恒定压力下肺固定用于评估小鼠肺气肿

固定装置内的恒定压力使肺组织保持在适度膨胀的状态，从而生成适合评估轻度香烟烟雾诱导肺气肿的组织学肺标本。该模型的主要优势在于，可在相同恒定压力下同时固定多个肺组织，且不会发生肺塌陷或萎陷。本实验操作将由我实验室的研究生 Naoko Arano 演示。

确认小鼠对反射运动无反应后，沿小鼠中线在皮肤和肌肉组织上做切口，方向朝向头部，并横向剪开以扩大操作空间。暴露膈肌层后，用镊子刺穿组织，打开胸腔。剪开胸骨区域，以便观察肺和心脏。

然后剪开左心房和右心室。将连接至灌注泵的24号套管插入右心室区域，并将套管朝向头部方向推进，直至进入肺动脉。随后打开泵，用约200毫升的PBS灌注组织，持续约一小时，直至肺组织完全变为白色。

灌注结束后，剪断气管、肺和心脏周围的结缔组织，并用缝线结扎右侧主支气管。随后，分离右侧肺的所有肺叶，并将心脏和左侧肺的各个肺叶分别放入含有适当固定液的 10 毫升注射器中。回抽注射器活塞，在注射器内形成负压以使肺组织充气膨胀，然后将肺组织从注射器中取出。

将20号套管插入气管，并使用缝线固定套管位置。将装有固定液的1毫升注射器连接至套管，向肺内注入额外固定液以检查是否存在泄漏。务必确保插入部位已牢固固定，以防止肺组织标本在固定过程中从肺固定板上脱落。

然后将组织转移至肺固定压力装置，在固定结束时取出样本，并用结扎线结扎气管末端。肺固定压力装置的下部组件用于插入肺组织样本，该部分通过20号套管与三通旋塞连接至福尔马林液流末端。压力由固定液在上下两个腔室之间的不同液面高度差产生。

压力差为25厘米水柱，但可通过高度调节旋钮将压力调节至25至30厘米水柱之间。泵连接下部和上部容器，保持固定剂液面高度之间25厘米的差异，并引导试剂的流动。在固定48小时后，暴露于环境空气中的SMP30基因敲除小鼠的肺未表现出明显的气道扩张。

然而，在暴露于慢性香烟烟雾的SMP30基因敲除小鼠中，观察到明显的肺泡腔扩大和肺泡壁破坏。此外，与暴露于空气的小鼠相比，暴露于烟雾的SMP30基因敲除小鼠肺组织样本的平均线性截距和破坏指数显著升高。本实验室使用10%甲醛进行固定，但研究人员可根据实验需求选用其他固定剂。

正如我们所报道的，使用上述固定系统，可以从多种小鼠肺气肿模型中获取肺组织样本，用于形态计量学评估。由于固定剂可能具有危险性，务必穿戴适当的个人防护装备，并在通风良好的房间内操作。