Calibration-free <em>In Vitro</em> Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Rory Nolan; Luis A. Alvarez; Samuel C. Griffiths; Jonathan Elegheert; Christian Siebold; Sergi Padilla-Parra

doi:10.3791/58157

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biochemistry

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

Full Text

7,769 Views

08:22 min

July 17, 2018

DOI: 10.3791/58157-v

Rory Nolan¹, Luis A. Alvarez¹, Samuel C. Griffiths², Jonathan Elegheert², Christian Siebold², Sergi Padilla-Parra^1,2,3,4

¹Cellular Imaging Group, Wellcome Centre Human Genetics,University of Oxford, ²Division of Structural Biology, Wellcome Centre Human Genetics,University of Oxford, ³Dynamic Structural Virology Group,Biocruces Health Research Centre, ⁴IKERBASQUE,Basque Foundation for Science

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

本协议描述了一种无标定的方法, 用于在荧光涨落光谱的基础上, 利用商用光扫描显微镜定量测定蛋白质的体外齐聚。给出了正确的采集设置和分析方法。

该方法可以帮助回答药物筛选领域的关键问题，例如阐明小分子抑制剂对极低浓度蛋白质-蛋白质相互作用的影响。该技术的主要优点是无需校准，可以在任何共聚焦显微镜中实现，并且使用非常少量的标记蛋白质。该技术的意义延伸到癌症药物、小分子抑制剂和各种融合抑制剂的开发，因为它提供了有关蛋白质-蛋白质相互作用的定量信息。

虽然这种方法可以深入了解体外蛋白质相互作用和聚集，但它也可以应用于其他系统，例如活细胞蛋白质动力学和细胞间相互作用。首先，用含有单体化人 FKBP12 和 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET-22b 载体转化 pLysS 细胞。细胞从孵育和热休克中恢复后，将它们接种到补充有抗生素的 LB 琼脂上。

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos