Name: 小鼠宫内移植中静脉和羊膜内植入的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学习小鼠宫内移植技术，掌握静脉和羊膜内注射方法，用于胚胎学、基因治疗和干细胞移植研究。该技术可在免疫耐受的胎儿环境中引入细胞或病毒载体，为发育生物学和实验性治疗提供可靠的研究工具。

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实验方案已获得费城儿童医院机构动物照护与使用委员会的批准。
1. 注射移液管的制备
<ol>
	<li>使用垂直微量移液器拉制仪，拉制一支100 µL的微毛细移液管（图&#160;1A - 1C）。校准微量移液器拉制仪，使拉制出的锥形末端为 &#62; 1 厘米长。 
	注意：最初应调整拉制仪的参数以获得最佳长度。较高的加热设置会使尖端更长，较高的拉力设置会使尖端直径更窄。</li>
	<li>将锥形末端剪裁至长度≥1 cm。确保针尖处的内径在70 µm至100 µm之间，且与锥形末端的长度成反比。 
	注意：内径还取决于微电极拉制仪的校准情况。请参阅垂直微电极拉制仪或任何其他所选类型微电极拉制仪制造商提供的使用说明。</li>
	<li>在确保针头具有正确内径后，使用带金刚石磨轮的微管斜面仪将针尖磨出15 - 20度的斜面。图&#160;2A - 2C）。确保将尖端轻轻靠在轮子上，避免施加过大压力，以降低尖端断裂或开裂的风险。 
	注意：可使用画笔刷去针尖上积聚的任何碎屑。</li>
	<li>在显微镜下评估尖端，确保尖端呈圆形，无任何缺损或裂纹。重新评估内径，确保其在70 µm至100 µm之间（图&#160;二维 - 2H).</li>
	<li>在针头的其余部分画线，使每两条线之间的体积为 5 µL例如，内径为1.3 mm的针头应以3.77 mm的间隔画线。</li>
	<li>手术前将针头进行高压灭菌，并用无菌手套操作。&#160;</li>
</ol>
2. 在子宫内 注射
<ol>
	<li>提前对所需器械进行高压灭菌。包括以下基本器械：显微注射针持针器、外科持针器、一把Adson镊子、一把弯头常规组织剪、1 mL胰岛素注射器、若干棉签、移液管、50 mL锥形管和一包4-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝合线。</li>
	<li>采用无菌操作技术，将针头安装到持针器上，并将其插入显微注射仪。 
	注意：所用压缩氮气的设置如下：注射压力 4 - 6 psi，平衡压力 0 psi。根据注射物质的性质，特别是注射液的黏度以及微移液管的尺寸，注射时间在 0.3 - 1.5 s 之间变化。</li>
	<li>用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）抽取5–10 µL，冲洗针尖以清除可能存在的碎屑，然后排出。重复此操作2–3次。</li>
	<li>用剪刀为2至6个月大的怀孕雌性小鼠剃除腹部毛发以准备手术，注意避免损伤乳头。给予口服镇痛药物（例如每只小鼠给予100 µL浓度为1.5 mg/mL的美洛昔康口服混悬液。</li>
	<li>以所需体积将目标材料（细胞/载体/药物）注入针头。填充时注意避免损坏针尖。 
	注意：每个胎儿的注射体积根据具体实验设计而异。20 µL 适用于注射大量细胞（即，最多10个7 细胞注入卵黄静脉。例如，我们注入了1 x 107 从C57BL/6TgN(act-EGFP)OsbY01小鼠中分离的全骨髓细胞&#34;B6 绿色荧光蛋白（GFP）&#34;小鼠 通过 将10 µL以PBS 1:1稀释的病毒载体进行单次注射，可有效注入妊娠第14天的Balb/c胎鼠卵黄静脉中。</li>
	<li>为校准注射时间，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>推入 模式 在显微注射仪上按3次按钮3，进入注射校准界面。通过增加10或100毫秒的时间间隔来调整注射时间，然后按下 模式 按钮 2次。</li>
		<li>推压 平衡 按下按钮并踩下脚踏板一次。再次踩下脚踏板，评估每次踩压从针头排出的液体体积。若每次踩压排出的体积未校准至所需的 5 - 20 µL，重复步骤 2.6.1 和 2.6.2。 
		注意：通常建议每次推注输送总体目标体积的一半。虽然总体积注入超过 30 µL 甚至 40 µL 是可行的，但我们通常不建议每个胎儿静脉内或羊膜腔内注射超过 20 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将针管填充至所需刻度。</li>
	<li>通过调节氧气流量计至1 L/min，异氟烷挥发罐至3%，开始对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过检查足底反射是否消失来确认小鼠是否已麻醉。将小鼠仰卧位转移至加热垫上。</li>
	<li>涂抹润滑性眼膏以防止角膜干燥。用胶带将小鼠的上下肢固定在垫子上。</li>
	<li>用氯己定擦拭腹部，随后使用酒精&#160;并注射局部麻醉剂（例如，皮下注射 100 µL 0.25% 布比卡因）图3A).</li>
	<li>用剪刀做一个1-2厘米的皮肤切口，切口下缘距离阴道口不得小于1厘米；其下方的筋膜非常薄且呈半透明状。</li>
	<li>识别筋膜的中线，该区域比周围更透明。注意不要损伤位于中线两侧的腹壁上血管。若腹壁上血管受损，可用棉签施加压力以止血。</li>
	<li>使用Adson镊子夹住筋膜，注意不要夹到下方的器官，如肠管、膀胱或胎儿。用剪刀切开筋膜，操作时注意避免损伤任何器官。安全进入腹腔后，延长筋膜切口，其长度不应超过皮肤切口。</li>
	<li>使用棉签将肠道移至腹腔上部，以暴露妊娠子宫。将子宫从切口取出，仔细辨认左右两侧卵巢，确保所有胎仔均被计数（图3B).</li>
	<li>将左侧子宫放回腹腔，仅暴露右侧子宫；这可以防止子宫干燥，并保持未注射胎儿的温度。</li>
	<li>用操作者非优势手的拇指和食指夹住最外侧的胎鼠/羊膜囊图3C）。操作时务必轻柔，以免对胎儿造成任何损伤。</li>
	<li>将解剖显微镜置于合适位置（建议使用10倍放大倍数），调节焦距使胎儿进入视野，调整照明以获得更清晰的观察效果。</li>
	<li>确定注射部位（卵黄静脉、羊膜）。进行静脉内注射时，应先观察卵黄静脉及其吻合支；进行羊膜腔内注射时，应使胚胎右侧朝上以便观察。</li>
	<li>按照下述方法将针头到达目标位置。
	<ol>
		<li>对于一个 静脉注射，操作如下。
		<ol>
			<li>旋转子宫，使被注射的卵黄静脉与针尖平行；注意注射方向必须朝向两条静脉的吻合处。</li>
			<li>将针头以5°角置于子宫上，刺入子宫壁。当针尖位于子宫壁与羊膜囊之间时，将针尖直接对准卵黄静脉上方。</li>
			<li>以接近切线的角度，将针头滑过静脉，直至针尖斜面刺入并进入血管；此时可见针头前端出现回血现象图3D). 
			注意：穿刺静脉可能需要尝试数次，因为针头在首次滑过静脉时可能未能刺入静脉。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于一个 羊膜内注射，操作如下。
		<ol>
			<li>旋转羊膜囊，找到无血管区域进行穿刺。</li>
			<li>将针头垂直于子宫壁，依次穿刺子宫、卵黄囊，然后进入羊膜囊。注意避免刺穿任何胎儿组织。确保针头穿过肢体之间的间隙，以确认针头已进入羊膜囊，随后进行注射。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>踩下脚踏板，注入所需体积的材料（通常为 10 - 20 µL）。 
	注意：由于操作者必须始终通过显微镜观察针尖位置，因此需要另一人读取针管上的刻度以量化注射量，并告知操作者剩余需注射的体积。注射前操作者与助手之间的沟通非常重要，可避免产生混淆和延误。这一点在静脉注射时尤为关键，因为若拔针延迟，会导致静脉血液反流进入针管，从而造成给药剂量不准确。</li>
	<li>在注射器推注至所需体积后，将针头从注射部位退出。由于静脉注射时穿刺部位可能会有少量出血，可用针头侧缘按压穿刺点10至15秒以止血。</li>
	<li>继续下一个胎鼠，直至右侧子宫角的所有胎鼠均完成注射。</li>
	<li>将左侧子宫角从腹腔中取出，并将右侧子宫角放回腹膜腔内。 
	注意：有时需要重新向针头中填充注射液。</li>
	<li>所有胚胎注射完成后，将子宫放回腹腔（图3E）。务必避免子宫或肠扭转。</li>
	<li>使用一次性移液管，向腹腔内加入约 2 mL 的 1x PBS，以补充任何非显性体液丢失。</li>
	<li>使用4-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线将筋膜和腹壁连续缝合为一层，以避免在关闭过程中损伤下方器官图&#160;3F - 3G).</li>
	<li>取下胶带，将小鼠转移到热灯下的笼子中。注意不要将热灯放置得离小鼠太近。确保笼内有垫料、食物和水。 
	注意：也可使用温控加热舱。当小鼠呈直立并行走状态时，表明其处于清醒状态。</li>
	<li>每天观察小鼠，并根据需要给予镇痛药物。 
	注意：我们通常在术后第1天和第2天给予美洛昔康，如果小鼠出现疼痛症状，有时也在第3天给药。</li>
	<li>若使用相同的注射材料进行批量手术，需用无菌 PBS 清洗注射针头。若更换不同注射材料，则应将针头弃置于锐器容器中，并更换新针头。 
	注意：我们建议在出生后立即将仔鼠寄养给代孕母鼠，以防原母鼠对注射物产生免疫反应，并将抗体传递给仔鼠 通过 母乳</li>
</ol>

<ol><li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+stem+cell+and+gene+therapy%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li>
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<li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li>
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<li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li>
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<li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li>
<li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid%2C+Robust%2C+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21307829">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).</li>
<li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

子宫内移植是治疗许多在妊娠早期即可诊断的先天性疾病的潜在疗法。小鼠的子宫内移植模型可让研究人员探索胎儿环境，或尝试不同的治疗方法。根据注射物质及靶向部位的不同，经静脉或经羊膜腔的子宫内移植可将注射物可靠地递送至目标区域。
在靶向特定器官时，选择合适的胚胎发育时期以及注射技术至关重要。虽然在E14时期进行静脉注射最适合靶向造血微环境，而在E16时期进行羊膜腔内注射最适合肺部靶向，但这些并非唯一可选方案。例如，在超声引导下，早在E8时期即可对胚胎进行羊膜腔内注射8。在E9至E10时期，通过超声引导的心内注射也可实现E14之前的系统性递送11。在胚胎发育的不同阶段实施注射的可行性，为研究基因转移和细胞移植的安全性与效率，以及探讨发育生物学中的基础科学问题，提供了广阔的研究潜力。
此外，除了静脉内和羊膜腔内给药途径外，还可根据治疗目的或所研究的科学问题选择其他靶向部位。在体 肌内注射方法...

产前筛查与诊断技术的最新进展揭示了在产前治疗多种先天性疾病的可能性，这些疾病在出生后缺乏有效的治疗手段，并会导致显著的发病率和死亡率。具体而言，in utero 造血干细胞移植（IUHCT）以及基因治疗/基因组编辑技术可利用胎儿正常的发育特性，比出生后的造血干细胞移植和基因治疗/基因组编辑更高效地治疗先天性血液、免疫及遗传性疾病1,2。具体来说，由于胎儿体积较小，可按受体体重最大化供体细胞或病毒载体的剂量。此外，胎儿免疫系统尚未成熟，使得供体造血干细胞可在无需清髓性和免疫抑制性预处理的条件下进行移植，而这类预处理在出生后移植方案中是必需的。同样，携带治疗性转基因或基因组编辑工具的病毒载体也可在无显著免疫反应的情况下注射，从而避免对转基因产物或病毒载体本身产生限制性免疫应答。最后，胎儿干细胞/祖细胞易于接近且具有高度增殖能力，使得靶向祖细胞的转导效率更高，并有利于某些依赖细胞周期的基因组编辑方式（如同源定向修复）高效进行。小鼠模型作为一种深入且经济的研究手段，可在开展临床前大动物模型实验之前，用于解答干细胞生物学与免疫学中的关键问题，因此一直是研究 IUHCT 和 in utero 基因治疗的主要模型系统1,2,3。
尽管有许多变量在IUHCT的成功中起着重要作用， 在子宫内 基因治疗/基因组编辑在小鼠和大型动物模型中的一个关键变量是造血干细胞（HSCs）或病毒载体的递送方法。已有研究表明，在宫内造血干细胞移植（IUHCT）时，由于胎儿肝脏作为当时的造血器官存在首过效应，大剂量供体HSCs的递送对于在小鼠和大型动物模型中实现宏观嵌合水平的植入具有重要作用。4,5。这是通过以下方式实现的 通过 供体细胞注射 通过 小鼠模型中的卵黄静脉 通过 在犬类模型中进行心内注射。注射途径在发育过程中靶向不同器官的前体细胞方面也起着根本性作用。例如，静脉注射 通过 卵黄静脉在妊娠晚期注射后已被证明能有效转导心肌细胞和肝细胞6,7或者，通过羊膜内注射病毒载体，可根据注射时胚胎折叠/发育情况，靶向物理暴露的器官8这一点在靶向呼吸道上皮方面表现得尤为明显 通过 妊娠晚期进行羊膜腔内注射，以利用正常的胎儿发育状态 &#34;呼吸&#34; 运动，使呼吸道暴露于羊水中的病毒载体9. 这两种IUT模式，静脉内 通过 卵黄静脉和羊膜腔内注射已作为我们实验室多项既往及在研实验的基础。本方案中，我们详细描述了在小鼠模型中进行静脉内及羊膜腔内宫内移植（IUT）的方法。

<table><tbody><tr><td>手套</td><td>Cardinal Health</td><td>2D73DP65</td><td></td></tr><tr><td>带齿Adson镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>无齿Adson镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>粗剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-13</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2.0</td><td>Ethicon</td><td>JB945</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Medline</td><td>GSI135010</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Major LubriFresh</td><td>0904-6488</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>K&amp;H</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Narishige</td><td>HI01PK01</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Kimble</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>垂直微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>微电极斜面研磨仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>IM-300 气动微量注射器</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305935</td><td></td></tr><tr><td>滤器</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>Compac5 麻醉机</td><td>VetEquip Compac5</td><td>901812&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>N2 气体</td><td>Airgas</td><td>NI 125</td><td></td></tr><tr><td>O2 气体</td><td>Airgas</td><td>OX 125</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP 病毒载体</td><td>Penn Vector Core</td><td>H5'.040.CMV.eGFP</td><td></td></tr></tbody></table>

静脉内和羊膜腔内 子宫内 小鼠模型中的移植

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

在子宫内 宫内移植（IUT）是一种独特且多用途的治疗方法，可用于在妊娠早期引入干细胞、病毒载体或任何其他物质。IUT用于治疗的理论基础在于胎儿体积小、免疫系统尚未成熟、胎儿干细胞或前体细胞具有可及性和增殖能力，以及在出生前治疗疾病或阻止症状出现的潜力。利用胎儿这些正常的发育特性，可实现造血干细胞（HSC）的递送 通过 宫内造血干细胞移植（IUT）有望治疗镰状细胞病等先天性血液系统疾病，且无需出生后造血干细胞移植所必需的清髓性或免疫抑制性预处理。类似地，由于发育过程中多个器官中前体细胞易于接近，宫内移植病毒载体进行基因治疗或基因组编辑时，可能更高效地靶向干细胞/前体细胞。此外，IUT还可用于研究包括免疫耐受形成在内的正常发育过程。小鼠模型为理解IUT的潜力与局限性提供了经济且有效的手段，有助于在开展大型动物临床前研究及最终临床应用之前积累必要知识。本文描述了一种通过静脉和羊膜内途径在小鼠胎儿中实施宫内移植的实验方案。该方案已成功用于阐明相关必要条件及作用机制 在子宫内 造血干细胞移植，耐受诱导，以及 在子宫内 基因治疗

存活与植入是评估宫内造血干细胞移植（IUHCT）实验成功与否的重要指标。根据实验具体终点的不同，接受 IUHCT 的胎儿可通过剖宫产进行产前分析，或在出生后进行分析。静脉注射后的平均存活率范围为 75 - 100%。羊膜内注射的存活率通常优于静脉注射，约为 85 - 100%。
在我们的实验室中，掌握这些技术的培训过程大约需要8至12个月。为了评估培训人员是否已获得可重复执行此类注射所需的技术能力，我们通过在宫内移植（IUT）后较短时间点监测胎儿存活率和供体细胞植入情况来对其进行考核。以下质量控制实验即展示了该评估方法。具体而言，1 × 10⁶7 从C57BL/6TgN(act-EGFP)OsbY01（“B6 GFP”）小鼠中按先前所述方法分离全骨髓细胞5 并进行注射 通过 将细胞注射至妊娠第14天的Balb/c胎鼠的卵黄静脉中。其中一组由经验丰富的指导教师进行宫内...

我们描述了一种用于执行的实验方案 在子宫内 通过静脉和羊膜内注射途径在小鼠模型中进行宫内移植（IUT）。该方案可用于将细胞、病毒载体及其他物质导入具有独特免疫耐受性的胎儿环境中。

宫内移植（IUT）是一种独特且用途广泛的治疗方法，可用于引入干细胞、病毒载体或任何其他物质……

该方法有助于解答胚胎学、基因治疗和干细胞移植领域中的关键问题。该技术的一个优势在于能够分析不同实验疗法对小鼠胎儿的影响。本实验操作将由本实验室的医生 Nicholas Ahn 和 Barbara Coons（医师及研究学者）进行示范。开始操作前，将无菌 PBS 液滴 5 至 10 微升吸入并推出手术针尖，重复两到三次，以清除可能存在的任何碎屑。接着，用所需实验体积和浓度的目标试剂充满针头。然后，在微量注射器上按压模式按钮三次，进入注射校准界面。通过增加 10 或 100 毫秒的时间间隔来调整注射时间，然后再次按下模式按钮两次。按下平衡按钮并踩下脚踏板一次。随后再次踩下脚踏板，评估每次踩压时从针头排出的溶液体积。当微量注射器校准至适当的实验体积后，将针头填充至适合注射的液位。所有针头清洗完毕后，确认怀孕的2至6月龄雌性小鼠对脚趾夹捏无反应。剃除腹部毛发，注意避免损伤乳头，并将动物以仰卧位转移至加热垫上。将药膏涂抹于动物眼部，并用胶带将其四肢固定在加热垫上。对暴露的皮肤进行消毒。随后皮下注射局部麻醉剂，例如 100 µL 的 0.25%布比卡因。接着，做一个1至2厘米长的皮肤切口，切口下缘距离阴道口不得小于1厘米，辨认筋膜中线，注意避免损伤周围的腹壁上血管。使用Adson镊轻轻夹住筋膜，注意不要夹到下方的器官或胎儿，然后用剪刀切开组织。安全进入腹腔后，将筋膜切口延长至与皮肤切口等长，用棉签将肠管移至腹部上方，以暴露妊娠子宫。小心地通过切口取出子宫，辨认左右两侧卵巢，以确保所有胎鼠均被计数。将左侧子宫放回腹腔内，仅暴露右侧子宫，以保持未注射侧胎鼠的温度。然后用非优势手的拇指和食指轻轻夹住最外侧的羊膜囊。将解剖显微镜置于动物上方，根据需要调整焦距和照明，以更清晰地观察胚胎。进行静脉注射时，旋转子宫，使待注射的卵黄静脉与针尖平行，并将针头以五度角放置于子宫上，以刺穿子宫壁。将针尖置于子宫壁与羊膜囊之间，直接对准卵黄静脉，并以接近切线的角度轻轻滑动针头，沿静脉表面推进，直至针尖斜面进入血管内。必须保持较低的角度，以确保针头不会穿透血管后壁。当在针尖处观察到血点时，按压脚踏板，将目标物质的全部体积注入血管内。进行羊膜内注射时，旋转羊膜囊直至找到无血管区域。将针头垂直于子宫壁，小心刺穿子宫、卵黄囊和羊膜囊，注意避免刺入任何胎儿组织。随后注入所需体积的物质。完成所需体积的注射后，将针头从注射部位抽出。接着对下一个胎鼠进行操作，直至右侧子宫角的所有胎鼠均完成注射。然后将右侧子宫角放回腹腔内。将左侧子宫角完全移出腹腔。当左侧子宫角内的所有胚胎注射完毕后，将整个子宫放回腹腔，注意避免发生子宫或肠管扭转。使用一次性移液管向腹腔内加入约2毫升无菌PBS，以补充任何不显性液体丢失。使用4-0聚乳酸羟基乙酸共聚物910缝线连续缝合筋膜和腹壁一层。然后将小鼠转移至洁净笼中，在加热灯下密切监测

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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静脉内和羊膜腔内子宫内小鼠模型中的移植

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