Name: 慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析: 从患者材料到序列解释 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析方法，通过PCR扩增和IMGT/V-QUEST工具进行功能评估。该技术简单快速且高度准确，有助于实现患者的精准预后评估和治疗决策。

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我们感谢本研究团队以及IgCLL小组和ERIC的现任与往届成员，感谢他们在慢性淋巴细胞白血病（CLL）免疫遗传学研究中所表现出的投入与热忱。我们还要感谢IMGT/CLL-DB倡议项目所有成员的密切合作，特别感谢法国蒙彼利埃第二大学蒙彼利埃分子免疫遗传学实验室（LIGM）的Marie-Paule Lefranc教授和Veronique Giudicelli博士，以及国际免疫遗传学信息系统（IMGT），感谢他们在免疫球蛋白（IG）基因序列分析方面提供的巨大支持与帮助。本研究部分得到了以下资助：TRANSCAN-179 NOVEL JTC 2016项目；意大利癌症研究协会（AIRC）研究员资助项目（#20246）及分子临床肿瘤学专项计划—5 per mille（#9965），意大利米兰；意大利大学与科研部（MIUR）重要国家研究项目（PRIN）#2015ZMRFEA，意大利罗马；瑞典癌症协会、瑞典研究理事会、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会、卡罗林斯卡学院、乌普萨拉大学、乌普萨拉大学医院及乌普萨拉狮子会癌症研究基金会；ODYSSEUS计划，由 &#34;科研与技术领域战略发展行动计划&#34;，由运营计划资助 &#34;竞争力、创业与创新&#34; （NSRF 2014-2020）并由希腊和欧盟（欧洲区域发展基金）共同资助。

该研究方案已获得意大利米兰圣拉斐尔科学研究所伦理委员会的批准。
1. 材料选择
<ol>
	<li>起始材料的选择 
	注意：在大多数慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例中，诊断时肿瘤细胞比例较高（&#62;80–90%）。因此，通常无需对白血病细胞进行分选或富集。
	<ol>
		<li>若使用外周血（PB）——这是免疫球蛋白基因序列分析最常用的材料——采集血量应在10–20 mL之间。</li>
		<li>对于CLL细胞负荷较低的情况，可选择对外周血样本进行细胞分选，或采用其他组织来源的材料，如骨髓（BM）或淋巴结（LN）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采样时间
	<ol>
		<li>由于免疫球蛋白体细胞超突变（IG SHM）状态在病程中保持稳定，因此采样时间通常并不关键；但应避免在某些特定时期采样，例如治疗期间或治疗刚结束后，因为此时CLL细胞数量可能过低，会增加分析难度并导致结果不可靠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>材料采集与保存 
	注意：起始材料的采集与保存方式在很大程度上取决于所选材料类型。
	<ol>
		<li>对于外周血或骨髓样本，应使用EDTA或CPT（柠檬酸盐-三羟甲基氨基甲烷-吡哆磷酸）抗凝采血管，以防止抑制PCR扩增过程；也可选用肝素抗凝管。</li>
		<li>对于淋巴结样本，可选择细胞悬液、新鲜冷冻组织活检，或极少数情况下使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 密度梯度分离
注意：如果选择外周血（PB）或骨髓（BM）作为起始材料（这是最常见的场景），建议使用密度梯度离心法分离单个核细胞。
<ol>
	<li>向一个50 mL无菌收集管中加入200 µL EDTA（0.5 M EDTA / pH 8.0）。加入20 mL PB和15 mL RPMI。用移液器吹打混合（2–3次即可）。</li>
	<li>向一个新的50 mL收集管中加入15 mL密度梯度介质。 
	注意：如果PB体积少于20 mL，则应相应调整RPMI（前一步）和密度梯度介质的体积。</li>
	<li>缓慢将步骤2.1中的溶液叠加至密度梯度介质上，避免破坏梯度。关闭离心机制动，以800 × g离心20分钟。</li>
	<li>使用无菌巴斯德移液管收集位于上层血浆/血小板层与密度梯度介质层之间的单个核细胞环，并转移至一个无菌的15 mL收集管中。</li>
	<li>加入RPMI至终体积为12 mL并混匀。以750 × g离心8分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL RPMI重悬细胞沉淀，并重复步骤2.5。</li>
	<li>将细胞沉淀溶解于1 mL PBS（DPBS，无钙、无镁）中。通过将20 µL样本与80 µL 1:10 Türk's溶液混合，使用Neubauer计数板进行细胞计数。</li>
	<li>如果样本的后续处理未安排在当天进行，则以750 × g离心8分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀在-80o C保存。</li>
</ol>
3. 核酸提取
<ol>
	<li>确定用于分析IG基因体细胞高频突变（SHM）状态的模板。基因组DNA（gDNA）是最常用的选择，因其无需进行逆转录步骤； alternatively，使用RNA/互补DNA（cDNA）可确保所检测的至少在转录水平上为具有功能性的、可读框完整的克隆重排IG序列 &#34;首选的&#34; 靶标</li>
	<li>使用多种市售试剂盒中的一种，适用于基因组DNA或总RNA提取及cDNA合成（参见 材料表).</li>
	<li>使用高灵敏度的核酸定量系统评估 DNA 或 RNA 的完整性。若使用 FFPE 样本进行分析，可通过已知看家基因的 PCR 扩增来评估所提取 gDNA/cDNA 的质量与数量。 例如 视黄酸受体α（retinoic acid receptor alpha (RARα)，β-actin， 等等。.</li>
</ol>
4. IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的扩增与测序
<ol>
	<li>IGH PCR 引物选择
	<ol>
		<li>建议使用IGHV亚群特异性的5'引物和IGHJ基因特异性的3'引物进行多重PCR25,26如果结果不理想，应使用单一的IGHV亚群特异性引物分别配制PCR反应体系。</li>
		<li>使用与IG重排上游紧邻的 leader 区域或编码区域内结合的5'引物（例如 免疫球蛋白重链可变区基因（IGHV）的框架区1（FR1）。
		<ol>
			<li>使用能够扩增整个重排的 IGHV-IGHD-IGHJ 基因序列的 leader 引物，从而准确评估体细胞超突变（SHM）水平。因此，欧洲免疫介导性肾脏病研究网络（ERIC）在其更新的免疫球蛋白（IG）基因序列分析指南中推荐使用 IGHV leader 引物。27.</li>
			<li>在引物无法扩增出克隆型IG重排的情况下，使用IGHV FR1引物。然而，框架区引物不能扩增出完整的克隆型IG基因重排，可能导致体细胞超突变（SHM）水平的判断不准确。在此情况下，应在临床报告中明确说明：使用IGHV FR1引物可能会高估与最接近种系基因的真实同源性百分比。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于3'端，根据模板的不同，使用靶向IGHJ基因的简并引物、IGHJ基因特异性引物的多重引物组合或亚型特异性引物。引物序列见表1，而 图1 展示了引物退火的不同位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的 PCR 扩增
	<ol>
		<li>使用每种亚组引物的等摩尔量制备引物混合物，以确保无偏倚的扩增。
		<ol>
			<li>例如，在使用引物前导序列时，需采用两种不同的引物来扩增属于IGHV1亚群的重排。因此，这两种引物（IGHV1L和IGHV1bL）的用量应为IGHV4L引物的一半，因为后者是扩增IGHV4亚群重排的唯一引物。</li>
			<li>对于 IGHJ1-2 和 IGHJ4-5 引物，采用相反的策略。由于这些引物分别靶向两个不同的 IGHJ 基因亚群，其用量应为 IGHJ3 和 IGHJ6 引物的两倍。</li>
			<li>使用 表1 以确定配制相关引物混合物时引物的精确用量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按所列清单混合PCR试剂 表 2将所有PCR试剂加入PCR管后，添加0.5 µL Taq聚合酶和100 ng基因组DNA，或2 µL cDNA（cDNA应使用1 µg RNA制备）。 
		注意：使用具有校对活性的Taq酶并非必需，因为扩增错误率极低，因此不会影响体细胞超突变（SHM）水平。</li>
		<li>运行下述详细的热循环PCR程序 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆性评估 
	注意：下一步关键步骤是评估PCR产物的克隆性模式。在评估慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者克隆性时，最常见的结果为单一的单克隆峰/条带。
	<ol>
		<li>采用高灵敏度方法（如片段分析或异源双链分析）进行克隆性评估28,29.</li>
		<li>片段分析
		<ol>
			<li>使用5'-标记的IGHV前导序列或FR1亚群特异性PCR引物进行多重PCR扩增；所得PCR产物可通过毛细管电泳分离，从而根据IGHV互补决定区3（CDR3）的长度对IGH PCR产物进行克隆性分析。</li>
			<li>使用与前述相同的引物、试剂和热循环条件（见表1-3）。定制的5´端标记引物是带有5'端染料标记的荧光寡核苷酸，可选择不同的荧光染料。常见的报告荧光染料包括6-FAM、HEX、NED或TET。因此，由于每轮反应使用三种不同的荧光染料，需进行两个独立的反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在6%聚丙烯酰胺凝胶上检测PCR产物的大小（该浓度可获得最佳分辨率），使用1×TBE作为电泳缓冲液，80 V恒压电泳45分钟。 
		注意：建议让PCR产物在凝胶中充分迁移，以便将单克隆样品与多克隆背景分离，并使DNA大小标记物得到充分分辨。凝胶的大小和厚度等因素可能影响迁移效果，因此无法通过单一的电压和时间设置来保证获得最佳结果。尽管如此，以80 V电压电泳45分钟是一个良好的起始条件，可最大限度降低样品迁移过快而“跑出”凝胶的风险。</li>
		<li>使用IGHV leader引物时，检测约500个碱基对的PCR产物；使用IGHV FR1引物混合物时，检测约350个碱基对的PCR产物。 
		注意：在极少数情况下，慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例可能携带双克隆性单克隆产物，而在更为罕见的情况下，病例可能呈现寡克隆模式。可使用嵌入剂（如溴化乙锭，EtBr）或商业化的、危害较小且更灵敏的DNA染料，通过紫外激发或蓝光照射来可视化聚丙烯酰胺凝胶上的DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物纯化 
	注意：为去除慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本中正常B细胞可能产生的多克隆背景以及可能影响测序质量的引物二聚体，需对PCR产物进行纯化。可采用任何能够去除未掺入的dNTP和引物的方法进行PCR产物纯化，例如酶法处理。 例如， 虾碱性磷酸酶（Sap）/外切核酸酶I（Exo），或基于柱的纯化。
	<ol>
		<li>将PCR产物的总体积上样至3%低熔点琼脂糖凝胶中。</li>
		<li>让PCR产物在凝胶中电泳至与背景分离。</li>
		<li>切下清晰且明显的PCR条带，进行纯化和洗脱。若检测到两种重排，则应分别切下两条带并独立测序。</li>
		<li>进行Sap/Exo纯化时，应遵循制造商关于具体使用体积的说明；但通常每5–10 µL PCR反应体系可加入1 µL Sap、0.5 µL Exo和2 µL 5×孵育缓冲液。轻轻涡旋混匀各样品，置于PCR仪中37 °C孵育30分钟。随后在85 °C加热15分钟以灭活酶。</li>
		<li>在3%琼脂糖凝胶上加载少量PCR产物，以评估产物的纯度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sanger 测序
注意：存在多种测序策略，但无论采用何种具体方法，都必须对两条链进行直接测序，以确保结果可靠。
<ol>
	<li>通用测序方案
	<ol>
		<li>如果使用单一引物进行了扩增，则继续使用相应的IGHV和IGHJ或恒定区特异性引物进行测序。如果使用了多重荧光标记引物，并通过片段分析对PCR产物进行了检测，也可采用该方法（测序引物应&#160;不&#160;进行标记）。</li>
		<li>如果使用了多重引物并在凝胶上评估了克隆性，则在测序的第一步使用下游引物 例如 一种共识性 IGHJ 引物，其序列为 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'。或者，如果以 cDNA 作为模板，则可使用 CH 引物。接下来，在第二轮测序中使用亚群特异性的 IGHV 领导序列或 FR1 引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>示例测序方案 
	注意：存在多种测序方案，以下详述其中一种示例方案。
	<ol>
		<li>使用，将 33 ng 的 PCR 产物稀释至总体积为 11.5 µL 例如， 无菌水。将PCR产物在95 °C加热5分钟以使其变性，随后立即置于冰上10分钟，以防止二级结构的形成。</li>
		<li>向每根试管中加入8 µL主混合液和0.5 µL（相当于5 pmol）的引物。</li>
		<li>作为对照，准备一个含有8 µL主混合液、0.5 µL pUC18对照模板、2 µL (-)47测序引物和9.5 µL无菌水的离心管。每个离心管中的最终总体积应为20 µL。</li>
		<li>使用测序反应的热循环条件，具体如下所述： 表4.</li>
		<li>通过混合2 µL 3M醋酸钠（pH 5.2）、2 µL 100 mM EDTA（pH 8.0）和1 µL糖原（浓度20 mg/mL）配制终止液，然后向每个样品中加入5 µL。将产物转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>加入60 µL 100%乙醇（-20 °C），轻轻混匀。在4 °C下以14,000 rpm离心15分钟。弃去上清液。</li>
		<li>加入100 µL 70%乙醇（-20 °C），轻轻混匀。在4 °C下以14,000 rpm离心10分钟。弃去上清液。重复一次。</li>
		<li>室温下将沉淀干燥90分钟。向每个样品中加入40 µL十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。</li>
		<li>将样品转移至测序板中，用条形帽或封口膜密封，装载到仪器上并进行Sanger测序。测序板通常为适用于测序仪的96孔、V型底、全裙边PCR板。根据测序是在本实验室、商业公司还是学术测序中心/平台进行，测序板可带有条形码。

关键词：测序板，Sanger测序，96孔板，V型底，全裙边PCR板，条形码</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序完成后，将来自各个测序步骤产生的两条读段“拼接”起来，以形成完整的 IGHV 基因重排 即， 一致序列</li>
</ol>
6. 序列分析
注意：以下部分重点介绍使用 IMGT/V-QUEST 工具30分析重排的免疫球蛋白（IG）序列时所获得的输出结果，以及 IMGT/JunctionAnalysis31，这两者在临床报告和研究中尤为重要。IMGT/V-QUEST 是一种比对工具，可将用户提交的 IG 序列与 IMGT 参考目录集进行比对30。该工具的输出包含多个部分，用户可在其中定义特定参数。
<ol>
	<li>指定物种，例如，Homo sapiens（人）以及受体类型或位点（例如 IGH、IGK 或 IGL）。</li>
	<li>将待分析的序列以 FASTA 格式（包含标题行）粘贴至文本区域（每次运行最多 50 条序列）。或者，也可选择输入本地文件路径，该文件包含待分析的 FASTA 序列。</li>
	<li>从以下三种结果展示方式中选择其一：
	<ol>
		<li>详细视图：选择此选项可获得每条序列的单独分析结果。</li>
		<li>汇总视图：选择此选项可生成按 IGHV 基因及等位基因名称或按输入序列顺序排列的汇总表格。该选项还提供序列比对结果，对同一批次中被归为同一 IGHV 基因和等位基因的序列进行对齐。</li>
		<li>Excel 文件：选择此选项可将所有输出文件整合为一个包含多个工作表的电子表格文件。所有查看选项均提供大量基础与高级参数供选择，但本文“代表性结果”部分仅讨论与 CLL IG 序列分析最相关的因素。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. ARResT/AssignSubsets 工具
<ol>
	<li>为了研究慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的 B 细胞受体免疫球蛋白（BcR IG）序列相似性（更多细节见下文“代表性结果”部分），请将 IGHV-IGHD-IGHJ FASTA 序列提交至 ARResT/AssignSubsets 工具32。该工具将报告序列被分配至的主要 CLL 序列相似性亚组。该亚组分配工具及详细操作说明可在 ARResT/AssignSubsets 网站32 获取，也可在 ERIC 网站的服务（services）标签页下找到。</li>
</ol>

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<li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li>
<li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL%3A+Updated+results+of+the+CLL8+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li>
<li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li>
<li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fludarabine%2C+cyclophosphamide%2C+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+diagnosis%2C+indications+for+treatment%2C+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations%3A+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li>
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<li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li>
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</ol>

作者无相关利益冲突需要披露。

CLL中IG基因的研究不仅对于深入理解疾病的病理生物学机制至关重要，而且对于改善患者的危险分层也具有重要意义。因此，以标准化的方式进行IG基因序列分析的多步骤操作及后续序列数据的解读显得尤为关键。合适的、足量的患者样本的可获得性以及采样时机不应影响IG基因突变分析的实施，因为该检测可在外周血（PB）以及任何CLL肿瘤细胞含量较高的样本上进行。采用密度梯度分离法分离外周血单个核细胞是诊断实验室的常规操作，操作过程中在将血液/RPMI溶液添加至含有梯度介质的离心管时应格外小心；此步骤应缓慢、轻柔地进行，以避免破坏梯度层并防止细胞丢失。
细胞分离后提取核酸。基因组DNA（gDNA）和互补DNA（cDNA）均适用于克隆重排IGH的体细胞超突变（SHM）分析，但使用任一种材料均有其优缺点。使用gDNA时，由于无需在PCR扩增前进行逆转录反应，实验室操作流程更为快速。然而，以gDNA为PCR模板可能导致功能性与非功能性重排同时被扩增，进而增加实验操作的工作量。 即， 多重PCR产物的纯化或凝胶切胶，以及所有重排产物的单独测序。在比较基因组DNA（gDNA）与cDNA方法时，后者需在PCR扩增前进行逆转录步骤。然而，在此情况下，大多数情况下仅能扩增并随后测序可读框内的免疫球蛋白（IG）重排。因此，仅需纯化并测序单一PCR产物，结果解读也更为直接。
扩增效率在很大程度上取决于gDNA/cDNA的质量，应使用灵敏的定量方法进行评估，同时也取决于所使用的引物。引物的选择在整个分析过程中至关重要，因为只有扩增出重排IGHV基因的完整序列，才能准确测定体细胞超突变（SHM）水平。只有使用5' IGHV前导区引物，才能评估全长重排，这也支持了欧洲研究慢性淋巴细胞白血病免疫学特征协作组（ERIC）近期推荐使用前导区引物的建议27。使用其他引物导致扩增出不完整的IGHV-IGHD-IGHJ基因重排，不适合用于IGHV基因突变分析，因此强烈不推荐。唯一的例外情况是，当使用IGHV前导区引物反复出现阴性结果，且无法获取新的患者样本或新样本仍无法获得结果时。如果更换不同的患者样本和/或材料（gDNA/cDNA）以及多组引物仍无法扩增出PCR产物，则可能的原因包括肿瘤细胞负荷过低，或淋巴细胞增多并非由慢性淋巴细胞白血病（CLL）克隆引起（此时应重新评估免疫表型）。用于分析的引物应在临床报告中明确注明。
由于慢性淋巴细胞白血病（CLL）源于携带相同IGHV-IGHD-IGHJ基因重排的单克隆B细胞的积聚，绝大多数病例的克隆性评估将显示出一个独特的单克隆峰。 即， 单克隆。在极少数情况下，可观察到双重组或甚至寡克隆模式35在此类情况下，凝胶电泳并非克隆性评估的首选技术，应采用更为敏感的方法，如片段分析。在确认克隆性后，测序前的最后一步是纯化PCR产物，以确保获得高质量的序列。最后，ERIC推荐使用IMGT/V-QUEST工具进行免疫球蛋白（IG）序列分析。由于IMGT数据库持续更新，并以一致且注释完善的方式报告结果，该工具可确保分析的标准化，并促进不同临床或学术机构之间的比较分析。
由于慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的免疫遗传学分析具有预后意义，尤其是预测意义，因此对IGHV-IGHD-IGHJ基因重排进行全面分析，包括确定其是否属于主要的CLL刻板亚型，已不再仅仅是理想选择，而是至关重要。在新型治疗手段不断涌现的当下，这一重要性尤为突出，因为免疫球蛋白基因分析具有指导治疗决策的潜力5,21,22,23,36,37,38，这一点已在国际CLL研讨会（International Workshop on CLL）近期更新的美国国家癌症研究所（NCI）资助指南中正式指出24。然而，严格的分析标准是必要的，特别是确定CLL患者克隆型IGHV基因的体细胞超突变（SHM）状态并非易事，而是一个多步骤的过程。其中某些实验步骤，尤其是引物的选择，若采用特定方案或策略，可获得更优结果；而其他技术环节，如样本选择或克隆性评估方法，则在一定程度上具有灵活性，因为这些因素对最终结果的影响甚微，甚至无显著差异。
在过去十年中，ERIC 致力于推动与慢性淋巴细胞白血病（CLL）诊断和预后相关的各种方法的标准化与统一。这体现在已发表的免疫遗传学分析建议和指南27,34、多次组织的教育培训研讨会和活动、IG 网络的建立，以及为讨论和指导 CLL 中 IG 基因序列解读而设立的专家在线论坛。ERIC 通过这些举措的总体目标是促进最佳的临床管理和患者照护。尽管已付出巨大努力，但这项任务远未完成，事实上，由于旨在免疫谱型分析的新型高通量测序技术的发展，其复杂性进一步增加。然而，尽管仍存在挑战，针对 CLL 中 IG 基因分析的严格标准化工作仍在持续进行，并且目前仍是 ERIC 内部正在进行的各项活动的重点。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家成人中最常见的白血病类型，其特征是成熟的肿瘤性B细胞发生克隆性扩增1。从临床角度来看，该疾病的病程差异极大：部分患者病情进展迅速，诊断后需尽早接受治疗，且常出现复发或对治疗耐药；而相比之下，相当一部分患者（约30%）表现为惰性病程，终生无需治疗，其预期寿命与健康同龄人相似2。这种临床异质性反映了CLL患者中存在多种多样的分子异常，这些异常最终驱动了该疾病的发病机制和疾病进展3。
慢性淋巴细胞白血病（CLL）的准确诊断通常较为直接，然而上述临床异质性可能阻碍对CLL患者的高效管理，并凸显了对预后和预测标志物的需求，这些标志物可辅助治疗决策2。大量研究致力于优化CLL的预后评估，最终提出了众多新的临床和生物学标志物4。克隆型免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因的突变状态是CLL中最可靠的预后标志物之一，主要原因在于：（i）该状态在疾病进展过程中及随时间推移保持稳定；（ii）其独立于其他临床和生物学参数5。尽管如此，目前在诊断时的临床常规实践中，极少有标志物（包括IGHV突变状态）被实际应用。
关于IGH基因测序在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中临床应用的最初报道可追溯至1999年，当时两项独立研究报道，体细胞超突变（SHM）负荷为无或极低的患者（即未突变型CLL，U-CLL）预后较具有较高SHM负荷的患者（即突变型CLL，M-CLL）更差6,7。更具体而言，U-CLL组包含克隆型IGHV基因中SHM极少或无的病例，因此其与最接近的种系IGHV基因序列的相似度很高（≥98%）；而M-CLL组则包含突变负荷较高的病例（与最接近的种系IGHV基因序列的相似度&#60;98%）。自这些早期研究以来，持续有证据表明，与M-CLL相比，U-CLL患者的首次治疗时间间隔（TTFT）更短，总体生存期（OS）也更短。
回顾这些开创性研究，它们凸显了B细胞受体（BcR）IG在慢性淋巴细胞白血病（CLL）发病机制中的关键作用，从而为深入研究CLL与微环境之间的相互作用铺平了道路，进而加深了对该疾病生物学异质性的全面认识8,9。近期的研究进一步证实了免疫遗传学分析在CLL中的重要性，发现个别病例因具有（近乎）相同的BcR IG基因序列而可聚类为特定亚群，这一现象被称为BcR IG序列的刻板化（stereotypy）10,11,12,13。越来越多的证据表明，归属于同一刻板化亚群的患者具有相似的临床生物学特征，这些特征使其明显区别于同属相同SHM类别但IG基因序列不同的其他CLL患者；事实上已有报道指出，基于BcR IG刻板化的CLL患者分类可进一步细化将CLL患者总体划分为U-CLL或M-CLL的分组方式14,15,16,17,18,19,20。
从临床角度来看，克隆型 IGHV 基因的体细胞超突变（SHM）状态似乎与对化学免疫治疗的特定反应相关。特别是接受氟达拉滨/环磷酰胺/利妥昔单抗（FCR）联合治疗的 M-CLL 患者，该方案是体能状态良好的、无特定并发症的 CLL 患者的标准治疗方案 TP53 基因缺陷的患者相比接受相同治疗的U-CLL患者，无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著更长21,22,23因此，确定体细胞超突变（SHM）状态对于辅助慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的治疗管理尤为重要 即， 一种预测性标志物，而非用于评估疾病的临床病程 即， 预后标志物。事实上，根据美国国家癌症研究所（NCI）资助的慢性淋巴细胞白血病国际工作组最新更新的指南，所有慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例在开始治疗前，无论是在常规临床实践还是临床试验中，均应检测重排的 IGHV 基因的体细胞超突变（SHM）状态。24此外，由于近期新型治疗药物的获批以及正处于临床试验阶段的药物数量不断增加，IG分子的体细胞超突变（SHM）状态可能在不久的将来对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的治疗管理发挥更为重要的作用5.
本报告详细阐述了免疫球蛋白基因序列分析的各个方面，从选择合适的样本材料开始，到最终对测序结果进行临床解读。在诊断常规中，深入评估这些步骤对于获得可靠结果以及确保临床试验中患者的准确分层至关重要。本文提供了相关实验方案，以促进免疫球蛋白基因序列分析的标准化，从而确保不同实验室之间的结果具有可比性。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA 抗凝塑料采血管：管塞</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>02-689-4</td><td>材料储存</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT 单个核细胞分离管 - 肝素钠</td><td>Becton Dickinson</td><td>362753</td><td>材料储存</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 肝素采血管常见问题解答</td><td>Daigger Scientific</td><td>366480</td><td>材料储存</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575038</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>15 mL 离心管 CS500</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯离心管 CS500</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1X），液体</td><td>Invitrogen</td><td>21875-091</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS，6 × 100 mL</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17-1440-02</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>861,253,001</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,001</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>861,685,001</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1X）</td><td>Invitrogen</td><td>14190250</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 板）</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>Türk 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93770</td><td>细胞处理</td></tr><tr><td>PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K1820-01</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>QIAamp RNA 血液小量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>52304</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA 小量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA 提取</td></tr><tr><td>5X 第一链合成缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y02321</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>随机引物，20 &amp;micro;g</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>RNaseOUT&amp;trade; 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y00147</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>cDNA 合成，PCR</td></tr><tr><td>PCR 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>O00065</td><td>PCR</td></tr><tr><td>MgCl2（氯化镁）（25 mM）</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AB0359</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶，重组</td><td>Invitrogen</td><td>10342-020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 5&amp;prime; 标记引物</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>-</td><td>PCR/克隆性分析</td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA 检测试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>PCR 产物定量</td></tr><tr><td>UltraPure TBE 缓冲液，10X</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>15581044</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>UltraPure 溴化乙锭，10 mg/mL</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>15585011</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S33102</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>10X BlueJuice 凝胶上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE 即用型</td><td>Geneon</td><td>305-105</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>16500500</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-250G</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>Novex TBE 凝胶，10%，10 孔</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EC6275BOX</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>78201.1.mL</td><td>PCR 产物纯化</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>PCR 产物纯化</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS 快速启动试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>Sanger 测序</td></tr><tr><td>乙酸钠溶液（3 M），pH 5.2</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R1181</td><td>Sanger 测序</td></tr><tr><td>糖原，分子生物学级</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R0561</td><td>Sanger 测序</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>1024282500</td><td>Sanger 测序</td></tr><tr><td>SafeSeal 1.5 mL 管</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>通用</td></tr><tr><td>Multiply-Pro 0.2 mL 杯，聚丙烯</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td>通用</td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td></td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>生物分析仪（Bioanalyzer）</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>设备</td></tr></tbody></table>

慢性淋巴细胞白血病中的免疫球蛋白基因序列分析：从患者样本到序列解读

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白（IG）基因的V(D)J重排与体细胞高频突变（SHM）这一复杂过程，使得每个个体B细胞内产生独特的DNA序列。由于B细胞恶性肿瘤源于单个细胞的克隆性扩增，因此IG基因构成了同一患者所有恶性细胞共有的独特分子标志；因此，IG基因重排可作为克隆性标记物。除了作为重要的克隆标识外，IG基因序列还可充当“分子时间线”，因其与特定的发育阶段相关，从而反映了发生肿瘤转化的B细胞的演化历史。此外，对于某些恶性肿瘤，尤其是慢性淋巴细胞白血病（CLL），IG基因序列具有预后判断甚至潜在的预测价值。然而，若缺乏可靠的方法和工具来辅助分析，从IG基因序列分析中得出有意义的结论将是不可能的。本文借鉴欧洲慢性淋巴细胞白血病研究倡议组织（ERIC）的丰富经验，详细阐述了确保CLL患者IG基因序列分析结果可靠且可重复所需的技术要点和基本要求，该检测目前已被推荐用于所有CLL患者治疗前的评估。更具体而言，本文描述了从识别克隆型IG基因重排、确定核苷酸序列，到对IG基因序列数据进行准确临床解读的各个分析阶段。

本文介绍了一项基于欧洲慢性淋巴细胞白血病研究倡议组织（European Research initiative on CLL，ERIC）积累经验的实验方案，详细阐述了确保慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者免疫球蛋白基因序列分析可靠性的技术要点和基本要求。

在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白（IG）基因V(D)J重排这一复杂过程与体细胞高频突变（SHM）相偶联，从而产生...

该方法有助于解答慢性淋巴细胞白血病领域中的关键问题，例如患者的准确预后判断。此技术的主要优势在于操作简便、快速且高度准确。该技术的应用意义在于实现可靠的预后评估，尤其体现在对慢性淋巴细胞白血病患者的危险分层认证方面，因为准确的预后判断可能进一步决定该疾病的治疗管理策略。该方法的可视化演示至关重要，例如PCR产物选择和消化序列分析类型，因其需要精确性和经验而难以掌握。开始此操作时，向一个50毫升无菌收集管中加入200微升EDTA。向管中加入20毫升外周血和15毫升RPMI培养基，并上下吹打两到三次以混匀。接下来，向一个新的50毫升收集管中加入15毫升密度梯度介质。将外周血溶液缓慢地铺加到密度梯度介质上，确保不破坏梯度。以800 ×g 离心20分钟，离心时关闭离心机制动。然后使用无菌巴斯德吸管收集位于上层血浆血小板层与密度梯度介质层之间形成的单个核细胞环，并将其转移至一个新的无菌15毫升收集管中。加入RPMI培养基，使最终体积达到12毫升，用移液器反复吹打溶液以混匀。在800 × g条件下离心8分钟。弃去上清液，并用 10 毫升 RPMI 培养基重悬细胞沉淀。再次以 750 × g 离心 8 分钟。随后，弃去上清液，将细胞沉淀溶于 1 毫升 PBS 中。使用新的Bauer板，通过混合20微升样本和80微升1:10的Turk溶液进行细胞计数。如果样本的后续处理未安排在同一天进行，则以750 × g离心8分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀在-80°C下保存。首先，使用每个亚组引物的等摩尔量配制引物混合液，以确保扩增无偏倚。按照文本方案中表二所列的成分混合PCR试剂。向含有混合PCR试剂的PCR管中加入0.5 µL的TAP聚合酶。然后，加入100纳克的gDNA或2微升的cDNA。按照文本方案中表三详述的条件运行热循环PCR程序。随后，使用IGHV引物时检测约500个碱基对的PCR产物，使用IGHPFR1引物混合物时检测约350个碱基对的PCR产物。开始PCR产物纯化时，将PCR产物的总体积上样至3%低熔点琼脂糖凝胶。使PCR产物在凝胶中电泳，直至其与背景分离。切下清晰且明显的PCR条带，随后对其进行纯化并洗脱。若检测到两种重排，应分别切取两条条带并进行独立测序。进行exo-sap纯化时，需按照制造商提供的说明使用相应的具体体积。轻轻涡旋混匀每个样品，然后在PCR仪中于37摄氏度孵育30分钟。通过在 85 摄氏度下加热 15 分钟使酶失活。随后，取少量 PCR 产物上样至 3% 琼脂糖凝胶，以评估产物的纯度。测序前的最后一个检查点是通过片段分析确定样品的克隆性。开始分析序列时，启动相应的软件。指定物种（例如 homo sapiens）以及受体类型或基因座。将待分析的序列以 fasta 格式并包含标识符，分批输入到文本区域中，每次运行最多可处理 50 条序列。然后，从以下三种结果显示方式中选择一种。详细视图：选择此选项可单独获取每条序列的结果。合成视图：选择此选项可生成一个按 IGHV 基因及等位基因名称或按序列输入顺序排列的汇总表格。该选项还可对在任何提交批次中被分配到相同 IGHV 基因和等位基因的序列进行比对，并最终生成 Excel 文件。选择此选项可将所有输出文件作为工作表整合到单个文件中。只有使用 IGHV liter 引物才能扩增出重排 IGHV 的全长序列，从而准确定量真实的 HSM 负荷。预期的PCR产物约为500个碱基对。在极少数情况下，若IGHV引物无法扩增出克隆型IG重排，则可使用IGHBFR1引物，此时预期的PCR产物约为350个碱基对。获得的序列随后使用 IMG TV Quest 工具进行分析。结果表格中的第一行显示序列的功能，因为免疫球蛋白重排序列可能是有功能的，也可能是无功能的。当 VDJ 区域内存在终止密码子和/或由于插入/缺失导致重排移码时，IGH 基因重排即为无功能的。需要注意的是，只有能够产生功能性蛋白的重排序列才应进行后续分析。使用默认的IMG TV Quest参数时，插入和缺失不会被自动检测，但该工具会提供序列可能存在此类变异的明显提示，并在结果汇总表下方显示警告提示。在进行此操作时，务必注意将PCR产物在凝胶上电泳足够长的时间，以便能够区分克隆条带与多克隆背景。 该技术问世后，为慢性淋巴细胞白血病免疫遗传学领域的研究人员探索患者体细胞表观突变状态的预后影响铺平了道路。请务必注意，溴化乙锭的操作具有极高危险性，在进行本实验时，必须始终采取预防措施，例如始终在通风橱内操作。

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慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析: 从患者材料到序列解释

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。...

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

本方案描述了一种通过深度测序分析淋巴瘤中重排的免疫球蛋白重链VDJ区域的方法，可获取VDJ重排及体细胞高频突变状态，以解析单个肿瘤的克隆结构。通过比较配对的初诊与复发样本之间的克隆结构，揭示淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。...

VDJ-Seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示B细胞淋巴瘤的克隆演化模式

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。...

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

本文介绍了一种结合流式细胞分选与低起始量下一代测序文库构建的实验方案，旨在从经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金-里德-斯特恩伯格（HRS）细胞中获得高质量的全外显子组数据。...

流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。...

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。...

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

本文介绍了针对完整抗体库结构与组成的分析及可视化方法。该方法涉及利用高通量测序技术获取大量抗体RNA序列。...

通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。...

原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

本方案描述了从血液样本和肠道活检组织中提取DNA，构建用于高通量测序的TCRβ和IGH...

使用下一代测序技术进行T细胞和B细胞受体免疫组库分析

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

学习慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析方法，通过PCR扩增和IMGT/V-QUEST工具进行功能评估。该技术简单快速且高度准确，有助于实现患者的精准预后评估和治疗决策。

慢性淋巴细胞白血病中的免疫球蛋白基因序列分析：从患者样本到序列解读

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