除病毒上清液。将全部细胞悬液转移至细胞培养板中。</li>
	<li>转导后 24 小时，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除病毒上清液，并将细胞重悬于常规细胞培养基中。</li>
	<li>次日，在细胞培养基中加入嘌呤霉素（293T 细胞使用浓度为 1 µg/mL）和潮霉素（293T 细胞使用浓度为 25 µg/mL），以筛选双转导细胞。在开始实验前，需通过实验确定特定细胞类型适用的嘌呤霉素和潮霉素浓度。</li>
	<li>在进行任何后续实验前，至少维持细胞在筛选培养基中培养 3 天，并在整个实验过程中持续使用筛选培养基。</li>
</ol>
6. 细胞二聚化与洗脱
<ol>
	<li>向细胞培养物中加入 1 mM 脱落酸（Abscisic Acid, ABA）或等体积的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）作为对照，以诱导经筛选并转导的 CLOuD9 细胞发生二聚化。ABA 须在收到后 6 个月内使用，保存时需低温避光。如有需要，可使用 2 mM ABA。
	<ol>
		<li>实验期间每天更换培养基，以提供新鲜的 ABA（或对照组的 DMSO）。 
		注意：目前尚未观察到二聚化持续时间的上限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过移除含 ABA 的培养基，并用足量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤细胞两次（每次覆盖培养板表面），以逆转二聚化。随后将细胞培养于不含 ABA 的培养基中，以维持其非二聚化状态。</li>
</ol>
7. 免疫沉淀与共免疫沉淀
注意：所有缓冲液均需新鲜配制，并在使用前立即准备。
<ol>
	<li>二聚化实验完成后，收集细胞并离心，然后吸除上清液。</li>
	<li>交联并冻存细胞
	<ol>
		<li>使用新鲜材料在室温下配制1%多聚甲醛的PBS溶液。每200万细胞，加入1 mL室温的1%多聚甲醛溶液，轻轻重悬细胞，在旋转仪上室温孵育恰好10分钟。 
		注意：交联少于1000万细胞时，使用体积不少于10 mL的溶液。</li>
		<li>加入甘氨酸至终浓度为0.125 M以终止交联反应，室温下旋转孵育5分钟。</li>
		<li>离心收集细胞，并用预冷的PBS洗涤1-2次。细胞沉淀可立即使用，或在液氮中速冻后于-80 °C保存。 
		注意：加热会逆转甲醛交联。若时间紧迫，细胞可直接储存于 -80 °C，无需速冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备抗体/磁珠偶联物 
	注意：优化所选抗体的实验条件（例如，测试不同的细胞裂解缓冲液并进行免疫沉淀）可能是必要的。两种常用的缓冲液，Farnham 裂解缓冲液和改良 RIPA 缓冲液，可能对免疫沉淀效率和超声处理效率产生显著影响。所有缓冲液的组成均可在下文中找到 材料表此外，请注意染色质超声处理可能需要数小时才能完成。
	<ol>
		<li>根据所选抗体的要求，通过短暂涡旋振荡重悬磁珠。</li>
		<li>将适量的磁珠转移至1.5 mL离心管中。作为起始参考，每1 µg抗体使用20 µL磁珠。此时暂不加入抗体。 
		注意：以每毫克总裂解液使用10 µg抗体和200 µL磁珠作为起始条件，除非已知该抗体的效率显著高于或低于此水平。对于低丰度蛋白，可能需要调整此比例。</li>
		<li>若使用Farnham裂解缓冲液，则用免疫沉淀稀释缓冲液洗涤3次；若使用RIPA裂解缓冲液，则用RIPA裂解缓冲液洗涤3次。</li>
		<li>将珠子重悬于步骤 7.3.3 中使用的相同缓冲液（IP 稀释缓冲液或 RIPA 缓冲液）中，最终体积为 &#62;1x 和 &#60;5倍初始体积。 即 对于100 µL的初始珠子体积，最终重悬体积应使用100至500 µL。</li>
		<li>将抗体以适当浓度加入已洗涤的磁珠中。对于用于免疫沉淀CLOuD9构建体的良好HA或Flag抗体，建议抗体用量为1:50（µg 抗体: µg 蛋白裂解液），在4 °C下旋转孵育8小时以上或过夜；也可在室温下孵育2–4小时。</li>
		<li>去除珠子上的上清液并弃去。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。</li>
		<li>用用于抗体过夜孵育的缓冲液（IP稀释缓冲液或RIPA缓冲液）以最小体积重悬，保持低温直至与蛋白裂解液混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声处理染色质
	<ol>
		<li>首先在冰上向细胞沉淀中加入膨胀缓冲液，裂解细胞，孵育10分钟，每隔几分钟轻弹管壁以防止细胞沉淀。 
		注意：通常将500 µL膨胀缓冲液加入2500万细胞中，并依此比例放大，但所用缓冲液体积不得少于500 µL &#60;2500万个细胞</li>
		<li>手动使用Dounce匀浆器顺时针和逆时针方向各研磨13次。</li>
		<li>然后在4 °C、1,500 x g条件下离心5分钟，使细胞核沉淀。彻底吸除上清液，并重复一次以去除残留上清液，随后称量细胞沉淀的重量（单位为mg）。</li>
		<li>向核裂解缓冲液（上述的 Farnham 缓冲液或 RIPA 缓冲液，选择其中一种）中加入蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>向沉淀的细胞核中加入10倍体积的细胞核裂解缓冲液以重悬（例如，向100 mg沉淀中加入1 mL细胞核裂解缓冲液）。短暂涡旋混匀，冰上裂解10分钟。 
		注意：请考虑超声处理管的尺寸。理想体积通常为 &#60;1 mL，因此如果沉淀物过大，可能需要将样品分装。
		<ol>
			<li>进行共免疫沉淀（Co-IP）时，短暂超声处理细胞核以溶解物质，并通过加入2-3倍体积的稀释缓冲液将SDS淬灭至可进行免疫沉淀的水平，然后进入步骤7.4.6。对于非常敏感的抗体，可添加更多稀释缓冲液以进一步降低SDS浓度。 
			注意：当裂解液变澄清时即停止超声处理；裂解液将从不透明或半透明的白色变为完全透明。保持样品尽可能低温，避免过度超声。</li>
			<li>对于染色质免疫沉淀（ChIP），需充分超声处理DNA，以获得150-1000 bp的DNA片段，随后进行步骤7.4.6。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在4 °C下以最大速度离心10分钟，沉淀不溶物。</li>
		<li>将可溶性物质转移至新离心管中。</li>
		<li>进行免疫共沉淀（Co-IP）时，测定蛋白质浓度，并继续执行第7.5步的下拉操作。</li>
		<li>进行染色质免疫沉淀（ChIP）时，取10 µL澄清裂解液，加入40 µL免疫沉淀洗脱缓冲液和6 µL 5 M NaCl，总体积为56 µL。在95 °C下煮沸15分钟，加入5–10 µL 3 M NaOAc（pH 5），然后使用PCR纯化柱进行纯化。通过测量260 nm处的吸光度测定DNA浓度，并对各样品进行标准化。随后进入步骤7.5进行下拉实验。 
		注意：多余的裂解液可快速冷冻于 -80 °C 保存以备后续使用，但新鲜裂解液效果最佳。若需冷冻，避免反复冻融，裂解液冻融次数不应超过一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下拉
	<ol>
		<li>将适量的蛋白裂解液转移至新的离心管中。如果使用Farnham裂解缓冲液，则用2.1倍体积的免疫沉淀稀释缓冲液（见上文）进行稀释。</li>
		<li>留出100 µL上清液作为输入对照，4 °C保存至次日。</li>
		<li>将第7.3.8步中的磁珠/抗体偶联物加入样本中。</li>
		<li>在4 °C下旋转孵育样品过夜，并确保1.5 mL离心管中有足够的液体体积以利于转动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤与洗脱
	<ol>
		<li>过夜旋转孵育后，保留上清液作为非结合组分。随后用免疫沉淀稀释缓冲液洗涤磁珠3至5次。</li>
		<li>在室温下配制不含抑制剂的免疫沉淀洗脱缓冲液。</li>
		<li>用50 µL洗脱缓冲液在67 °C下涡旋振荡15 min以洗脱复合物。将洗脱液转移至新离心管中，并用另外50 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并两次洗脱液，共得100 µL洗脱液。 
		注意：如果此洗脱步骤中背景过高，可在振荡/孵育过程中降低或省略加热步骤。这通常会减少目标蛋白的得率，但可显著降低背景。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>67 °C 下加热以逆转交联 &#62;4 小时 
	注意：这对于共免疫沉淀（Co-IP）并非严格必需，但可能有所帮助。
	<ol>
		<li>对于共免疫沉淀实验，为确保目标蛋白之间完全形成二聚体，将洗脱液在SDS-PAGE凝胶上电泳，并按指示以1:1,000稀释度使用抗HA标签或抗Flag标签抗体进行检测。随后继续进行第8步。</li>
		<li>对于ChIP-qPCR，为确保每个CRISPR-dCas9组分的正确定位和靶向，使用柱纯化法对洗脱产物进行纯化，并用10 µL洗脱液洗脱。对纯化后的DNA进行实时定量聚合酶链式反应（qPCR）。本文数据所用引物列于 补充表1然后继续执行步骤8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA 提取与定量 PCR
<ol>
	<li>为研究 CLOuD9 诱导的基因表达变化，首先从对照细胞沉淀和二聚化细胞沉淀中分离并纯化总 RNA。</li>
	<li>通过逆转录17将纯化的 RNA 反转录为互补 DNA（cDNA），并进行 qPCR 分析。引物信息见补充表 1。</li>
</ol>
9. 染色体构象捕获实验
<ol>
	<li>为了观察由 CLOuD9 诱导的基因组位点接触频率的变化，进行染色体构象捕获（3C）实验8。</li>
	<li>通过定量实时 PCR，对三个生物学重复样本中的两组重复样本分别定量 3C 连接产物。将样品的 3C 信号以微管蛋白基因座的信号作为参照进行归一化处理。引物信息见补充表 1。</li>
</ol>

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CLOuD9染色质成环实验中最关键的步骤包括：1）设计或使用正确的gRNA，2）每天更换CLOuD9转导细胞的培养基，其中需含有ABA或DMSO，3）保持ABA的新鲜度，以及4）对染色质构象进行准确且细致的评估。
CLOuD9 技术的主要局限性在于设计针对目标区域的向导序列的能力。向导 RNA 负责将 dCas9 组分定位至待二聚化的靶 DNA 区域，其效率取决于特定的靶位点。若缺乏适当的 gRNA 组分，CLOuD9 系统将无法形成可逆诱导的染色质环。因此，针对每个感兴趣区域设计多个向导，并将这些向导分布在 250–1000 bp 的范围内，可确保至少有一个向导有效。向导的位置对于获得准确结果也至关重要。应避免将向导设计在转录因子结合位点或其他关键功能区域，以防止产生转录上调或下调等背景效应。此外，CLOuD9 构建体的精确插入位置可能轻微影响靶基因的转录水平。这进一步强调了针对每个靶区域需测试多对向导的重要性，以筛选出实验中最有效的向导组合。此外，在每一对靶区域中，CSA 构建体应使用针对 S. aureus 的 gRNA 进行靶向，而 CSP 构建体应使用针对 S. pyogenes 的 gRNA 进行靶向，以确保靶向特异性。
为了确保结果准确并实现正确的二聚化，转导CLOuD9构建体后维持细胞环境的新鲜性也至关重要。每天更换培养基并添加新鲜的二聚化诱导剂（或对照）可确保互补的构建体保持邻近状态，从而维持染色质构象的改变。此外，必须确保ABA试剂新鲜，并按照生产商的说明妥善保存（开封不超过6个月、低温保存、避光），这是获得真实可靠结果的关键。
值得注意的是，CLOuD9所使用的ABA二聚化诱导剂是与ABI和PYL二聚化蛋白联用，而非更常用的FRB和FKBP系统。由于雷帕霉素类似物（rapalog）对癌细胞具有毒性，若采用FRB/FKBP系统将限制CLOuD9的应用。而替代性的ABI/PYL系统克服了这一限制，从而有效提高了CLOuD9的广泛适用性。
综上所述，我们开发了CLOuD9技术，这是一种独特且稳健的方法，能够强制但可逆地在基因组长距离靶位点之间建立联系。通过诱导染色质成环，我们还证明CLOuD9可在适当的细胞环境中用于调控基因表达。该技术具有良好的适应性，可不受限制地研究任意两个基因组位点之间的相互作用，而无需预先了解成环区域或成环机制。此外，CLOuD9所展现出的独特可逆性，使其能够进一步探究疾病与发育过程中的染色质成环机制。尽管染色质成环的靶向效应已得到明确证实，但目前尚无数据揭示脱靶成环的影响及其对靶向成环的后续作用。
我们的数据仅展示了该工具的少数应用，但揭示了一个核心理念：染色质的排列方式能够反映基因表达状态。我们的技术可用于研究并揭示染色质结构在基因调控中的细微特征，从而加深对染色质折叠在基因转录过程中所起作用的整体理解。对转录动态复杂性的更深入认识，将有助于推动癌症、遗传性疾病和先天性疾病的科研与治疗，因为在这些疾病中，染色质组装的显著改变无疑会影响基因表达20,21,22,23。未来利用CLOuD9技术的进一步研究，将阐明染色质结构域的组织方式与动态变化，以及这些因素如何驱动染色质折叠，以在发育和疾病过程中维持稳定的基因表达。

近年来，细胞核内染色质折叠与基因组特定空间组织之间的关系引起了广泛关注，因为已发现其与基因表达密切相关1,2。尽管基因活性与染色质结构调控之间的精确关系尚不明确，但已有假说认为，染色体接触位点之间因动态三维染色质结构而产生的相互作用具有基因调控功能3。事实上，人类珠蛋白基因位点的研究已充分证实了这一效应：位点控制区（LCR）通过与珠蛋白基因区域形成染色质环，以发育阶段特异性的方式调控珠蛋白基因的活性4。然而，无论是在该位点还是其他区域，目前仍不清楚染色质成环是基因表达改变的原因还是结果。
迄今为止，研究这一现象所面临的挑战仍未得到解决。例如，其他诱导染色质环的尝试均涉及对线性DNA序列的修饰，或需要大量有关促进成环特定元件的背景知识的复杂操作流程5,6,7,8。此外，尽管先前的研究表明染色质环在特定且有限的背景下可驱动基因表达7,8，但染色质成环在全基因组范围内影响转录的程度仍不明确。尽管近年来人们对长距离成环对基因表达影响的兴趣持续增长，但关于如何建立并维持染色质接触以改变基因活性的问题仍未得到解答。
我们所研发的技术利用了核酸酶缺陷型的规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（dCas9），从而实现对任意基因组位点的广泛适用性靶向9。该技术避免了对线性DNA序列进行修饰所带来的一系列复杂问题，且无需对特定的成环元件具备深入的前期知识即可使用。尤为突出的是，该工具具有普适性，可广泛应用于发育过程以及多种疾病（如癌症）中所识别的染色质环结构。CLOuD9的强大之处在于能够可逆地改变染色质环的结构，从而有效调控基因表达。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&amp;nbsp; 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>用于 K562 细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X，用于 293T 细胞培养</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene 质粒</td><td>#52961</td><td>用于 CLOuD9 质粒构建</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene 质粒</td><td>#12253</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene 质粒</td><td>#12259</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene 质粒</td><td>#12251</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>抗 HA 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>抗 Flag 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>DNeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>RNeasy 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>用于 cDNA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>用于 qPCR 分析</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>用于 qPCR 分析</td></tr><tr><td>抗 H3K4me3 抗体</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>用于 ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>抗 RNA Pol-II 抗体</td><td>Active Motif</td><td>61083</td><td>用于 ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>用于蛋白质提取</td></tr><tr><td>4-12% Tris 甘氨酸凝胶</td><td>Biorad</td><td></td><td>任意规格，用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>抗兔 HRP 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>抗鼠 HRP 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据</td><td>Encode</td><td>ENCSR000AKU</td><td>用于 ChIP-seq 分析</td></tr><tr><td>K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据</td><td>Encode</td><td>ENCSR000APE</td><td>用于 ChIP-seq 分析</td></tr><tr><td>K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据</td><td>Encode</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>用于 ChIP-seq 分析</td></tr><tr><td>K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>用于 ChIP-seq 分析</td></tr><tr><td>用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>用于 RNA 纯化</td></tr><tr><td>Pierce 16% 无甲醇甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>用于交联</td></tr><tr><td>PX458 质粒</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>推荐用于 gRNA 克隆的活性 Cas9 质粒，但任何具有活性的 Cas9 质粒均可使用</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于 PCR 产物纯化</td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>10X FastDigest 缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>10X T4 连接酶缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>用于克隆向导 RNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham 裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 1% Tris-Cl pH 8.0、1% SDS、1% 蛋白酶抑制剂水溶液（不含 EDTA）和 1 mM EDTA 的水溶液</td></tr><tr><td>改良 RIPA 缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 1% NP40/Igepal、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、1 mM EDTA 和 1% 蛋白酶抑制剂水溶液（不含 EDTA）的 PBS 缓冲液（pH 7.8 或 7.4）</td></tr><tr><td>免疫沉淀稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 0.01% SDS、1.1% Triton-X 100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris-HCl pH 8.0、167 mM NaCl 和 0.1x 蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 100 mM Tris pH 9、100 mM LiCl、1% NP-40 和 1% 脱氧胆酸钠</td></tr><tr><td>膨胀缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 0.1 M Tris pH 7.5、10 mM 醋酸钾、15 mM 醋酸镁和 1% NP-40</td></tr><tr><td>稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 0.01% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris pH 8 和 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>免疫沉淀洗脱缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 1% SDS 和 10% NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr介导的染色质环结构重排

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

近期研究表明，远距离的三维染色质环化相互作用在基因表达调控中发挥着重要作用，但目前尚不清楚染色质环化是基因表达改变的原因还是结果。直到最近，染色质环化如何影响基因活性和细胞功能的机制仍相对模糊，而现有技术在操控这些结构方面的局限性也阻碍了对这类相互作用的深入探究。为解决这一不确定性，我们开发了一种利用CRISPR-dCas9实现选择性且可逆的染色质环重排方法（CLOuD9）。CLOuD9系统的动态性已通过成功将CLOuD9构建体定位至目标基因组位点并调控局部染色质构象得到验证。尤为重要的是，该系统能够逆转诱导形成的染色质接触，并恢复内源性染色质构象的能力也已得到证实。利用该方法调控基因表达，不仅证明了其调控细胞基因表达的能力，也凸显了该技术在癌症和发育背景下创建稳定de novo染色质环并显著影响基因表达方面的巨大应用潜力。

染色质成环在基因调控中起着重要作用；然而，目前尚无技术能够实现对染色质环的选择性且可逆的修饰。本文介绍了一种利用CRISPR-dCas9进行染色质环重排的强大系统（CLOuD9），该系统已被证明可选择性且可逆地调控靶向位点的基因表达。

CRISPR介导的染色质环结构重排

近期研究表明，远距离的三维染色质环化相互作用在基因调控中发挥着重要作用……

该方法可帮助我们解答与基因表达相关的关键问题，明确揭示染色质结构如何影响基因表达，以及染色质组织如何调控转录动态。我们开发此项技术的目的是能够可控地改变染色体结构，从而实现长距离染色质成环的构建，同时又能逆转染色质环境，以恢复内源性染色体结构。本方法设计简便易用，具有广泛的适用性。我们利用了一种无毒的二聚化诱导剂以及正交的dcas9物种，以使该系统能够更广泛地应用。我们开发此方法的目的是为了解决长期存在的“先有鸡还是先有蛋”的问题，即基因表达是否导致染色体结构的形成，还是染色体结构的变化引发了基因表达的改变。CRISPR-向导RNA序列的设计和细胞培养的维护详见文本方案。质粒图谱和所用引物亦在其中列出。开始质粒制备时，将5微克慢病毒CRISPR质粒与3微升BsmB1、3微升碱性磷酸酶、6微升10×消化缓冲液以及0.6微升新配制的100毫摩尔DTT混合。用双蒸水将总体积补至60微升，37摄氏度孵育30分钟，以消化并去磷酸化质粒。随后，通过凝胶纯化环性质粒和双蒸水中的消化后质粒。接下来，为向导RNA配对制备退火反应。将1微升100微摩尔的每种向导RNA与1微升10倍T4连接酶缓冲液、6.5微升双蒸水和0.5微升T4多核苷酸激酶混合，总体积为10微升。为使向导RNA与其靶序列退火，先将混合物在37摄氏度孵育30分钟，随后在95摄氏度孵育5分钟，再以每分钟降低5摄氏度的速率逐步降温至25摄氏度。接着，将退火后的向导RNA用双蒸水稀释100至200倍。现在，准备两个连接反应。将1 µL经消化的质粒与0.5 µL稀释的perivaneal guide RNAse、2.5 µL 2×连接缓冲液、1 µL双蒸水和0.5 µL连接酶混合。在室温下孵育反应体系10分钟，以连接向导序列与经BsmB1消化的质粒。然后将新连接的质粒转化至稳定的三种细菌中，并使用任意质粒制备方法扩增细菌。在六孔板中，每孔接种750,000个2n3 T细胞，使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。每个质粒构建体使用一孔，将细胞培养24小时。第二天，将培养基更换为新鲜的不含抗生素的DMEM培养基（含10% FBS）。更换每孔细胞培养基后，立即为每孔细胞准备一管慢病毒生产混合液。每次反应需将11 µL脂质体转染试剂溶于150 µL Opti-MEM培养基中。然后在不同的离心管中准备DNA。将两微克CLOud9慢病毒载体质粒与两微克其他慢病毒包装组分混合。用150微升Opti-MEM培养基稀释该混合物。然后将稀释的慢病毒质粒混合物与等体积的稀释脂质体转染试剂混合，在室温下孵育5分钟。随后，将一管制备好的混合物加入细胞的每个孔中，继续孵育。48小时后，将培养板各孔中的病毒生产培养基转移至锥形离心管中，以300 ×g离心5分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，以弃去沉淀的碎片。立即使用病毒生产培养基转导靶细胞，或将其在 -80 摄氏度下冷冻保存以备后续使用。首先，向含有 80,000 个细胞的 50 毫升锥形管中加入 250 微升每种目标病毒载体，本实验中为互补的 CLOud9 质粒。然后加入足量的Polybrene，使其在溶液中的终浓度为每毫升1至8微克。接着用不含抗生素的培养基将每管的总体积调整至1毫升。现在，为了增加病毒颗粒与细胞之间的接触，将细胞在室温下以800 × g离心30分钟。然后用移液器吹打重悬上清液中的细胞。接着，将细胞悬液接种至培养板中，孵育24小时。次日，收集细胞。在室温下以 300 g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于普通培养基中。次日，在培养基中加入嘌呤霉素和潮霉素，以筛选双转导细胞。每种细胞类型的抗生素最佳浓度应预先确定。随后，将细胞在筛选培养基中孵育至少三天，然后进行后续应用，并持续培养细胞并维持使用筛选培养基。为了使经CLOud9筛选并转导的细胞发生二聚化，向培养皿中加入一毫摩尔的ABA。对照组加入DMSO，然后在实验期间持续用ABA或DMSO维持细胞培养。为逆转二聚化，用足量的 PBS 洗涤细胞，每次洗涤需覆盖培养板表面，共洗涤两次。随后，将细胞培养在不含 ABA 的培养基中，以维持其非二聚化状态。合理使用 CLOud9 系统可通过向细胞培养基中添加或去除 ABA，诱导互补的 CSA 和 CSP CLOud9 构建体之间发生可逆接触。使用标准的CRISPR向导RNA酶将CSA和CSP构建体定位至适当的基因组区域。通过染色质免疫沉淀结合定量PCR，验证了CLOud9各组分在靶向定位中的准确位置。此外，无论在有无ABA条件下进行的共免疫沉淀实验均证实，CSA与CSP在配体存在时可发生二聚化，而在配体缺失时该过程具有可逆性。在ABA二聚化后，通过染色体构象捕获技术检测到β-珠蛋白与LCR之间的接触增加。然而，在仅含有CSA或仅含有CSP构建体的对照组中未观察到此现象。形成LCR与β-珠蛋白的相互作用并未完全消除内源性LCR与珠蛋白之间的接触。这仅增加了原始接触。无论靶向的 LCR 内具体区域或 β-珠蛋白启动子区域如何，在二聚化过程持续 72 小时期间均观察到 β-珠蛋白 LCR 接触的增加。最后，通过在去除 ABA 后进行染色体构象捕获实验，验证了该系统的可逆性。这导致了内源性确认的完全更新。在尝试此操作时，重要的是要记住每天更换培养基并添加新鲜的二聚化CLOud9转导细胞。切勿忘记，使用慢病毒可能具有极高危险性，在进行此操作时应始终采取生物安全二级（BSL 2）级别的所有预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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CRISPR介导的染色质环结构重排

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