慢性淋巴细胞白血病中的免疫球蛋白基因序列分析：从患者样本到序列解读

该方法有助于解答慢性淋巴细胞白血病领域中的关键问题，例如患者的准确预后判断。此技术的主要优势在于操作简便、快速且高度准确。该技术的应用意义在于实现可靠的预后评估，尤其体现在对慢性淋巴细胞白血病患者的危险分层认证方面，因为准确的预后判断可能进一步决定该疾病的治疗管理策略。

该方法的可视化演示至关重要，例如PCR产物选择和消化序列分析类型，因其需要精确性和经验而难以掌握。开始此操作时，向一个50毫升无菌收集管中加入200微升EDTA。向管中加入20毫升外周血和15毫升RPMI培养基，上下吹打两到三次以混匀。

接下来，向一个新的50毫升收集管中加入15毫升密度梯度介质。将外周血溶液缓慢地铺加到密度梯度介质上，确保不破坏梯度。以800 × g离心20分钟，离心时关闭离心机制动。

然后使用无菌巴斯德吸管收集位于上层血浆血小板层与密度梯度介质层之间形成的单个核细胞环，并将其转移至一个新的无菌15毫升收集管中。加入RPMI培养基，使最终体积达到12毫升，用移液器反复吹打溶液以混匀。在800 × g条件下离心8分钟。

弃去上清液，并用 10 毫升 RPMI 培养基重悬细胞沉淀。再次以 750 × g 离心 8 分钟。随后弃去上清液，将细胞沉淀溶于 1 毫升 PBS 中。

使用新的Bauer板，通过混合20微升样本与80微升1:10的Turk溶液进行细胞计数。如果样本的后续处理未安排在同一天进行，则以750 × g离心8分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀在-80摄氏度下保存。

首先，使用每个亚组引物的等摩尔量制备引物混合物，以确保无偏扩增。按照文本方案中表二列出的成分混合PCR试剂。向含有混合PCR试剂的PCR管中加入0.5 µL TAP聚合酶。

然后，加入100纳克的基因组DNA或2微升的cDNA。按照文本方案中表三所述的条件运行热循环PCR程序。随后，使用IGHV引物时检测约500个碱基对的PCR产物，或使用IGHPFR1引物混合物时检测约350个碱基对的PCR产物。

开始PCR产物纯化时，将PCR产物的总体积上样至3%低熔点琼脂糖凝胶。使PCR产物在凝胶中电泳，直至其与背景分离。切下清晰且明显的PCR条带，随后对其进行纯化并洗脱。

若检测到两种重排，应分别切取两条条带并进行独立测序。进行exo-sap纯化时，需遵循生产商提供的说明，使用指定体积的试剂。轻轻涡旋混匀每个样本，并在PCR仪中于37摄氏度孵育30分钟。

将酶在85摄氏度下加热15分钟以使其失活。随后，取少量PCR产物上样至3%琼脂糖凝胶，以评估产物的纯度。测序前的最后一个检查点是通过片段分析确定样本的克隆性。

开始分析序列时，启动相应的软件。指定物种（例如 homo sapiens）以及受体类型或基因座。将待分析的序列以 fasta 格式并包含标识符分批输入到文本区域中，每次运行最多可处理 50 条序列。

然后，从以下三种结果显示方式中选择一种。详细视图：选择此选项可单独获取每条序列的结果。合成视图：选择此选项可生成一个按 IGHV 基因及等位基因名称或按序列输入顺序排列的汇总表格。

该选项还可对在任何提交批次中被分配到相同 IGHV 基因和等位基因的序列进行比对，并最终生成 Excel 文件。选择此选项可将所有输出文件作为工作表整合到单个文件中。只有使用 IGHV liter 引物才能扩增出重排 IGHV 的全长序列，从而准确定量真实的 HSM 负荷。

预期的PCR产物大小约为500个碱基对。在极少数情况下，若IGHV引物无法扩增出克隆型IG重排，则可使用IGHBFR1引物，此时预期的PCR产物大小约为350个碱基对。

获得的序列随后使用 IMG TV Quest 工具进行分析。结果表格中的第一行显示序列的功能，因为免疫球蛋白重排序列可能是有功能的，也可能是无功能的。当 VDJ 区域内存在终止密码子和/或由于插入/缺失导致重排移码时，IGH 基因重排即为无功能的。

需要注意的是，应进一步分析的仅限于具有读码框且功能完整的重排序列。当使用默认的IMG TV Quest参数时，插入和缺失不会被自动检测，但该工具会提供序列可能携带此类变异的明显提示，并在结果汇总表下方显示警告提示。在进行此操作时，务必注意将PCR产物在凝胶上电泳足够长的时间，以便能够区分克隆条带与多克隆背景。

该技术建立后，为慢性淋巴细胞白血病免疫遗传学领域的研究人员探索患者体细胞表观突变状态的预后影响铺平了道路。请注意，溴化乙锭的操作具有极高危险性，在进行本实验时，必须始终在通风橱内操作，并采取相应的防护措施。