利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

该方法可以帮助回答药物筛选领域的关键问题，例如阐明小分子抑制剂对极低浓度蛋白质-蛋白质相互作用的影响。该技术的主要优点是无需校准，可以在任何共聚焦显微镜中实现，并且使用非常少量的标记蛋白质。该技术的意义延伸到癌症药物、小分子抑制剂和各种融合抑制剂的开发，因为它提供了有关蛋白质-蛋白质相互作用的定量信息。

虽然这种方法可以深入了解体外蛋白质相互作用和聚集，但它也可以应用于其他系统，例如活细胞蛋白质动力学和细胞间相互作用。首先，用含有单体化人 FKBP12 和 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET-22b 载体转化 pLysS 细胞。细胞从孵育和热休克中恢复后，将它们接种到补充有抗生素的 LB 琼脂上。

将转化的菌落转移到 100 mL LB 起始培养物中，并在 37 摄氏度下摇动生长 16 至 20 小时。孵育后，在 LB 培养基中将致密的发酵剂培养物分两个 500 毫升批次稀释 1 至 100。然后，生长 2 到 3 小时，达到 600 纳米的光密度为 0.6 至 0.8。

在冰上冷却培养物后，用 250 微摩尔 IPTG 诱导蛋白质生产。在 21 摄氏度和 200 rpm 的温度下培养培养物 16 至 20 小时。然后，以 2， 000 g 离心 20 分钟收获细胞。

去除上清液，将沉淀重悬于 40 毫升补充有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂的 IMAC 缓冲液 A 中。现在，在 500 瓦、20 kHz 和 40% 振幅下对细胞进行超声处理，在冰上开 9 秒，关 11 秒，持续 15 分钟。超声处理后，在 4 摄氏度下以 20， 000 g 离心一小时，收获可溶性材料。

将可溶性裂解物转移至锥形瓶中，并加入 2 mL TALON 填料。让悬浮液以 105 rpm 旋转孵育 1 小时。现在，收获树脂，用 250 毫升 IMAC 缓冲液 A 洗涤，然后用 500 毫升 IMAC 缓冲液 B.使用 IMAC 缓冲液 C 洗脱 His 6 标签的蛋白质，将洗脱液注入预平衡的体积排阻柱上，并收集 FKBP12 峰，洗脱量约为 87.7 毫升。

通过 SDS-PAGE 评估蛋白质的纯度，并根据需要混合和浓缩。要设置多孔板阵列，首先在用于尺寸排阻色谱的相同缓冲液中制备 100 纳摩尔纯化的 FKBP12 溶液。以 13， 000 rpm 的快速离心进行超声处理和离心，以防止形成聚集体。

现在，将 100 至 200 微升稀释的蛋白质移液到带有玻璃底的 8 孔观察室中。添加 BB 二聚体至终浓度为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 纳摩尔。作为参考，制备单独的 100 纳摩尔 mVenus 溶液，以评估潜在的聚集和沉淀效应，并在相同的采集设置下恢复单体的亮度值。

可以使用任何配备数字探测器或特性明确的模拟探测器的光学扫描显微镜共聚焦系统，并且能够为采集的每个像素保持恒定的停留时间。选择专为荧光相关光谱设计的环校正水浸物镜。现在，向 Collar 校正水浸物镜中加入一滴水。

将 8 孔观察室安装到载物台中。通过打开 514 纳米激光器并在物镜出口处将其设置为 20 至 100 纳瓦的功率来设置激发光束路径。打开一个 HyD 探测器。

能够进行光子计数的探测器是首选。选择从 520 到 560 纳米的发射窗口。对于采集模式，请使用 16 x 16 像素。

设置像素停留时间，使帧时间长于蛋白质扩散，像素停留时间短得多。这相当于将本演示中使用的系统的驻留时间设置为大约 13 微秒。将针孔设置在一个 Airy 单位上，相应的发射波长约为 545 纳米。

选择 xy 时间采集模式，然后选择每次采集和井要采集的帧数。现在，将像素大小设置为大约 120 纳米。如果系统配备了高通量模式，请引入每个孔的坐标和每个孔的采集次数以自动化该过程。

如果系统配备了灌注系统，则加载 BB 溶液并编程灌注，使其在第 5， 000 帧之后立即开始，以评估二聚化动力学，同时获取 10， 000 张图像。选择正确的井，并专注于解决方案。然后，开始采集，并以 TIFF 格式保存生成的图像堆栈。

按照方案部分的规定，在 100 纳米溶液中采集 20， 000 张纯化的 FKBP12 mVenus 图像序列。第一帧的强度与去除趋势的图像的平均强度分布一起显示。此外，还会显示无平滑过滤和平滑过滤的亮度。

采集 10， 000 帧后，在采集的同时将同型二聚体药物 BB 添加到溶液中。分析了每个连续的 5， 000 帧系列。添加 BB 后 5 分钟的平均亮度为 1.010，增加了两倍，表明 FKBP12 二聚体。

该过程的动力学显示 BB 添加和 FKBP12 完全二聚化之间的延迟约为 2 分钟。在体外评估蛋白质-蛋白质相互作用的一个关键方面是标记蛋白质的生产和纯化。确保您有少量标记的目标蛋白质，并且您的蛋白质在分析中没有聚集。

按照此程序，可以执行其他方法，如表面等离子体共振或荧光相关光谱，以回答其他问题，如解离常数或扩散系数。开发后，这项技术为生物物理学领域的研究人员详细探索活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用铺平了道路。不要忘记，使用试剂进行蛋白质纯化可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如安全眼镜、手套。