用线 Myography 测定小鼠肠系膜动脉的等轴收缩力
August 20th, 2018
采用线 myograph 技术对血管平滑肌功能和筛查新药进行了研究。我们报告一个详细的协议, 以测量的等距收缩性的小鼠肠系膜动脉和筛选新的松弛剂血管平滑肌。
多年来，我们的实验室一直在使用 wire myograph 方法测量血管平滑肌收缩力。我们使用这种技术来研究平滑肌收缩的机制。我们使用这种方法来探索高血压治疗的新药。
这种技术的主要优点是血管段在安装后至少存活 4 小时，并多次保持高钾诱导的收缩力。多通道系统为新药的高治疗筛选提供了机会。将安乐死小鼠的身体固定，腹部朝上，并用 70% 乙醇润湿腹部。
然后，用剪刀从腹股沟沿腹侧中线切开皮肤后，从第一个切口的起点开始，沿着每条腿切开。将两侧的皮肤向后拉，然后做类似的切口以打开腹膜。接下来，用剪刀剪开食道、结肠和其他结缔组织，以完全隔离胃肠道和体内的摄食脉管系统。
用 HEPES-Tyrode 或 HT 溶液冲洗胃肠道中的血液后，将分离的片段转移到涂层培养皿中，在室温下进行肠系膜动脉解剖。按顺时针方向抚平胃、空肠、回肠和盲肠，并将胃和盲肠分别固定在左侧和右侧。打开立体显微镜的透射光源，用针固定肠道，露出解剖的肠系膜动脉。
然后用镊子夹住动脉周围的脂肪组织，并用解剖剪刀剪掉所有结缔组织，小心地隔离动脉。用镊子抓住多余的动脉，将肠系膜动脉树转移并浸入冷的无钙离子 HT 溶液中。切掉肠系膜拱廊肠壁近端的 1.4 毫米动脉部分，然后用两个镊子小心地打开该动脉段的两侧。
准备两段 2.5 厘米长的不锈钢丝，放入同一个培养皿中。使用镊子轻轻夹住动脉的一端。然后用另一把镊子小心地将两根电线一根一根地插入动脉腔。
确保电线保持笔直，不要接触内皮。使用两个镊子，同时夹住螺纹容器外的两根电线，并小心地将容器从培养皿转移到充满 HT 溶液的肌电记录仪室中。将腔室的钳口拧开，为安装腾出空间，然后用两把镊子抓住两根插入的电线之一的两侧，并将容器放入钳口间隙中。
将夹住的线的两侧缠绕在连接到千分尺的钳口的螺钉上。顺时针旋转固定左侧螺丝。然后用镊子拉直电线。
接下来，顺时针旋转固定右侧螺钉。确保血管始终位于钳口间隙内，但不要触摸钳口，以免损坏。用千分尺合上两个钳口。
确保两个钳口足够近，但它们不会相互接触，并且未固定的电线位于固定电线的顶部。使用右侧镊子，小心地折叠连接到力传感器的钳口角处拧下的金属丝，并将其顺时针缠绕在右侧螺钉上。然后，固定螺丝。
重复电线左侧的展开和缠绕，并固定左侧的螺丝。接下来，小心旋转千分尺，在不拉伸容器的情况下将钳口稍微分开，使两个钳口之间的间隙刚好容纳两根电线。然后用镊子将千分尺侧的导线移动到传感器侧的导线水平面。
在其他腔室中安装动脉后，将所有腔室连接到设备并覆盖腔室。连接 100% 氧气供应和温度探头，然后开始加热至 37 摄氏度。打开图表软件。
按 Start 开始' 按钮开始录制。从 DMT 菜单中选择感兴趣的通道，以打开相应通道的 DMT 标准化窗口。在窗口中输入以下常量值：组织端点 a1， 0.1;组织终点 a2、4;线径，40。
然后，该窗口将计算出的容器长度显示为 1.40 毫米。读取相应组织室的千分尺。在千分尺读数框中输入值，然后单击 Add Point'按钮。
该值是 X 的初始值，延迟 60 秒后，窗口显示与此千分尺值对应的力和有效压力。同时，千分尺读数框变为活动状态。通过逆时针方向转动千分尺来拉伸被归一化的容器。
在千分尺读数框中输入千分尺值，然后单击 Add Point（添加点）按钮。再次等待 60 秒的延迟时间。继续拉伸容器并添加千分尺值，直到窗口显示千分尺 X-one 的值，这是将容器拉伸到 IC-one 所需的计算千分尺设置。
将千分尺设置为 X-1 值。均一化后，平衡腔室中的容器 15 至 20 分钟。平衡后，用 5 毫升高钾溶液代替 H-T 溶液，用高钾溶液攻击血管，诱导收缩 10 分钟。
在新鲜的高钾溶液中重复孵育 10 分钟后，用 5 毫升 H-T 溶液洗涤 3 至 4 次。再次用 5 毫升高钾溶液攻击血管以诱导收缩。5 分钟后，将 0.5 μL Neoliensinine 储备液加入腔室中，以使容器以 1 微摩尔 Neoliensinine 的终浓度松弛。
当力在几分钟后稳定时，再加入 0.5 微升 Neoliensinine 原液，将浓度增加到 2 微摩尔。每次加入 1 微升储备溶液，将浓度增加到 4、6、8 和 10 微摩尔，以生成剂量反应曲线。在正常化过程中，将血管拉伸数次，直到达到 IC-100 的值，每个拉伸周期包括 60 秒内的强烈收缩、快速松弛和力维持。
高钾溶液诱导的血管平滑肌收缩通常表现为两个阶段，一个强劲期和一个持续期。我们描述了一种使用多线肌电图系统测量小鼠肠系膜动脉等长收缩力的方法。该方法可用于评估血管平滑肌的功能和筛选平滑肌松弛剂。
这种方法与其他方法的主要区别在于安装步骤。这里使用的步骤很容易执行，不会损坏组织或设备。在此程序之后，也可以使用其他刺激剂（如 EP 和血管紧张素 II）来刺激平滑肌收缩，以找到一些对这种激动剂敏感的新型药物。
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概述
电线肌肉图技术用于评估血管平滑肌收缩性并筛选潜在的治疗药物。该方法允许研究平滑肌收缩机制和评估高血压的新药物。
关键研究组成部分
科学领域
- 血管生理学
- 药理学
- 平滑肌生物学
背景
- 电线肌肉图方法已经被使用多年来测量血管平滑肌的收缩性。
- 这种技术能够研究平滑肌收缩机制。
- 它特别适用于探索针对治疗高血压的新药物。
- 安装后，血管段在几个小时内保持活力，保持收缩性。
研究目的
- 提供测量小鼠肠系膜动脉等长收缩性的详细协议。
- 筛选血管平滑肌的新放松剂。
- 增进对药物开发背景下平滑肌功能的理解。
使用的方法
- 电线肌肉图技术用于测量收缩性。
- 高钾诱导的收缩性评估。
- 多通道系统用于药物筛选。
- 小鼠肠系膜动脉段的制备。
主要结果
- 电线肌肉图能够使血管段长时间保持活力。
- 高钾有效地诱导平滑肌的收缩性。
- 多通道系统便于同时筛选多种药物。
- 可以识别出潜在的治疗用途的新放松剂。
结论
- 电线肌肉图是研究血管平滑肌功能的有价值工具。
- 该方法支持识别高血压的新治疗药物。
- 未来的研究可以在这个协议的基础上进一步探索平滑肌药理学。
常见问题
Executive Industry Relevance
The wire myograph technique enables precise measurement of vascular smooth muscle contractility, supporting target validation and mechanistic de-risking in hypertension drug discovery. By providing quantitative, reproducible force measurements in disease-relevant mouse mesenteric arteries, the method enhances predictive confidence for screening novel relaxants and assessing therapeutic potential early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring isometric contraction in response to GPCR agonists, inhibitors, and depolarizing agents.
- Operational Value: Enables functional validation of vascular targets through dose-response analysis of compounds like neoliensinine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (force tension) for assessing compound potency and efficacy.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility via normalization procedures and multi-channel capability for parallel compound testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant mouse mesenteric artery to model human vascular pathophysiology and assess translational biomarker alignment.
- Operational Value: Maintains vessel viability for ≥4 hours, enabling time-consuming screening campaigns and repeated contractility challenges.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing contractility data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating vascular smooth muscle responses to specific stimuli like high-K+ solution.
- Screening: Enables reliable compound evaluation through cumulative dosing and stable sustained phase measurements.
- Analytics: Delivers quantitative force readouts that allow comparison of drug effects across concentrations and conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by using genetically tractable mouse models of vascular disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular function across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement and reduces mechanistic ambiguity in smooth muscle pharmacology.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via wire mounting and normalization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in hypertension programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent relaxant effects in vascular tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular dissection, wire myograph operation, and solution preparation.
- Dependent on myograph chambers, force transducers, micrometers, and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates cross-team standardization of dissection, mounting, and normalization procedures for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different vessel sizes or species.
- Limited by the need for isolated tissue segments and the technical challenge of wire insertion without endothelial damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Mouse Mesenteric Artery Dissection
2:26
Arterial Mounting
5:30
Normalization
7:03
Artery Contraction Recording
8:18
Results: Representative Tracings Showing the Normalization Procedure, Potentiation by High-K+ Solution, and Contraction
8:47
Conclusion
