Name: 利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解利用荧光波动光谱学对蛋白质同源寡聚化进行无标定体外定量的方法。该技术可在任何共聚焦显微镜上实现，仅需微量标记蛋白即可研究蛋白质相互作用，为药物筛选和癌症药物开发提供定量信息。

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本工作获得了惠康信托基金（Wellcome Trust）授予 R.N. 的资助项目 105278/Z/14/2 的支持。惠康信托人类遗传学中心由惠康信托核心资助项目 203852/Z/16/2 提供经费。C.S. 研究团队的工作得到了英国癌症研究基金会（Cancer Research UK，项目编号 C20724/A14414）以及欧洲研究理事会（European Research Council）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助项目 647278 的支持。

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化
<ol>
	<li>将含有单体化人源 FKBP12F36V12 以及 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET22b 载体（载体可应要求提供）转化至 (DE3) pLysS 感受态细胞中。将细胞涂布于添加了 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上。</li>
	<li>挑取转化后的单菌落接种于 100 mL LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养 16 - 20 小时。</li>
	<li>将浓密的预培养液（OD600 &#62;1）按 1:100 比例稀释至 LB 培养基中（共 2 × 500 mL），于 37 °C、200 rpm 条件下培养 2 - 3 小时，至 OD600 达 0.6 - 0.8。</li>
	<li>将培养物置于冰上冷却，加入 250 µM IPTG 诱导表达，并于 21 °C、200 rpm 条件下继续培养 16 - 20 小时。</li>
	<li>以 2,000 × g 离心 20 分钟收集菌体。</li>
	<li>将菌体沉淀重悬于 40 mL IMAC 缓冲液 A（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，3 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）中，同时加入无 EDTA 蛋白酶抑制剂（每份菌体沉淀加 1 片）。</li>
	<li>在冰上进行超声破碎（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，工作 9 秒，间歇 11 秒，持续 15 分钟），随后以 20,000 × g 离心收集可溶性组分。</li>
	<li>将可溶性裂解液转移至锥形瓶中，加入 2 mL 树脂（见材料表），于 105 rpm 转速下孵育 1 小时。 
	注：此步 IMAC 纯化也可使用镍琼脂糖树脂。</li>
	<li>收集树脂，先用 250 mL IMAC 缓冲液 A 洗涤，再用 500 mL IMAC 缓冲液 B（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，7 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗涤。 
	注：若使用镍琼脂糖树脂，咪唑浓度可提高至 50 mM。</li>
	<li>使用 IMAC 缓冲液 C（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，300 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗脱 His6 标签蛋白。</li>
	<li>将洗脱液上样至已用 10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM DTT 平衡好的凝胶过滤柱（见材料表）。在本实验所用色谱柱上，FKBP12F36V 的洗脱峰位于 87.71 mL 处。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 检测纯度，合并目标组分并根据需要进行浓缩。</li>
</ol>
2. 多孔板阵列的制备
<ol>
	<li>从 -80 °C 中解冻纯化的 FKBP12F36V（或目标标记蛋白）。</li>
	<li>配制含有 100 nM 纯化 FKBP12F36V 的溶液（缓冲液：10 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）。进行超声处理并离心（13,000 rpm 快速离心），以防止聚集体形成。</li>
	<li>将 100 - 200 µL 溶液移入底部为玻璃的 8 孔观察室中。</li>
	<li>加入 BB 二聚化诱导剂，使其终浓度分别为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 nM12,13。</li>
	<li>作为对照，配制仅含 100 nM mVenus 的溶液，用于评估可能的聚集和沉淀效应，并在相同的采集设置下获得单体的亮度值。</li>
</ol>
3. 无需校准的共聚焦采集
<ol>
	<li>启动共聚焦系统（图1）。任何配备数字探测器或经过良好表征的模拟探测器的共聚焦激光扫描显微镜系统8并且能够为每个采集的像素保持恒定的停留时间的设备均可使用。</li>
	<li>设置激发光束光路：
	<ol>
		<li>打开514 nm激光器，并将物镜出口处的功率设置为20 - 100 nW（适用于FKBP12F36V-mVenus）。</li>
		<li>选择63X1.4NA物镜，或专为FCS设计的带校正环的水浸物镜。</li>
		<li>打开一个 HyD、APD 或校准的 PMT 检测器。优先选择能够进行光子计数的检测器，因为在这种情况下，光子计数的计算更为准确。 S，偏移量和σ02&#160;是不必要的。</li>
		<li>选择520 - 560 nm的发射波长窗口</li>
		<li>将针孔设为对应于发射波长约545 nm的1个艾里单位。</li>
		<li>将采集模式设置为 16 × 16 像素</li>
		<li>设置像素驻留时间 t停留 使其满足 t帧 >> TD >> t停留，其中 D 是扩散蛋白的停留时间 t帧 是帧率，这相当于将驻留时间设置为约 13 µs。 
		注意：一些商业制造商的扫描仪未能保持每个像素的停留时间恒定。这种恒定性对于该方法的正常运行至关重要。</li>
		<li>将像素大小设置为约 120 nm。</li>
		<li>选择 xyt 采集模式，并选择每次采集每个孔所需的帧数（例如 5,000）。</li>
		<li>如果系统配备高通量模式，输入每个孔的坐标以及每孔采集次数，以实现流程自动化。 
		注意：若使用浸没物镜，请务必确保配备有供水装置。</li>
		<li>如果系统配备了灌注装置，加载 BB 溶液并设置灌注程序，使其在5000后立即开始th 评估二聚化动力学的同时进行采集的框架 例如， 10,000 张图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向油浸物镜中加入一滴油；若使用专为FCS设计的带校正环的水浸物镜，则加入水。</li>
	<li>将8孔观察培养皿安装到显微镜载物台上。</li>
	<li>选择正确的孔并聚焦于溶液。 
	注意：重要提示：避免在靠近底部玻璃的位置聚焦，以防止反射和散射。当需要在溶液更深处聚焦时，应断开自动聚焦选项。</li>
	<li>开始采集并将生成的图像序列以TIFF格式保存。</li>
</ol>
4. 使用 R 软件包 nandb 进行去趋势和亮度分析
<ol>
	<li>作为预处理的质量检查，使用 ImageJ14 查看图像并恢复强度分布，如图 2a 所示。这有助于判断是否发生了过度的光漂白。如果漂白过于严重，则数据不适合进一步分析。 
	注意：ImageJ 还可用于将图像从商业格式转换为 TIFF 格式。下文所述的 nandb 软件仅支持 TIFF 文件。</li>
	<li>下载并安装 R 和 RStudio15,16。建议先下载并安装 R，然后再安装 RStudio。 
	&#8203;注意：以下内容描述了如何使用 nandb R 软件包。使用 nandb 无需掌握 R 语言，但了解 R 语言会使操作更加便捷。</li>
	<li>安装 nandb 软件包。
	<ol>
		<li>打开 RStudio，在控制台中输入 install.packages(&#34;nandb&#34;) 并等待安装完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>了解 nandb
	<ol>
		<li>查阅手册17。</li>
		<li>查阅 RStudio 内置的帮助文档以了解各个函数。最常使用的函数是 brightness()。在控制台中输入 ? brightness() 即可查看该函数的帮助文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算亮度
	<ol>
		<li>假设桌面上有一个名为 img001.tif 的图像文件（注意：`nandb` 仅支持 TIFF 文件）。可以计算该图像的亮度： 
		&#8203;b &#60;- brightness(&#34;~/Desktop/img001.tif&#34;, tau = &#34;auto&#34;)
		<ol>
			<li>此命令将图像的亮度赋值给 R 中的变量 b。tau = &#34;auto&#34; 可确保在计算亮度前对图像进行正确的去趋势处理。接下来最常见的操作是计算图像的平均亮度或中位数亮度，可通过输入 mean(b) 或 median(b) 实现。也可以将亮度图像写入桌面，方法为输入： 
			ijtiff::write_tif(b, &#34;~/Desktop/whatever_img_name&#34;)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>假设桌面上有一个名为 images_folder 的文件夹，其中包含多个图像，需要计算这些图像的亮度，并将亮度图像以 TIFF 文件形式保存。此时可查看 ?brightness_folder() 的帮助文档。该函数可一次性处理整个文件夹： 
		brightness_folder(&#34;~/Desktop/images_folder&#34;, tau = &#34;auto&#34;) 
		对于偏好使用非 R 软件的用户，此功能尤为适用，因为所有文件可通过单条命令完成处理，之后即可在用户选择的软件（如 ImageJ14、Python 或其他软件）中继续处理输出的亮度 TIFF 图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
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<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
<li>RStudio: Integrated Development Environment for R. <a target="_blank" href="http://web.warwick.ac.uk/statsdept/useR-2011/abstracts/180111-allairejj.pdf">R Team</a>. , (2016).</li>
<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

N&amp;#38;B 是一种利用配备数字探测器的商用激光扫描共聚焦显微镜检测多聚化的技术。与单点 FCS、FCCS 和 smFRET 相比，该方法具有无需校准、亮度计算简单且不受浓度影响的优点6。然而，在进行亮度计算之前，必须对漂白效应和长期强度波动进行校正9；如果忽略或错误地执行去趋势化处理，漂白和其他伪影引起的微小亮度增加可能被误判为寡聚状态的变化（如 图 2a 所示）。采用自动去趋势算法可实现准确的亮度计算。
在采集图像时，遵循若干规则非常重要。首先，必须了解分子在共聚焦体积内的停留时间及其扩散系数，以便设置共聚焦系统的合适参数；标记分子的停留时间应介于像素驻留时间与帧时间之间7。选择合适的荧光染料至关重要。为了获得良好的信噪比并尽量减少光漂白，需要使用亮度高且稳定的荧光染料。激光功率应保持相对较低，以避免光漂白。每个像素1至2个光子计数已...

蛋白质-蛋白质相互作用 I体外
传统上，晶体学、核磁共振实验结合冷冻电子显微镜（cryoEM）是用于精确描述蛋白质三维结构并通过对高分辨率结构细节的分析推断其功能的主要技术。然而，蛋白质并非静态结构，其在时间和空间上可发生多种构象变化与振动。因此，晶体学或CryoEM数据提供的结构信息需要与其他技术相结合以获得更全面的理解例如， 分子动力学模拟与单分子技术：蛋白质的功能与其构象变化及相互作用相关，而这些信息无法从静态结构中获得。为了研究分子内的动力学过程，基于单分子荧光共振能量转移（smFRET）的技术非常有效1这些方法能够评估复杂介质中不同分子亚群。这一点非常重要，因为这些变化发生迅速，且出现在数据采集过程中。即， 纳秒到秒范围。
通常采用两种主要方法来检测和定量这些变化：溶液中的蛋白质和表面固定的蛋白质。对于分子间相互作用的检测，特别是配体诱导的二聚化过程，单分子FRET（smFRET）并不总是最佳工具。事实上，FRET不仅依赖于距离（约10 nm），还依赖于两个偶极子（供体和受体，χ）的取向2供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度2，但若实验者能够选择合适的FRET组合，则最后一个条件可能不那么重要。smFRET在研究同源二聚化时的一个特殊缺点源于目标蛋白的标记：对于异源smFRET，二聚化的检测上限仅为50%（即， 异源FRET仅能检测供体-受体和受体-供体的同源二聚体，而无法检测供体-供体或受体-受体二聚体（占所有二聚体的另外50%）。荧光相关光谱（FCS）及其衍生技术（FCCS， 等等。3以确定蛋白质扩散常数和结合常数 体外 是另一种替代方法。这些方法同样无法完全定量同源二聚化，因为在荧光相关光谱（FCS）中测量的是浓度和扩散，而扩散粒子的半径和扩散系数对分子量的依赖性非常弱；例如，分子量增加10倍，仅导致扩散系数改变2.15倍。4在双色FCS或FCCS的情况下，由于上述相同原因，仅能检测到50%的同源二聚体。检测同源二聚化的最实用且定量的方法 体外 和 体内 是同源荧光共振能量转移（homo-FRET）5 和数密度与亮度（N&amp;B)6. 鉴于同源FRET需要特定仪器才能恢复各向异性值（即， 光学元件/分析器（用于恢复平行和垂直偏振），N&amp;B 被呈现为一种检测蛋白质同源二聚化和聚集的有利技术。该技术既可用于 体外 和 体内 采用商业化的设备配置。
数量与亮度
最近已对N&amp;B进行了综述7。该综述主要关注该技术在活细胞中的应用。在此重现其数学形式体系是值得的，因为这些方程将被应用于体外（in vitro）收集的数据。首先，需要定义一些术语和数学量：
<ul>
	<li>实体是指一组结合在一起的分子。</li>
	<li>实体的亮度ε是指其单位时间内（每帧）发射的光子数量。</li>
	<li>n表示存在的实体数量。</li>
	<li>对于图像序列中某一像素，&lt;I&gt;为其平均强度，σ2为其强度的方差。</li>
</ul>
然后，使用光子计数探测器，并假设存在可移动实体且无背景信号，
<img alt="静态平衡方程 N=〈I〉²/σ²；数据测量中变异分析的公式。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> 
<img alt="静态平衡方程 B=σ^2/⟨I⟩=1+ε；统计分析概念。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
其中 N 为表观数量，B 为表观亮度。由此可得
<img alt="统计力学；公式，方差；方程；研究，分析，均值，涨落。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"> 
<img alt="静态平衡公式，ϵ=σ²/⟨I⟩−1，方差与均值的方程，教学参考。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4">
Dalal 等8 表明使用模拟设备时，需要三个校正项： S因子，背景 偏移量，以及 读出噪声 σ02然后，再次假设移动实体，
<img alt="光谱分析中带偏移和方差的光子计数数学公式。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5"> 
<img alt="统计方差公式的示意图；用于数据分析的数学图解。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6">
给予
<img alt="计算统计参数的公式；数学公式，用于教学。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 7"> 
<img alt="材料应变计算公式；公式 ε=(σ²−σ₀²)/(S(l)−offset)−1。" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 8">
请注意，上述公式与 Dalal et al.8 中以及后续综述7 中给出的公式有所不同。在 Dalal et al. 中，分母中的 S 因笔误被遗漏，而该错误在综述中也被重复。上述公式是正确的。关于测量 S、偏移量和 σ02 的操作说明及其含义的解释，参见 Dalal et al.8。
亮度 ε 与扩散实体的寡聚状态成正比：二聚体的 ε 值是单体的两倍，三聚体的 ε 值是单体的三倍，六聚体的 ε 值是三聚体的两倍，依此类推。因此，通过测量亮度 ε，可以定量分析各种类型的多聚化过程。
如果存在多种寡聚状态的混合物，数目与亮度分析法无法解析出其中各自独立的寡聚状态。这是该技术的一个局限性。
去趋势算法与nandb软件
校正光漂白效应的重要性此前已被反复强调9光漂白在延时模式的光学显微镜实验中不可避免，无论是在活细胞中还是 体外文献中已描述了多种方法来校正漂白效应7指数滤波技术结合去趋势参数的自动选择 T 是目前最佳选择，已集成到免费的开源软件 nandb 中9确实，要求用户手动选择去趋势参数的软件可能导致错误的结果，因为该参数的选择很可能是随意且不准确的。 自动的 算法分析数据并确定其适当参数，无需用户干预9即使选择了最优的平滑参数，去趋势处理仍存在局限性，仅在光漂白率低于25%时效果良好，这一点已通过模拟结果得到证实9有趣的是，当使用自动去趋势程序时，其精度之高足以允许使用较低的亮度值（甚至 B &lt;1.01），因此信号强度较低，但仍具有足够的精确度来定量同源二聚化。
光漂白还会引发另一个问题：多聚体复合物中存在光漂白的荧光分子。这使得 例如， 三聚体中的三个单元若有一个不具荧光性，则该三聚体会呈现为二聚体。Hur 和 Mueller10 展示了如何对此进行校正，且后续综述也强调了这一校正方法7nandb 软件包含此项校正9.
FKBP12F36V系统
FKBP12F36V 是一种在自然界中不会发生寡聚化的蛋白质，但已知在加入 AP20187 药物（俗称 BB 二聚化配体）后会发生二聚化11,12。这使其成为进行数目与亮度分析的理想测试对象：在标记 FKBP12F36V 的情况下，加入 BB 后应观察到其寡聚状态加倍。

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) pLysS 细胞</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329824407</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB 起始培养物</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>QIAGEN</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC 缓冲液</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON 树脂</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镍琼脂糖凝胶</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃底 8 孔观察培养皿</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

数目与亮度是一种无需校准的荧光涨落光谱（FFS）技术，用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可利用配备数字探测器的传统共聚焦显微镜进行。本文通过一个应用实例展示了该技术在体外使用的实验方案，该实例中，通过加入二聚化药物AP20187前后，数目与亮度方法能够准确量化mVenus标记的FKBP12F36V蛋白的寡聚状态。文中讨论了正确选择显微镜采集参数以及正确的数据预处理和分析方法的重要性，尤其强调了光漂白校正方法选择的关键性。这一低成本方法可用于在多种生物学背景下研究蛋白质-蛋白质相互作用。

去趋势与单体亮度
数据采集完成后，即可开始进行亮度计算，以确定目标蛋白在溶液中的寡聚状态。尽管溶液中光漂白的影响可能不如在其他情况下显著 体内强度轨迹可能仍不具有平稳均值，这可能是由于与荧光团相关的光物理效应所致。18 但其背后的原因尚未完全明确。这在计算亮度时会产生影响；而在确定单体-二聚体转变时，这一因素尤为关键。通过对所示数据应用自动去趋势算法 图2a在加入BB之前，未进行去趋势处理时，强度轨迹已得到适当校正，从而提供了溶液中FKBP12F36V-mVenus亮度的更准确数值。 B = 1.026，而去趋势后， B = 1.005 (图2b</s...

本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外 基于商用光扫描显微镜的荧光涨落光谱技术。展示了正确的数据采集设置和分析方法。

数量与亮度分析是一种无需校准的荧光涨落光谱（FFS）技术，用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可……

该方法有助于解答药物筛选领域中的关键问题，例如阐明小分子抑制剂在极低浓度下对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。该技术的主要优势在于无需校准，可在任何共聚焦显微镜上实施，并且仅需使用极少量的标记蛋白。该技术的应用前景涵盖抗癌药物、小分子抑制剂以及多种融合抑制剂的研发，因为它能够提供有关蛋白质-蛋白质相互作用的定量信息。尽管该方法可用于研究蛋白质在体外的相互作用和聚集行为，也可应用于其他系统，例如活细胞中蛋白质动态变化以及细胞间相互作用。首先，将含有单体化人源FKBP12以及N端His6和mVenus标签的pET-22b质粒转化至pLysS细胞中。细胞经孵育和热激后恢复生长，随后将其涂布于添加抗生素的LB琼脂平板上。将转化后的菌落转移至100毫升LB起始培养基中，在37摄氏度下振荡培养16至20小时。孵育后，将浓密的起始培养物按1:100的比例稀释至LB培养基中，分装为两份500毫升的批次。然后继续培养2至3小时，直至在600纳米处的光密度达到0.6至0.8。将培养物在冰上冷却后，加入250 µmol/L的IPTG诱导蛋白表达。在21 °C、200 rpm条件下继续培养16至20小时。随后，以2,000 ×g离心20分钟收集细胞。弃去上清液，将沉淀重悬于40毫升IMAC缓冲液A中，缓冲液需添加无EDTA蛋白酶抑制剂。随后，在冰上以500瓦、20千赫兹、40%振幅进行超声处理，工作9秒，间歇11秒，总时长15分钟。超声处理后，在4摄氏度下以20,000 g离心1小时，收集可溶性组分。将可溶性裂解液转移至锥形瓶中，加入两毫升TALON树脂。将悬浮液在105 rpm转速下孵育一小时。随后收集树脂，先用250毫升IMAC缓冲液A洗涤，再用500毫升IMAC缓冲液B洗涤。使用IMAC缓冲液C洗脱His6标签蛋白。将洗脱液上样至预先平衡的尺寸排阻色谱柱，收集在约87.7毫升处洗脱的FKBP12峰。通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度，并根据需要合并和浓缩。为制备多孔板阵列，首先在与尺寸排阻色谱所用相同的缓冲液中配制100纳米摩尔浓度的纯化FKBP12溶液。超声处理后，以13,000 rpm短暂离心，以防止形成聚集体。现在，将100至200微升稀释后的蛋白质溶液加入底部为玻璃的八孔观察室中。加入BB二聚化诱导剂，使其终浓度分别为10、20、40、80、100、150、300和500纳摩尔。作为对照，配制仅含100纳摩尔mVenus的溶液，用于评估潜在的聚集和沉淀效应，并在相同的成像条件下获取单体的亮度值。任何配备数字探测器或特性明确的模拟探测器、并能够对所获取的每个像素保持恒定停留时间的共聚焦激光扫描显微镜系统均可使用。选择专为荧光相关光谱设计的带校正环的水浸物镜。现在，向该带校正环的水浸物镜上滴加一滴水。将八孔观察室安装到载物台上。通过开启514纳米激光器，并将其在物镜出口处的功率设置为20至100纳瓦，来设定激发光路。开启一个HyD探测器。优先选择能够进行光子计数的探测器。发射波长窗口选择 520 至 560 纳米。采集模式采用 16 × 16 像素。设置像素驻留时间，使得帧时间长于蛋白质扩散时间，而像素驻留时间远短于帧时间。在本演示所用系统中，这相当于将驻留时间设置为约13微秒。针对约545纳米的相应发射波长，将针孔设为一个艾里单位。选择xy时间序列采集模式，并设置每次采集每个孔所需的采集帧数。现在，将像素大小设置为约120纳米。如果系统配备高通量模式，输入每个孔的坐标以及每个孔的采集次数，以实现过程自动化。如果系统配备了灌注装置，加载 BB 溶液并设置灌注程序，在第 5,000 帧后立即开始灌注，以在采集 10,000 张图像的同时评估二聚化动力学。选择正确的孔位，聚焦于溶液，然后开始采集，并将获得的图像序列以 TIFF 格式保存。按照方案部分所述，获取了20,000张纯化的FKBP12 mVenus在100纳米溶液中的图像序列。显示了第一帧的强度以及去趋势化图像的平均强度分布。同时展示了未平滑滤波和平滑滤波后的亮度。采集 10,000 帧后，在继续采集的同时向溶液中加入同源二聚体药物 BB。每连续 5,000 帧进行一次分析。加入 BB 后五分钟的平均亮度为 1.010，增加了两倍，表明形成了 FKBP12 二聚体。该过程的动力学显示，BB 添加与 FKBP12 完全二聚化之间存在约两分钟的延迟。在体外评估蛋白质-蛋白质相互作用的一个关键方面是标记蛋白的制备与纯化。请确保您已获得少量目标标记蛋白，并且根据您的分析结果，蛋白未发生聚集。完成此操作后，还可采用其他方法（如表面等离子共振或荧光相关光谱）来回答更多问题，例如解离常数或扩散系数。该技术发展之后，为生物物理学领域的研究人员深入探究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用开辟了道路。请注意，进行蛋白质纯化所用的试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如佩戴护目镜和手套。

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科研

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Biochemistry

生物化学

利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

本视频展示了利用微图案化表面进行蛋白质-蛋白质相互作用实验及后续分析的方法。该方法能够在活细胞中检测蛋白质相互作用，兼具高通量能力与获取定量信息的优势。...

体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

本文报道了在人类细胞中检测内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的实验方案，并通过间接免疫荧光染色方法（采用固定剂如多聚甲醛、丙酮或甲醇进行固定）对这些蛋白在着丝粒-动粒上的水平进行定量分析。...

内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。...

利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&amp;B）分析。...

结合全内反射荧光显微镜与数目和亮度分析法研究活细胞中细胞表面受体的寡聚化动态

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

本文描述了靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）诱导形成三元复合物的生物物理表征方案，其中涉及泛素连接酶Von Hippel-Lindau E3连接酶（VHL）和Cereblon（CRBN）。本文所展示的生物物理方法包括表面等离子共振（SPR）、生物膜干涉技术（BLI）以及等温滴定...

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）诱导三元复合物形成的生物物理检测方法的开发与应用

本方案将质谱光度法与一种新型微流控系统相结合，用于研究低亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法基于对溶液中高浓度复合物的快速稀释，从而实现对低亲和力的测量，并拓展了质谱光度法的应用范围。...

通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

了解利用荧光波动光谱学对蛋白质同源寡聚化进行无标定体外定量的方法。该技术可在任何共聚焦显微镜上实现，仅需微量标记蛋白即可研究蛋白质相互作用，为药物筛选和癌症药物开发提供定量信息。

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