人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录

由诱导多能干细胞或IPS细胞产生的心肌细胞越来越多地用于回答心脏电生理学领域的各种生物学问题。该技术的主要优点是，它允许在心室（如卵细胞）中，使用心室特异性启动子元素，实现吞吐量的大幅提高以及亚型特定动作电位记录。通过扁病毒转导引入基因编码电压传感器，可以光学成像人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞作用潜力。

首先将含有扁病毒的细胞培养物与心肌细胞维持介质混合，比例为一比一。以每毫升8微克的最终浓度加入六溴酰胺，以提高感染效率。用感染培养基代替IPS细胞衍生心肌细胞培养皿中的心肌细胞维持培养基。

培养受感染的心肌细胞在37摄氏度下12小时，用新鲜的心肌细胞维持介质取代感染介质。在成像之前，用Tyrode的溶液交换细胞培养基，并辅以钙。然后将心肌细胞放在带图像分离器的倒置荧光显微镜的舞台上的成像室中。

如果需要电起搏，请将起搏电极安装在成像室中，然后将电极连接到刺激发生器。将细胞聚焦，并在观察场中心找到表示基因编码电压指示器的单元。设置光路，以便发射光路由到图像分路器，并在显微镜中将滤光立方体切换到要与图像分路器中的滤光片组合的滤光片立方体。

在控制摄像机的软件中，设置采集设置，以便实现高速成像，并根据制造商的说明设置图像拆分器。表示两个不同发射波长波段的两个图像应相邻，每个图像占据图像的一半。根据需要检查和调整摄像机制作的图像的焦点。

并调整照明灯的亮度，以避免像素饱和。设置时间序列的采集，使室内光线变暗，以避免杂散光影响测量。然后打开激发光快门，开始采集图像系列，在适当的时间点开始电起搏，在实验上适当。

采集完成后，请视需要关闭激励灯快门，然后将录制保存到硬盘驱动器。然后，在保持录制设置不变的情况下，在没有单元格的盖玻片区域上记录背景。要分析光膜电位记录，请打开包含 ImageJ 中细胞的 tiff 堆栈，并使用自由选择工具在红色通道中荧光心肌细胞上绘制感兴趣的区域，注意该区域足够大，细胞在收缩时不会移出该区域。

接下来，选择"分析"、"工具、兴趣区域管理器"，然后选择"添加 T"，将该区域添加为"感兴趣区域"1。将感兴趣区域拖动到绿色通道中的同一单元格上，然后将此区域添加为"感兴趣区域"2。在"分析和设置测量"菜单下，取消选择除"均值灰色"值以外的所有选项。

在"感兴趣区域管理器"中，单击"更多"和"多度量"以选择"测量所有切片和每个切片一行"选项，然后单击"确定"。将打开一个窗口，其中包含包含三行的电子表格。使用"文件"和"保存"将电子表格保存到逗号分隔的值文件中。使用图像堆栈和电子表格窗口关闭窗口，而不关闭"兴趣区域管理器"窗口，然后打开包含背景测量的 tiff 堆栈。

在"感兴趣区域管理器"中，单击"更多和多度量值"以选择"测量所有切片和每个切片一行"选项，然后单击"确定"。然后将背景数据保存在单独的 csv 文件中。在这里，在RFP和GFP通道的成像分析过程中绘制的具有代表性的单IPS细胞衍生心肌细胞与标记感兴趣区域的白色虚线进行描绘。来自 RFP 通道的信号显示，由于膜电位变化导致的强迫或共振能量转移增加，每次动作电位期间荧光强度会周期性增加。

一致性地，GFP 信号显示荧光强度的周期性下降。RFP/GFP 比率是下游分析中使用的生物信号，例如作用电位持续时间 50 和 90 测量。例如，使用此方法，30 天大心室（如 IPS 细胞衍生心肌细胞）放置在 0.5 赫兹，显示平均行动电位持续时间 50 的 439 毫秒，以及平均行动潜在持续时间 90 的 520 毫秒。

IPS细胞衍生心肌细胞的电刺激每五次提高刺激速率，表明随着跳动率的增加，动作潜力逐渐缩短。此外，使用异丙醇（一种非选择性β肾上腺素受体激动剂）自发跳动IPS细胞衍生的心肌细胞的治疗，导致跳动率的迅速提高，随着激动剂剂量的增加，这种反应可能会进一步增加。虽然与传统的电生理测量相比，此方法可提供卓越的吞吐量，但必须了解其局限性，包括受荧光电压传感器内在动力学特性限制的时间分辨率。