Name: 人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学习利用慢病毒转导和基因编码电压传感器在人诱导多能干细胞来源的心室心肌细胞中进行光学动作电位记录的方法。该技术可显著提高心脏电生理研究的通量并实现亚型特异性记录。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了德国研究基金会（Si 1747/1-1）、Else Kröner-Fresenius基金会和德国心脏研究基金会的资助。

1. 用于成像的iPSC来源心肌细胞的制备
注意：iPSC 培养和心肌细胞分化的方法此前已有发表12,13,14，此处不再详细讨论。建议根据所使用的分化方案，通过手工显微解剖、磁性细胞分选或乳酸筛选法对 iPSC-CMs 进行纯化。在以下实验方案中，采用单层分化法13生成的搏动区域的手工显微解剖外植体，在心脏分化第15天获取，并在纤连蛋白包被的培养板上继续培养至第30天，具体操作如前所述10。
<ol>
	<li>从培养箱中取出细胞培养板，使用200 µL移液器手动将心脏外植体收集至微量离心管中。沉降后，吸除细胞培养上清液，并用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）轻柔洗涤外植体2次。</li>
	<li>加入II型胶原酶（430 U/mL，溶于HBSS）以解离iPSC-CMs，并在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>待剩余的大细胞团块沉降后，收集含有解离单个iPSC-CMs的上清液，并将其加入新鲜的心肌细胞维持培养基中，该培养基含有高浓度胎牛血清（FBS）（DMEM-F12，20% FBS，2 mM L-谷氨酰胺，1:100 MEM非必需氨基酸，100 U/mL青霉素-链霉素，以及0.1 mM β-巯基乙醇）。</li>
	<li>若仍有大细胞团块存在，则重复解离步骤。通过离心收集单个iPSC-CMs，并将其重悬于含低浓度FBS（2% FBS）的心肌细胞培养基中。</li>
	<li>将单个iPSC-CMs重新接种至经纤连蛋白（2 µg/cm2）包被的3.5 cm玻璃底细胞培养小皿中，接种密度应足以支持后续对单个细胞的成像。在开展高通量实验前需优化接种密度。通常每3.5 cm培养皿接种5–10个心脏外植体即可；但具体数量很大程度上取决于外植体的大小和纯度。</li>
	<li>解离后的单个iPSC-CMs需在含2% FBS的心肌细胞维持培养基中继续培养至少48小时，以确保充分恢复。 
	注意：在接下来的步骤中，将使用慢病毒转导iPSC-CMs，该慢病毒携带由MLC2v增强子调控的GEVI VSFP-CR基因10，以实现心室特异性的GEVI表达。也可选用其他慢病毒载体，例如可在结状或心房样细胞中特异性表达GEVI的构建体，或携带普遍表达的PGK启动子的非特异性构建体10。慢病毒质粒可应要求提供。 
	警告：操作慢病毒颗粒时，必须确保工作环境具备相应的生物安全等级，遵守处理潜在感染性物质的安全规程，并采取必要的安全防护措施。</li>
	<li>将之前在HEK293细胞中产生的含慢病毒10的细胞培养上清液（制备方法见文献15）与心肌细胞维持培养基（见步骤1.3）按1:1比例混合，配制感染培养基。</li>
	<li>加入六甲基溴化铵（hexadimethrine bromide），使其终浓度为8 µg/mL，以提高感染效率。 
	注意：由于iPSC-CMs对慢病毒具有较高的感染效率，通常无需通过超速离心浓缩病毒。</li>
	<li>吸除单个iPSC-CMs上的心肌细胞维持培养基，替换为步骤1.7和1.8中配制的感染培养基。将感染后的单个iPSC-CMs在37 °C下继续培养12小时，随后吸除培养基并再次更换为心肌细胞维持培养基。 
	注意：感染后约48小时可观察到GEVI的荧光信号。建议在感染后至少72小时再进行膜电位记录的成像，以确保获得足够的信号强度。单个感染的iPSC-CMs可培养至少3周，并进行连续成像。若成像过程中发生严重光漂白，荧光信号会随时间逐渐恢复。</li>
	<li>成像前，将细胞培养基更换为添加Ca2+的Tyrode’s溶液（135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1 mM MgCl2，10 mM葡萄糖，1.8 mM CaCl2，10 mM HEPES；pH 7.35）。</li>
</ol>
2. 光学膜电位记录
<ol>
	<li>将含有iPSC-CMs的成像腔室置于倒置落射荧光显微镜的载物台上，显微镜需配备图像分光器、合适的滤光片组和相机（例如，一款能够在高灵敏度下实现高速成像的sCMOS相机） 
	注意：例如，在显微镜中使用480/40 nm带通激发滤光片与500 nm长通二向色镜组合，在图像分光器中使用568 nm长通二向色镜与520/28 nm和630/75 nm带通发射滤光片组合。对于单细胞成像，高倍率、高数值孔径的油浸物镜可提供最佳的信噪比。</li>
	<li>如果需要电刺激起搏，请将起搏电极安装在成像室中，并将其连接至刺激发生器。 
	注意：我们使用了一个包含两个铂电极的 pacing inset，该 inset 可嵌入 3.5 cm 玻璃底细胞培养皿中。成像区域为电极之间的细胞。典型的 pacing 参数为持续时间为 5 ms 的矩形脉冲，电场强度为 10 V/cm 电极间距。</li>
	<li>可选地，使用加热的显微镜载物台以确保成像过程中iPSC-CMs的温度稳定；若需进行长期成像，可使用配备孵育腔的显微镜系统。</li>
	<li>将细胞调至清晰对焦，并将表达GEVI的细胞置于视野中央。 
	注意：最方便的方法是使用显微镜的目镜，配合绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）滤光片组，以识别表达GEVI的细胞。</li>
	<li>设置光路，使发射光导向图像分光器。将显微镜中的滤光立方体切换为与图像分光器中的滤光片相匹配的型号（参见 材料表).</li>
	<li>在控制相机的软件中，设置采集参数，以实现高速成像（例如，每秒100帧，每帧曝光时间为10 ms）是可行的。 
	注：通常这涉及相机像素的合并（例如，将相机芯片的 8 x 8 个像素合并，生成延时电影中的一个像素。</li>
	<li>根据制造商的说明安装图像分光器。代表两个不同发射波长区间的两幅图像应彼此相邻，各占据图像的一半区域。 
	注意：此步骤仅需在每次成像会话开始时执行一次。</li>
	<li>检查并根据需要调整相机生成图像的焦距。</li>
	<li>调节照明光源的亮度，避免像素饱和；最简便的方法是使用一种特殊颜色来显示饱和像素的彩色调色板。 
	注意：在成像前的所有准备过程中，应将样品暴露于激发光的照射时间限制在必要范围内（即，避免长时间开启光源，以防GEVI发生光漂白。</li>
	<li>设置时间序列的采集（例如，每秒100帧，共5,000张图像，持续50秒）。调暗房间内的光线（包括计算机显示器），以避免杂散光影响测量结果。如果激发光快门未由成像软件控制，则需在开始采集前手动打开快门。</li>
	<li>开始采集图像序列。如果需要电刺激起搏，请在适当的时间点启动起搏程序，除非该程序由成像软件自动触发。如果需要应用药理学试剂，则可手动进行（例如通过移液将100 µL终浓度为十倍的试剂加入含有900 µL缓冲液的记录室中，并用移液器轻轻混匀，或使用持续灌流系统进行。</li>
	<li>当采集结束后，如有必要，关闭激发光源快门。将记录保存至硬盘。</li>
	<li>保持记录设置（即保持曝光时间、帧率和光强不变，在无细胞区域的盖玻片上或未接种细胞的另一张盖玻片上记录背景荧光（同步骤2.11）。 
	注意：如果在不更改采集设置的情况下进行连续测量，则所有这些测量只需进行一次背景荧光记录。</li>
	<li>如有需要，可在同一盖玻片上的不同iPSC-CMs上进行额外实验（步骤2.4–2.13）。需注意，若已施加药物，盖玻片上的所有CM均会受到影响。</li>
</ol>
3. 分析
&#62;注意：根据所使用的成像软件（通常由相机或完整荧光成像系统的制造商提供的专有软件包），可能可以在该软件包内部分或完全地对获取的图像进行分析。然而，此处提供了一种可使用开源软件完成的图像分析工作流程。即，图像分析平台 ImageJ）16，可使用 Fiji 等发行版方便地安装17以及用于统计计算的 R 软件包18 如所述。简言之，在 ImageJ 中绘制代表细胞或背景的感兴趣区域（ROIs），并将这些 ROIs 随时间变化的平均荧光强度导出至文件，随后在 R 中或使用电子表格软件进行进一步分析。
<ol>
	<li>在成像软件中，将获取的图像时间序列（包含细胞的记录及其相应的背景记录）保存或导出为一种格式例如，TIF）格式，该格式可由ImageJ读取。或者，使用BioFormats插件（https://imagej.net/Bio-Formats），该插件提供了一系列程序，使ImageJ能够读取不同成像系统厂商的专有文件格式。 
	注意：以下步骤假设记录过程中的成像时间间隔是相同的。如果情况并非如此，则可能需要从成像软件中导出时间信息，并将其纳入后续分析中。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开包含细胞的 TIF 图像栈。</li>
	<li>使用套索选择工具在红色荧光通道中标记一个荧光心肌细胞作为感兴趣区域（ROI）。确保该感兴趣区域足够大，以防止细胞在收缩过程中移出该区域。</li>
	<li>打开 ROI 管理器插件（“分析 | 工具 | ROI 管理器）并按下 加入[t] 单击按钮以将此 ROI 添加为 ROI1。</li>
	<li>将ROI拖动到绿色通道中的同一细胞上，并将此ROI添加为ROI2。</li>
	<li>在 分析 | 设置测量参数 菜单，取消选择除以下选项外的所有选项 平均灰度值. 
	注意：此步骤在一次 ImageJ 会话中仅需执行一次。</li>
	<li>在 ROI 管理器中，按下 更多 | 多参数测量 按钮。选择 测量所有切片 和 每切片一行 选项并按下 好的一个窗口打开，其中包含一个电子表格，有三行数据（分别为切片编号、代表细胞的两个感兴趣区域在红色通道和绿色通道中的平均荧光强度）。</li>
	<li>使用 文件 | 另存为 将电子表格保存为逗号分隔值（CSV）文件。</li>
	<li>关闭图像堆栈窗口和电子表格窗口，但不要关闭 ROI 管理器窗口。打开包含背景测量值的 TIF 堆栈。</li>
	<li>在 ROI 管理器中，按下 更多 | 多参数检测' 按钮。选择 测量所有切片 和 每切片一行 选项并按下 好的.</li>
	<li>使用 文件 | 另存为 将包含背景数据的电子表格另存为另一个 CSV 文件。 
	注意：以下计算可使用电子表格软件完成。我们使用了 R 软件18一个简单的示例脚本，用于从“cell.csv”和“background.csv”文件中读取细胞和背景数据，执行计算，并绘制膜电位信号的时间过程曲线，已提供作为示例 补充代码文件 1.</li>
	<li>根据背景信号的记录，分别计算红色通道和绿色通道的平均强度。将红色和绿色通道中代表细胞的信号减去相应的背景信号，以计算经背景校正后的RFP和GFP信号。</li>
	<li>作为膜电位的替代指标，计算 RFP/GFP 比值。 
	注意：该比值为无量纲。或者，可将其归一化为其初始值（即, ΔR/R0）。重要的是，有用的信息包含在该比值的时间变化中，而非其绝对值。由于GFP和RFP的光漂白不均，该比值可能出现基线漂移。如有必要，可通过构建基线曲线并从RFP/GFP比值中减去该曲线来校正此类基线漂移。10.</li>
</ol>

<ol><li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li>
<li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).</li>
<li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li>
<li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells%3A+A+state-of-art%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li>
<li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2865973/">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org">http://www.R-project.org</a> (2008).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464(2017).</li>
<li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述方法可实现对特定亚型动作电位的光学记录（即，心室样细胞）由人iPSCs生成的心肌细胞。人iPSC-CMs是一种新兴工具，可用于解决多种生物学和医学问题，而向不同心肌细胞亚型的分化是实验变异的重要来源。通过使用特异性启动子元件，可在代表目标亚型的心肌细胞中特异性表达GEVI，随后进行光学成像。
成功获取单个iPSC-CM的动作电位（AP）取决于解离后的重铺板密度。若细胞铺板过密，则难以找到未参与电耦合合胞体的孤立单细胞，耗时较长。然而，过低的铺板密度会负面影响细胞存活率。因此，建议系统性地测试不同铺板密度，尤其是在开展依赖高通量成像的实验之前。
在图像采集过程中，VSFP 会发生光漂白，这可能会对信噪比产生不利影响，尤其是在较长时间的实验中。如果实验过程中出现快速光漂白，请确保激发光源的快门仅在图像采集期间或必要的准备步骤（如寻找并聚焦表达 VSFP 的细胞）期间打开，且这些操作应尽可能快速完成。此外，应将激发光的强度降低至满足需求的最低水平，并充分利用用于图像采集的高灵敏度相机的动态范围。
<...

由诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来的心肌细胞（CMs）正成为解析心脏病分子机制、研究新型疗法以及筛选药物心脏不良反应的重要工具1,2,3。自研究初期起，致心律失常性疾病（如离子通道病）便一直是该领域的重要研究重点4。因此，用于研究CMs电生理表型（如心律失常或动作电位（AP）形态改变）的方法，构成了该技术的核心内容。
在应用iPSC-CMs时，一个重要的考虑因素是目前的心肌分化方案无法获得均一的细胞群体，而是产生由不同成熟程度的、类似于窦房结、心房和心室CMs的细胞混合物5,6,7,8这种异质性可能是实验变异的一个重要来源，特别是当研究动作电位时程（APD）等参数时，这些参数在心肌细胞亚型之间本就存在内在差异。例如，心房CMs的APD比心室CMs短）。解决这一问题的传统方法是采用膜片钳技术对单个iPSC-CMs进行研究，并根据其动作电位形态将每个细胞分类为类似结状、心房状或心室状9随后的分析可仅限于代表目标CM亚型的细胞。该策略的主要缺点是通量有限且难以扩展。此外，膜片钳电生理技术具有侵入性，无法对同一细胞进行长时间的连续成像。
本文提供了我们开发的一种光学成像方法的实验细节10，该方法可用于特异性地对iPSC-CM中特定亚型的动作电位（AP）进行成像。该方法克服了亚型异质性的问题，与传统方法相比显著提高了通量，从而能够快速对携带遗传变异或暴露于药理学试剂的iPSC-CM进行表型分析。
亚型特异性光学成像方法概述
一种基因编码的电压指示剂（GEVI），其荧光特性会随着细胞膜的去极化和复极化而发生变化，可用于光学成像心肌细胞（CMs）膜电位的动态变化。本研究中所使用的GEVI为电压感应荧光蛋白VSFP-CR11，包含一个电压感应跨膜结构域与一对绿色（Clover）和红色（mRuby2）荧光蛋白的融合体图1A由于两种荧光基团距离非常接近，绿色荧光蛋白的激发会导致部分激发能量转移至红色荧光蛋白 通过 荧光共振能量转移（FRET）。因此，绿色荧光蛋白的激发会导致绿色和红色荧光蛋白均产生发射信号。图1A，上图）。当细胞去极化时，电压感应结构域发生构象重排，导致两个荧光蛋白重新定向，从而提高FRET效率。因此，更多的激发能量从绿色荧光蛋白转移至红色荧光蛋白（图1A，下图）。因此，在去极化的细胞中，绿色荧光信号较弱，而红色荧光信号较静息膜电位状态下的细胞更强（图1B).
<img alt="FRET过程示意图，包含激发/发射及荧光发射光谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：利用VSFP-CR进行膜电位的光学成像。（A）示意图展示了电压敏感性荧光蛋白VSFP-CR的作用机制。当细胞膜去极化时，电压感应跨膜结构域的构象发生重排，导致绿色（GFP）和红色（RFP）荧光蛋白的相对取向改变，从而增强分子内 Förster 共振能量转移（FRET）的效率。（B）图中显示了在静息膜电位（上图）和去极化状态（下图）下，细胞中VSFP在GFP激发下的发射光谱。为清晰起见，去极化引起的光谱变化被夸大显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用配备图像分光器的荧光显微镜对反映膜电位波动的FRET效率变化进行成像，该分光器可将红色和绿色荧光发射分离，并投射到sCMOS相机芯片上的两个相邻区域（图2）。通过此装置，可同时记录两个不同波长范围的荧光发射信号，从而能够在时间序列的每一幅图像中计算红绿荧光比值，以反映膜电位的变化。
<img alt="显示二向色镜的荧光显微镜示意图；详细展示激发光/发射光路径。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：成像系统的配置。 图示为用于高时间分辨率下成像电压敏感荧光蛋白光谱变化（反映膜电位变化）的成像系统主要组成部分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过慢病毒转导实现VSFP-CR在心肌细胞（CMs）中的表达。为了使表达特异性地指向目标心肌细胞亚型，该慢病毒携带一个启动子元件（MLC2v增强子），可在类似心室的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）中特异性驱动转录10。当对包含类似心房、类似结状和类似心室细胞混合群体的iPSC-CMs进行该慢病毒感染时，VSFP-CR仅在类似心室的细胞中表达。由于光学动作电位成像依赖于这种荧光传感器，所记录的动作电位因此仅反映目标心肌细胞亚型的特性（图3）。
<img alt="心肌细胞光学动作电位记录；信号转导示意图；荧光成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过启动子驱动的VSFP表达实现亚型特异性的膜电位成像。 （a）该示意图展示了如何实现心肌细胞亚型特异性的光学动作电位记录。（b）显示了在心室特异性MLC2v增强子调控下感染VSFP的iPSC-CMs。仅在GFP通道中观察到类心室样心肌细胞表达电压传感器（左图）。同时提供了相差图像（中图）和叠加图像（右图）。白色虚线标示细胞边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>替代 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵（Polybrene）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>增强慢病毒感染效率</td></tr><tr><td>3.5 cm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>显微镜支架</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 相机</td><td>Andor Technology, Belfast, UK</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>显微镜滤光立方体：激发滤光片</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>ET480/40X</td><td>带通 480/40</td></tr><tr><td>显微镜滤光立方体：二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>T505lpxr</td><td>长通 505 nm</td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>&amp;nbsp;Cairn Research, Faversham, UK</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>图像分光器滤光立方体：二向色镜</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&amp;uuml;bigen, Germany</td><td>568LPXR</td><td>长通 568 nm</td></tr><tr><td>图像分光器滤光立方体：发射滤光片 1（GFP 发射）</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&amp;uuml;bigen, Germany</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>带通 520/28 nm</td></tr><tr><td>图像分光器滤光立方体：发射滤光片 2（RFP 发射）</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&amp;uuml;bigen, Germany</td><td>630/75 ET Bandpass</td><td>带通 630/75 nm</td></tr><tr><td>刺激用嵌件</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

由人诱导性多能干细胞（iPSC-CMs）生成的心肌细胞是心血管研究中一种新兴的工具。目前的分化方案所产生的iPSC-CMs并非均一的细胞群体，而是包含具有心室样、心房样和结节样表型的细胞混合物，这使得表型分析变得复杂。本文介绍了一种专门从心室样iPSC-CMs中光学记录动作电位的方法。该方法通过慢病毒转导实现，所用载体中基因编码的电压指示剂受控于心室特异性启动子元件。当iPSC-CMs被该载体转导后，电压传感器仅在心室样细胞中表达，从而能够利用时间序列荧光显微镜进行亚型特异性的膜电位光学记录。

在图4a中，显示了一个典型的单个iPSC-CM，白色虚线标出了在成像分析过程中于RFP（左侧）和GFP（右侧）通道中划定的兴趣区域（ROI）。RFP通道的信号显示，在每次动作电位期间荧光强度呈周期性升高（图4b，上图）。如引言部分所述，这是由于膜电位变化引起FRET增加所致（图1）。相应地，GFP信号显示出荧光强度的周期性降低（图4b，中图）。RFP/GFP比值（图4b，下图）是用于后续分析（如APD50和APD90测量）的生物学信号。采用该方法，对以0.5 Hz频率起搏的30天龄类心室样iPSC-CMs进行检测，结果显示其平均APD50（从动作电位起始至复极化完成50%的持续时间）为439 ms（± 46 ms...

本文介绍一种光学成像技术，用于特异性检测心室样诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中的动作电位。该方法基于启动子驱动的电压敏感型荧光蛋白表达。

由人诱导性多能干细胞（iPSC-CMs）生成的心肌细胞是心血管研究中一种新兴的工具。它们并非……

利用诱导多能干细胞（IPS细胞）生成的心肌细胞正越来越多地用于回答心脏电生理学领域的各种生物学问题。该技术的主要优势在于，可通过心室特异性启动子元件，实现心室样心肌细胞中亚型特异性的动作电位记录，从而显著提高实验通量。通过慢病毒转导引入基因编码的电压传感器，可实现对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞动作电位的光学成像。首先将含有慢病毒的细胞培养上清液与心肌细胞维持培养基按1:1比例混合。加入六亚甲基溴化铵，使其终浓度为8微克/毫升，以提高感染效率。随后用心肌细胞感染培养基替换诱导多能干细胞来源的心肌细胞培养皿中的维持培养基。将感染的心肌细胞在37摄氏度下培养12小时，然后用新鲜的心肌细胞维持培养基替换感染培养基。成像前，将细胞培养基更换为添加了钙的台罗德溶液。随后将心肌细胞置于倒置落射荧光显微镜载物台上的成像腔室中，该显微镜配备有图像分光器。如果需要电刺激起搏，请在成像室中安装起搏电极，并将电极连接至刺激发生器。调节细胞至清晰对焦，找到视野中心表达基因编码电压指示剂的细胞。设置光路，使发射光导入图像分光器，并将显微镜中的滤光立方体切换为与图像分光器中的滤光片组合匹配的型号。在控制相机的软件中，设置采集参数以实现高速成像，并根据制造商的说明安装图像分光器。代表两个不同发射波长范围的两幅图像应彼此相邻，各占据图像的一半区域。根据需要检查并调整相机所成图像的焦点。调节照明光源的亮度，避免像素饱和。设置时间序列图像的采集程序，并调暗室内光线，以防止杂散光对测量造成干扰。随后打开激发光源快门，开始图像序列的采集，并根据实验需要在适当的时间点启动电刺激 pacing。当采集完成后，根据需要关闭激发光源快门，并将记录保存至硬盘。随后，在保持记录设置不变的情况下，在盖玻片无细胞区域采集背景信号。对于光学膜电位记录的分析，在 ImageJ 中打开包含细胞的 tiff 图像序列，使用手绘选择工具在红色通道中围绕一个荧光心肌细胞绘制感兴趣区域，注意确保该区域足够大，以免细胞收缩时移出该区域。接下来，选择“分析”、“工具”、“区域管理器”，然后选择“添加 T”，将该区域添加为“区域 1”。将感兴趣区域拖动至绿色通道的同一细胞上，并将此区域添加为“区域 2”。在“分析”和“设置测量”菜单下，取消选中所有选项，仅保留“平均灰度值”选中状态。在“感兴趣区域管理器”中，单击“更多”和“多测量”，选择“测量所有切片”和“每个切片对应一行”选项，然后单击“确定”。此时将打开一个包含电子表格的窗口，其中含有三行数据。通过“文件”菜单中的“另存为”功能，将该电子表格保存为逗号分隔值文件。关闭图像堆栈窗口和电子表格窗口，但不要关闭“感兴趣区域管理器”窗口，然后打开包含背景测量值的 tiff 堆栈。在“感兴趣区域管理器”中，单击“更多”和“多测量”，选择“测量所有切片”和“每切片一行”选项，然后单击“确定”。接着将背景数据保存为一个独立的 csv 文件。此处展示了一个具有代表性的单个诱导多能干细胞（IPS）来源的心肌细胞，白色虚线标记了在成像分析过程中于 RFP 和 GFP 通道中划定的感兴趣区域。RFP 通道的信号显示，在每次动作电位期间，由于膜电位变化引起的强制或共振能量转移增强，荧光强度呈现周期性上升。相应地，GFP 信号表现出荧光强度的周期性下降。RFP/GFP 比值是下游分析中使用的生物信号，例如动作电位持续时间 50 和 90 的测量。例如，使用该方法检测在 0.5 赫兹条件下培养的 30 天龄类心室诱导多能干细胞来源的心肌细胞，其平均动作电位持续时间 50 为 439 毫秒，平均动作电位持续时间 90 为 520 毫秒。对诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行电刺激，每五个搏动逐渐增加刺激频率，结果显示随着搏动频率的升高，动作电位持续时间逐步缩短。此外，用非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素处理自发搏动的诱导多能干细胞来源的心肌细胞，可迅速提高其搏动频率，并且随着激动剂剂量的增加，搏动频率进一步升高。尽管该方法相较于传统的电生理学测量具有更高的通量优势，但需注意其局限性，包括时间分辨率受限于荧光电压传感器本身的固有动力学特性。

subtype-specific-optical-action-potential-recordings-human-induced

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

在此，我们描述了成年小鼠心室切片的制备方法及其在尖电极动作电位记录中的应用。这些多细胞制备物提供了结构完整的 体内 类似组织的结构，使其成为电生理学和药理学研究的有价值模型 体外.

用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外...

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

激光穿孔与微电极阵列（MEA）相结合，可实现对培养的原代心肌细胞及干细胞来源心肌细胞的动作电位样信号记录。相较于标准记录方法，该技术提供的波形形态可更深入揭示受试化合物的作用机制，将膜片钳与MEA检测结果相联系，有望进一步优化未来的心脏安全性研究。...

基于微电极阵列的激光诱导心肌细胞动作电位样检测以提高安全药理学预测性

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

学习利用慢病毒转导和基因编码电压传感器在人诱导多能干细胞来源的心室心肌细胞中进行光学动作电位记录的方法。该技术可显著提高心脏电生理研究的通量并实现亚型特异性记录。

人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

探索更多视频