人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

利用诱导多能干细胞（IPS细胞）生成的心肌细胞正越来越多地用于回答心脏电生理学领域的各种生物学问题。该技术的主要优势在于，可通过心室特异性启动子元件，实现心室样心肌细胞中亚型特异性的动作电位记录，从而显著提高实验通量。通过慢病毒转导引入基因编码的电压传感器，可实现对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞动作电位的光学成像。

首先将含有慢病毒的细胞培养上清液与心肌细胞维持培养基按1:1比例混合。加入六亚甲基溴化铵，使其终浓度为8微克/毫升，以提高感染效率。随后用心肌细胞感染培养基替换诱导多能干细胞来源的心肌细胞培养皿中的维持培养基。

将感染的心肌细胞在37摄氏度下培养12小时，然后用新鲜的心肌细胞维持培养基替换感染培养基。成像前，将细胞培养基更换为添加了钙的台罗德溶液。随后将心肌细胞置于倒置落射荧光显微镜载物台上的成像腔室中，该显微镜配备有图像分光器。

如果需要电刺激起搏，请在成像室中安装起搏电极，并将电极连接至刺激发生器。调节细胞至清晰对焦，找到视野中心表达基因编码电压指示剂的细胞。设置光路，使发射光导入图像分光器，并将显微镜中的滤光立方体切换为与图像分光器中的滤光片组合匹配的型号。

在控制相机的软件中，设置采集参数以实现高速成像，并根据制造商的说明安装图像分光器。代表两个不同发射波长范围的两幅图像应彼此相邻，各占据图像的一半区域。根据需要检查并调整相机所成图像的焦点。

调节照明光源的亮度，避免像素饱和。设置时间序列图像的采集程序，并调暗室内光线，以防止杂散光对测量造成干扰。随后打开激发光源快门，开始图像序列的采集，并根据实验需要在适当的时间点启动电刺激 pacing。

当采集完成后，根据需要关闭激发光源快门，并将记录保存至硬盘。随后，在保持记录设置不变的情况下，在盖玻片无细胞区域采集背景信号。对于光学膜电位记录的分析，在 ImageJ 中打开包含细胞的 tiff 图像序列，使用手绘选择工具在红色通道中围绕一个荧光心肌细胞绘制感兴趣区域，注意确保该区域足够大，以免细胞收缩时移出该区域。

接下来，选择“分析”、“工具”、“区域管理器”，然后选择“添加 T”，将该区域添加为“区域 1”。将感兴趣区域拖动至绿色通道的同一细胞上，并将此区域添加为“区域 2”。在“分析”和“设置测量”菜单下，取消选中所有选项，仅保留“平均灰度值”选中状态。

在“感兴趣区域管理器”中，单击“更多”和“多测量”，选择“测量所有切片”和“每个切片对应一行”选项，然后单击“确定”。此时将打开一个包含电子表格的窗口，其中含有三行数据。通过“文件”菜单中的“另存为”功能，将该电子表格保存为逗号分隔值文件。关闭图像堆栈窗口和电子表格窗口，但不要关闭“感兴趣区域管理器”窗口，然后打开包含背景测量值的 tiff 堆栈。

在“感兴趣区域管理器”中，单击“更多”和“多测量”，选择“测量所有切片”和“每切片一行”选项，然后单击“确定”。接着将背景数据保存为一个独立的 csv 文件。此处展示了一个具有代表性的单个诱导多能干细胞（IPS）来源的心肌细胞，白色虚线标记了在成像分析过程中于 RFP 和 GFP 通道中划定的感兴趣区域。RFP 通道的信号显示，在每次动作电位期间，由于膜电位变化引起的强制或共振能量转移增强，荧光强度呈现周期性上升。

相应地，GFP 信号表现出荧光强度的周期性下降。RFP/GFP 比值是下游分析中使用的生物信号，例如动作电位持续时间 50 和 90 的测量。例如，使用该方法检测在 0.5 赫兹条件下培养的 30 天龄类心室诱导多能干细胞来源的心肌细胞，其平均动作电位持续时间 50 为 439 毫秒，平均动作电位持续时间 90 为 520 毫秒。

对诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行电刺激，每五个搏动逐渐增加刺激频率，结果显示随着搏动频率的升高，动作电位持续时间逐步缩短。此外，用非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素处理自发搏动的诱导多能干细胞来源的心肌细胞，可迅速提高其搏动频率，并且随着激动剂剂量的增加，搏动频率进一步升高。尽管该方法相较于传统的电生理学测量具有更高的通量优势，但需注意其局限性，包括时间分辨率受限于荧光电压传感器本身的固有动力学特性。