无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

该方法有助于解答药物筛选领域中的关键问题，例如阐明小分子抑制剂在极低浓度下对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。该技术的主要优势在于无需校准，可在任何共聚焦显微镜上实施，并且仅需使用极少量的标记蛋白。该技术的应用前景涵盖抗癌药物、小分子抑制剂以及多种融合抑制剂的研发，因为它能够提供有关蛋白质-蛋白质相互作用的定量信息。

尽管该方法可用于研究蛋白质在体外的相互作用和聚集行为，也可应用于其他系统，例如活细胞中蛋白质动态变化以及细胞间相互作用。首先，将含有单体化人源FKBP12以及N端His6和mVenus标签的pET-22b质粒转化至pLysS细胞中。细胞经孵育和热激后恢复生长，随后将其涂布于添加抗生素的LB琼脂平板上。

将转化后的菌落转移至100毫升LB起始培养基中，在37摄氏度下振荡培养16至20小时。孵育后，将浓密的起始培养物按1:100的比例稀释至LB培养基中，分装为两份500毫升的批次。然后继续培养2至3小时，直至在600纳米处的光密度达到0.6至0.8。

将培养物在冰上冷却后，加入250 µmol/L的IPTG诱导蛋白表达。在21 °C、200 rpm条件下继续培养16至20小时。随后，以2,000 ×g离心20分钟收集细胞。

弃去上清液，将沉淀重悬于40毫升IMAC缓冲液A中，缓冲液需添加无EDTA蛋白酶抑制剂。随后，在冰上以500瓦、20千赫兹、40%振幅进行超声处理，工作9秒，间歇11秒，总时长15分钟。超声处理后，在4摄氏度下以20,000 g离心1小时，收集可溶性组分。

将可溶性裂解液转移至锥形瓶中，加入两毫升TALON树脂。将悬浮液在105 rpm转速下孵育一小时。随后收集树脂，先用250毫升IMAC缓冲液A洗涤，再用500毫升IMAC缓冲液B洗涤。使用IMAC缓冲液C洗脱His6标签蛋白。将洗脱液上样至预先平衡的尺寸排阻色谱柱，收集在约87.7毫升处洗脱的FKBP12峰。

通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度，并根据需要合并和浓缩。为制备多孔板阵列，首先在与尺寸排阻色谱所用相同的缓冲液中配制100纳米摩尔浓度的纯化FKBP12溶液。超声处理后，以13,000 rpm短暂离心，以防止形成聚集体。

现在，将100至200微升稀释后的蛋白质溶液加入底部为玻璃的八孔观察室中。加入BB二聚化诱导剂，使其终浓度分别为10、20、40、80、100、150、300和500纳摩尔。作为对照，配制仅含100纳摩尔mVenus的溶液，用于评估潜在的聚集和沉淀效应，并在相同的成像条件下获取单体的亮度值。

任何配备数字探测器或特性明确的模拟探测器、并能够对所获取的每个像素保持恒定停留时间的共聚焦激光扫描显微镜系统均可使用。选择专为荧光相关光谱设计的带校正环的水浸物镜。现在，向该带校正环的水浸物镜上滴加一滴水。

将八孔观察室安装到载物台上。通过开启514纳米激光器，并将其在物镜出口处的功率设置为20至100纳瓦，来设定激发光路。开启一个HyD探测器。

优先选择能够进行光子计数的探测器。发射波长窗口选择 520 至 560 纳米。采集模式采用 16 × 16 像素。

设置像素驻留时间，使得帧时间长于蛋白质扩散时间，而像素驻留时间远短于帧时间。在本演示所用系统中，这相当于将驻留时间设置为约13微秒。针对约545纳米的相应发射波长，将针孔设为一个艾里单位。

选择xy时间序列采集模式，并设置每次采集每个孔所需的采集帧数。现在，将像素大小设置为约120纳米。如果系统配备高通量模式，输入每个孔的坐标以及每个孔的采集次数，以实现过程自动化。

如果系统配备了灌注装置，加载 BB 溶液并设置灌注程序，在第 5,000 帧后立即开始灌注，以在采集 10,000 张图像的同时评估二聚化动力学。选择正确的孔位，聚焦于溶液，然后开始采集，并将获得的图像序列以 TIFF 格式保存。

按照方案部分所述，获取了20,000张纯化的FKBP12 mVenus在100纳米溶液中的图像序列。显示了第一帧的强度以及去趋势化图像的平均强度分布。同时展示了未平滑滤波和平滑滤波后的亮度。

采集 10,000 帧后，在继续采集的同时向溶液中加入同源二聚体药物 BB。每连续 5,000 帧进行一次分析。加入 BB 后五分钟的平均亮度为 1.010，增加了两倍，表明形成了 FKBP12 二聚体。

该过程的动力学显示，BB 添加与 FKBP12 完全二聚化之间存在约两分钟的延迟。在体外评估蛋白质-蛋白质相互作用的一个关键方面是标记蛋白的制备与纯化。请确保您已获得少量目标标记蛋白，并且根据您的分析结果，蛋白未发生聚集。

完成此操作后，还可采用其他方法（如表面等离子共振或荧光相关光谱）来回答更多问题，例如解离常数或扩散系数。该技术发展之后，为生物物理学领域的研究人员深入探究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用开辟了道路。请注意，进行蛋白质纯化所用的试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如佩戴护目镜和手套。